JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Оборонительные поведенческие реакции зависят от интенсивности угрозы, близости и контекста воздействия. Основываясь на этих факторах, мы разработали классическую парадигму кондиционирования, которая вызывает четкие переходы между условным замораживанием и поведением полета в отдельных субъектах. Эта модель имеет решающее значение для понимания патологий, связанных с тревогой, паникой и посттравматическими стрессовыми расстройствами.

Аннотация

Поведение, связанное со страхом и тревогой, в значительной степени способствует выживанию организма. Тем не менее, преувеличенные оборонительные ответы на предполагаемую угрозу характерны для различных тревожных расстройств, которые являются наиболее распространенной формой психических заболеваний в Соединенных Штатах. Открытие нейробиологических механизмов, ответственных за оборонительное поведение, поможет в разработке новых терапевтических вмешательств. Павловский страх кондиционирования является широко используемой лабораторной парадигмы для изучения страха, связанных с обучением и памятью. Основным ограничением традиционных парадигм кондиционирования страха Павлова является то, что замораживание является единственным оборонительным поведением, контролируемым. Недавно мы разработали модифицированную парадигму кондиционирования страха Павлова, которая позволяет нам изучать как обусловленное замораживание, так и поведение полета (также известного как побег) в отдельных субъектах. Эта модель использует более высокую интенсивность footshocks и большее количество пар между условным стимулом и безусловным стимулом. Кроме того, эта обусловленная парадигма полета использует серийную презентацию чистого тона и белого шума слуховых стимулов в качестве обусловленного стимула. После кондиционирования в этой парадигме, мыши проявляют замораживание поведение в ответ на тон стимула, и полет ответы во время белого шума. Эта модель кондиционирования может быть применена к изучению быстрых и гибких переходов между поведенческими реакциями, необходимыми для выживания.

Введение

Страх эволюционно сохраняется адаптивной реакции на непосредственную угрозу1,2. В то время как организмы обладают врожденными оборонительными ответами на угрозу, выученные ассоциации имеют решающее значение для получения соответствующих защитных ответных мер на стимулы, предсказываяопасность 3. Дисрегуляция в мозговых цепях, контролирующих защитные реакции, скорее всего, будет способствовать неадаптивным реакциям, связанным с множественными изнурительными тревожными расстройствами, такими как посттравматическое стрессовое расстройство(ПТСР), паническоерасстройство 4 и специфическиефобии 5,6. Распространенность в Соединенных Штатах для тревожных расстройств составляет 19,1% для взрослых и 31,9%у подростков 7,8. Бремя этих болезней чрезвычайно высоко влияет на повседневную жизнь людей и негативно сказывается на их качестве жизни.

За последние несколько десятилетий, Павловский страх кондиционирования служил в качестве мощной модели системы, чтобы получить огромное представление о нейронных механизмов, лежащих в основе страха,связанных с обучением и памятью 9,10,11. Павловский страх кондиционирования влечет за собой сопряжение условный стимул (CS, такие как слуховой стимул) с обратным безусловным стимулом (США; например, электрический footshock)12. Поскольку замораживание является доминирующим поведением, вызываемым и измеряемым в стандартных парадигмах кондиционирования Павлова, нейронные механизмы управления активными формами оборонительного поведения, такими как ответы на побег/полет, остаются в значительной степени неисследованными. Предыдущие исследования показывают, что различные формы оборонительного поведения, такие как полет, вызываются в зависимости от интенсивности угрозы,близости и контекста 13,14. Изучение того, как мозг контролирует различные типы оборонительного поведения может значительно способствовать пониманию нейронных процессов, которые дисрегулируются в страхе и тревожных расстройств.

Для решения этой критической необходимости, мы разработали модифицированную парадигму кондиционирования Павлова, которая вызывает полет и побег прыжки, в дополнение кзамораживанию 15. В этой парадигме, мыши обусловлены серийным стимулом соединения (SCS), состоящий из чистого тона следуют белый шум. После двух дней сопряжения SCS с сильным электрическим footshock, мыши проявляют замораживание в ответ на тон компонента и полета во время белого шума. Поведенческие переключатели между условным замораживанием и поведением полета являются быстрыми и последовательными. Интересно, что мыши демонстрируют поведение полета только тогда, когда белый шум CS представлен в том же контексте, что и ранее поставленный footshock (контекст кондиционирования), но не в нейтральном контексте. Вместо этого, замораживание ответы доминируют в этом нейтральном контексте, со значительно более высокими уровнями замораживания в ответ на белый шум по сравнению с тоном. Это согласуется с ролью контекста в модулирование интенсивности оборонительных ответных мер и с регулятивной ролью контекстуальной информации в обучении, связанном со страхом, и памяти, найденной в традиционныхпарадигмах кондиционирования угроз 16,17. Эта модель позволяет проводить прямые, внутри предмета сравнения нескольких оборонительных поведения в контексте конкретных образом.

протокол

Следующие шаги/процедуры были проведены в соответствии с институциональными руководящими принципами после одобрения Комитетом по уходу и использованию животных Тулейского университета.

1. Подготовка мышей

  1. Используйте взрослых мышей мужского и/или женского пола в возрасте от 3 до 5 месяцев. В настоящем исследовании, мы использовали мужчин C57BL/6J мышей, полученных из лаборатории Джексона, но любой штамм мыши от авторитетного поставщика могут быть использованы.
  2. По крайней мере, за неделю до эксперимента, дом всех мышей индивидуально на 12:12 ч света / темного цикла на протяжении всего исследования. Предоставьте мышам доступ к пище и воде.
  3. Выполните все поведенческие эксперименты во время светового цикла. Выполняем все сеансы в одно и то же время суток в пределах отдельной когорты. Например, если эксперимент начинается в 9 утра в день 1, продолжайте начинать с этого времени до завершения эксперимента.

2. Подготовка учебных материалов

  1. Контексты изучения
    1. Выберите два различных контекста для выполнения экспериментов.
    2. Используйте цилиндрическую камеру, состоящую из чистых плексигласов (диаметр 30 см) в качестве контекста А, с гладким полом плексигласа. Высота камеры должна быть достаточной для предотвращения побега (не менее 30 см в высоту).
    3. Для Context B используйте прямоугольный корпус (25 см х 30 см) с электрическим сетчатым полом, используемым для доставки чередующихся текущих подножок. Высота этой камеры очень важна и должна быть не менее 35 см. Кроме того, используйте прозрачную крышу (убедитесь, что видео может быть записано через этот материал).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте камеру с гладкими поверхностями стены, которые могут быть легко очищены.
    4. Используйте другое решение очистки для очистки контекстов. Например, чистый контекст А с 1% уксусной кислотой и контекстом В с 70% этанола. Очистите контексты перед началом первой сессии, между тестированием отдельных мышей и после завершения дневных сессий. Это жизненно важно, чтобы удалить обонятельные сигналы от предыдущих мышей. Тщательная очистка также поможет предотвратить масштабирование мочи на ударной сетке, что поставит под угрозу сеансы кондиционирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чистящие решения также служат обонятельным сигналом, поэтому используйте ту же чистящую жидкость для определенного контекста.
    5. Поместите контекст A или context B в звукоуядную коробку во время соответствующих учебных сессий.
  2. Аудиогенератор
    1. Намонтировать верхний динамик над контекстами, чтобы доставить слуховые стимулы на 75 дБ.
    2. Используйте программируемый аудиогенератор для генерации слуховых стимулов по заранее определенному графику. Чистый тон 7,5 кГц – это звук с синуситной волновой формой, в то время как белый шум является случайным сигналом, с одинаковой интенсивностью на разных частотах, от 1 до 20 000 Гц.
    3. Используйте импульсы TTL для доставки слуховых стимулов и ударных сигналов с временной точностью.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Прежде чем начать эксперименты, измерить интенсивность звука выход из установленного динамика в каждой камере с помощью dB метра.
  3. Shocker: Соедините шокер с полом электрической сети, который используется для доставки 0,9 мА ac шок. Определите частоту, начало и продолжительность потрясений в компьютерной программе. Доставка каждого ударного стимула в конце каждого SCS в течение 1 с, в общей сложности пять SCS-шок пар за кондиционирования сессии.

3. Подготовка компьютерной программы и видео слежения

  1. Создание поведенческих протоколов с использованием кодирования в программном обеспечении.
  2. В программе определяют серийный составной стимул SCS. Этот стимул представляет 10 с чистым тоном (каждый пипс представлен на 500 мс, с частотой 7,5 кГц и скоростью 1 Гц) и 10 с белым шумом (500 мс пипсов на 1 Гц).
  3. Определите межпроблемные интервалы (ITI), представленные после каждого испытания, псевдорандомно.
  4. Во время исследования завехать все поведение мыши на видео для последующего анализа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Коммерчески доступные коробки кондиционирования страха не могут быть настроены для записи поведения через верхнюю установленную камеру. Это очень важно, так как записанное видео используется для расчета горизонтального движения, скорости и общего расстояния, пройденного животным.
  5. Для настройки отслеживания программного обеспечения поместите тестовую мышь в каждом соответствующем контексте, отрегулируйте чувствительность отслеживания контура и определите центр тяжести. Это обеспечит получение достоверных данных об относительной позиции. Кроме того, определите всю область контекста, доступную для субъекта.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Корректировка размера контура для обоих контекстов имеет важное значение, поскольку изменение яркости в различных контекстах изменит размер контура.
  6. Определите коэффициент калибровки с использованием известных размеров камер и размеров пикселей камеры, которые могут быть использованы для расчета скорости (см/с).
  7. Синхронизировать события timestamp компьютера получения данных с их событиями в режиме реального времени.

4. Поведенческий эксперимент

  1. Включите все оборудование: компьютеры, контроллер коробки кондиционирования страха, шокер, а также программное обеспечение для записи видео и таймштамп. Убедитесь, что инструменты включены в соответствующем порядке.
  2. Проверьте все функции, включая тон, белый шум и ударную доставку, и найте систему для сбора данных.
  3. Транспорт животных из их кладовой в комнату кондиционирования. Дайте им акклиматизироваться там не менее 10 минут.
  4. Вывите животное из домашней клетки, аккуратно поместите его в соответствующий контекст, а затем немедленно активируйте компьютерные программы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инициализация как системы кондиционирования страха, так и сбора данных (таймтамипс, отслеживание мыши и видеозапись) одновременно может быть синхронизирована с помощью Опосредованного активации импульса TTL.
  5. Предварительное кондиционирование/предварительная экспозиция
    1. На 1-й день поместите тему в контекст А (нейтральный контекст). Разрешить ему акклиматизироваться к камере в течение 3 мин (базовый период), а затем подвергать его 4 испытания SCS общей продолжительности 20 с(рисунок 1A-1B).
    2. Поддержание среднего псевдорандома ITI 90 с (диапазон 80-100 с). Общая продолжительность каждого сеанса предварительной экспозиции составляет 590 с.
  6. Страх кондиционирования
    1. На 2-й день и 3-й день поместите тему в контекст B. После 3 мин базовый период, подвергать предмету пять пар SCS совместного прекращения с 1 с, 0,9 мА AC footshock.
    2. Поддержание среднего псевдорандома ITI 120 с (диапазон 90-150 с). У каждого сеанса кондиционирования длятся 820 с в общей сложности (Рисунок 1A).
    3. В зависимости от цели эксперимента, субъект мышей на 4-й день либо отозвать тест (см. шаг 4.7) или опасаться вымирания (см. шаг 4.8).
  7. Отзыв страха (для проверки зависимости от контекста)
    1. На 4-й день поместите тему в контекст А. После 3 мин базового периода, представить его с 4 испытаний SCS без footshock, более 590 с.
    2. Поддержание среднего псевдорандома ITI 90 с (диапазон 80-100 с).
  8. Страх вымирания
    1. На 4-й день поместите тему в контекст В. После 3 мин базовый период, настоящее 16 испытаний SCS без footshock, более 1910 с.
    2. Поддержание среднего псевдорандома ITI 90 с (диапазон 60-120 с).
  9. Верните животное в свою домашнюю клетку и повторите процедуру для всех животных.

5. Количественная оценка поведения

  1. У наблюдателя, слепого к эксперименту, забьйте записанные видео для замораживания поведения с помощью автоматического детектора замораживания, за которым последует анализ изменений пикселей по кадрам.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Другие пакеты программного обеспечения также могут быть использованы для расчета замораживания автоматически с помощью 2 камеры системы. Кроме того, наблюдатель может вручную забивать поведение замораживания.
  2. Определить замораживание как полное прекращение телесных движений, за исключением тех, которые необходимы для дыхания, как минимум для 1 с.
  3. Оценка прыгает, когда все 4 лапы покидают пол, в результате чего вертикальное и/ или горизонтальное движение.
  4. Экспорт отмеченного файла с замораживанием, прыжком и маркерами событий.
  5. Извлекайте соответствующие события (замораживание и прыжки) из определенных периодов времени (например, 10 с продолжительностью предварительного SCS, тон и белый шум, для каждого испытания).
  6. Используя извлеченные длительности начала остановки событий в файле электронной таблицы, вычислите продолжительность замораживания (в ы) путем вычитания времени начала с конца времени, из соответствующих пробных периодов.
  7. Представлять эти данные пробной мудрый или день-мудрый, подводя итоги замораживания продолжительности всех испытаний.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от цели исследования, полет или замораживание поведения могут быть забиты и рассчитаны из любого судебного разбирательства / продолжительность исследования сессии.
  8. Сумма общее количество прыжков от определенной продолжительности судебного разбирательства.
  9. Извлекайте файл, генерируемый координатами отслеживания мыши из кадра за кадром X-Y оси движения центра тяжести мыши и рассчитать скорость мыши (см/с).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Данные о скорости могут присутствовать либо в формате см/с, либо в формате пиксель/с. Преобразование блока пикселей/с до см/с с использованием значения дюйма или см/пикселя, определенного в видео для этого контекста тестирования (пожалуйста, см. раздел 3.6).
  10. После извлечения данных о скорости кадра по кадру движения животного, на основе частоты кадров видео (желательно 30 кадров/с), вычислить среднюю скорость животного в определенной кронштейне числа кадра (умножить время начала и конца в s на 30, чтобы получить номер кадра старта и конца).
  11. Рассчитайте оценки полета, разделив среднюю скорость во время каждого SCS на среднюю скорость в течение 10 с до SCS (базовый, BL), а затем добавить 1 очко для каждого побега прыжок (speedCS/speedBL - прыжки). Таким образом, оценка полета 1 не указывает на отсутствие изменений в поведении рейса по отношению к периоду, предустановиваемому SCS.
  12. Дополнительно, оценка видео вручную для других поведения, таких как воспитание и уход.

6. Статистический анализ

  1. Анализ данных для статистической значимости с помощью программного обеспечения статистического анализа. Для всех тестов определение статистической значимости — P'lt;0.05.
  2. Проверьте данные для нормального распределения с помощью теста на нормальность Шапиро-Уилка (α-0,05).
  3. Чтобы проверить эффект сигналов, провести сравнение в паре с помощью соответствующего параметрического (парного t-test) или не-параметрического (Wilcoxon подписанный ранг тест) тест.
  4. Для оценки 2-способного взаимодействия факторов (пробная версия cue X) выполните 2-путь ANOVA, за которым последуют пост-специальные тесты (например, многократный сравнительный тест Бонферрони/Тест Туки).

Результаты

Как описано на диаграмме (Рисунок 1A), сессия начинается с предварительной экспозиции (День 1), а затем страх кондиционирования (Дни 2 и 3), а затем либо вымирания или поиска (День 4).

Презентации SCS в предварительной экспозиции (День 1) сессии не вызвали полета ил...

Обсуждение

Описанные параметры звука и удара являются важными элементами этого протокола. Поэтому крайне важно проверить амплитуду удара и уровень звукового давления перед началом экспериментов. Страх кондиционирования исследований, как правило, используют 70-80 дБ уровень звукового давления и 0,...

Раскрытие информации

Авторов нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Советом регентов Луизианы через Фонд поддержки регентов (LE-SF(2018-21)-RD-A-17) и Национальным институтом психического здоровья Национальных институтов здравоохранения под номером R01MH122561. Содержание является исключительно ответственностью авторов и не обязательно отражает официальные взгляды Национальных институтов здравоохранения.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Neutral contextPlexiglass cylinder 30 X 30 cm 
Fear conditioning boxMed Associates, Inc.VFC-00825 X 30 X 35 cm dimentions
Audio generator Med Associates, Inc.ANL-926 
ShockerMed Associates Inc.ENV-414SStainless steel grid
SpeakerMed Associates, Inc.ENV-224AMSuitable for pure tone and white noise 
C57/BL6J miceJackson laboratory, USA664Aged 3-5 month
Cineplex software (Editor/ studio)PlexonCinePlex Studio v3.8.0For video tracking and behavioral scoring analysis
MedPC software VMed Associates, Inc.SOF-736
NeuroexplorerPlexonUsed to extract the freezing data scored in PlexonEditor
GraphPad Prism 8GraphPad Software, Inc.Version 8Statistical analysis software

Ссылки

  1. Gross, C. T., Canteras, N. S. The many paths to fear. Nature Reviews Neuroscience. 13 (9), 651-658 (2012).
  2. LeDoux, J. Rethinking the Emotional Brain. Neuron. , (2012).
  3. Maren, S. Neurobiology of Pavlovian fear conditioning. Annual Review of Neuroscience. 24, 897-931 (2001).
  4. Johnson, P. L., Truitt, W. A., Fitz, S. D., Lowry, C. A., Shekhar, A. Neural pathways underlying lactate-induced panic. Neuropsychopharmacology. 33 (9), 2093-2107 (2008).
  5. Mobbs, D., et al. From threat to fear: The neural organization of defensive fear systems in humans. Journal of Neuroscience. 29 (39), 12236-12243 (2009).
  6. Münsterkötter, A. L., et al. Spider or no spider? neural correlates of sustained and phasic fear in spider phobia. Depression and Anxiety. 32 (9), 656-663 (2015).
  7. Kessler, R. C., Wai, T. C., Demler, O., Walters, E. E. Prevalence, severity, and comorbidity of 12-month DSM-IV disorders in the National Comorbidity Survey Replication. Archives of General Psychiatry. 62 (6), 617-627 (2005).
  8. National Institute of Mental Health. Generalized anxiety disorder. National Institute of Mental Health. , 3-8 (2017).
  9. Herry, C., Johansen, J. P. Encoding of fear learning and memory in distributed neuronal circuits. Nature Neuroscience. 17 (12), 1644-1654 (2014).
  10. Janak, P. H., Tye, K. M. From circuits to behaviour in the amygdala. Nature. 517 (7534), 284-292 (2015).
  11. Tovote, P., Fadok, J. P., Lüthi, A. Neuronal circuits for fear and anxiety. Nature Reviews Neuroscience. 16 (6), 317-331 (2015).
  12. Seidenbecher, T., Laxmi, T. R., Stork, O., Pape, H. C. Amygdalar and hippocampal theta rhythm synchronization during fear memory retrieval. Science. 301 (5634), 846-850 (2003).
  13. Blanchard, D. C., Blanchard, R. J., Blanchard, D. C. Defensive behaviors, fear, and anxiety. Handbook of Anxiety and Fear. Handbook of behavioral neuroscience. , 63-79 (2008).
  14. Perusini, J. N., Fanselow, M. S. Neurobehavioral perspectives on the distinction between fear and anxiety. Learning and Memory. 22 (9), 417-425 (2015).
  15. Fadok, J. P., et al. A competitive inhibitory circuit for selection of active and passive fear responses. Nature. 542 (7639), 96-99 (2017).
  16. Maren, S. Neurotoxic or electrolytic lesions of the ventral subiculum produce deficits in the acquisition and expression of Pavlovian fear conditioning in rats. Behavioral Neuroscience. 113 (2), 283-290 (1999).
  17. Xu, C., et al. Distinct hippocampal pathways mediate dissociable roles of context in memory retrieval. Cell. 167 (4), 961-972 (2016).
  18. Curzon, P., Rustay, N. R. Chapter 2: Cued and contextual fear conditioning for rodents. Methods of Behavior Analysis in Neuroscience. 2nd edition. , (2009).
  19. Mollenauer, S., Bryson, R., Robison, M., Phillips, C. Noise avoidance in the C57BL/6J mouse. Animal Learning & Behavior. 20 (1), 25-32 (1992).
  20. Hersman, S., Allen, D., Hashimoto, M., Brito, S. I., Anthony, T. E. Stimulus salience determines defensive behaviors elicited by aversively conditioned serial compound auditory stimuli. eLife. 9, (2020).
  21. Dong, P., et al. A novel cortico-intrathalamic circuit for flight behavior. Nature Neuroscience. 22 (6), 941-949 (2019).
  22. Borkar, C. D., et al. Sex differences in behavioral responses during a conditioned flight paradigm. Behavioural Brain Research. 389, 112623 (2020).
  23. Fadok, J. P., Markovic, M., Tovote, P., Lüthi, A. New perspectives on central amygdala function. Current Opinion in Neurobiology. 49, 141-147 (2018).
  24. Pitman, R. K., et al. Biological studies of post-traumatic stress disorder. Nature Reviews Neuroscience. 13 (11), 769-787 (2012).
  25. Canteras, N. S., Graeff, F. G. Executive and modulatory neural circuits of defensive reactions: Implications for panic disorder. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. , (2014).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

167

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены