동결 및 비행 행동을 연구하는 새로운 파블로비안 공포 컨디셔닝 패러다임

요약

방어 행동 응답은 위협 강도, 근접성 및 노출 컨텍스트에 따라 다행입니다. 이러한 요인에 기초하여, 우리는 개별 과목 내에서 조건된 동결 및 비행 행동 사이의 명확한 전환을 유도하는 고전적인 컨디셔닝 패러다임을 개발했습니다. 이 모델은 불안, 공황 및 외상 후 스트레스 장애와 관련된 병리를 이해하는 데 중요합니다.

초록

두려움과 불안 관련 행동은 유기체의 생존에 크게 기여합니다. 그러나, 인식 된 위협에 과장 된 방어 응답다양 한 불안 장애의 특성, 미국에서 정신 질환의 가장 널리 퍼 진 형태. 방어 적 행동에 대한 책임이있는 신경 생물학적 메커니즘을 발견하는 것은 새로운 치료 개입의 개발에 도움이 될 것입니다. 파블로비안 공포 컨디셔닝은 공포 관련 학습과 기억을 연구하는 데 널리 사용되는 실험실 패러다임입니다. 전통적인 파블로비안 공포 컨디셔닝 패러다임의 주요 한계는 동결이 모니터링되는 유일한 방어 행동이라는 것입니다. 우리는 최근에 우리가 조건된 동결 및 비행 (또한 탈출이라고도 함) 개별 과목 내에서 행동을 모두 연구 할 수있는 수정 된 파블로비안 공포 컨디셔닝 패러다임을 개발했습니다. 이 모델은 고강도 발자국과 조건부 자극과 무조건 자극 사이의 페어링 횟수를 더 많이 사용합니다. 또한, 이 조건부 비행 패러다임은 순수한 톤과 백색 잡음 청각 자극의 연속 프리젠 테이션을 조건부 자극으로 활용합니다. 이 패러다임에서 컨디셔닝에 따라, 마우스는 백색 잡음 도중 톤 자극 및 비행 반응에 응하여 동결 행동을 전시합니다. 이 컨디셔닝 모델은 생존에 필요한 행동 반응 사이의 신속하고 유연한 전환에 대한 연구에 적용 될 수 있습니다.

서문

두려움은 즉각적인 위협^1,2에대한 진화적으로 보존된 적응 반응입니다. 유기체는 위협에 대한 타고난 방어 반응을 가지고 있지만, 배운 협회는 위험^3의자극 예측에 적절한 방어 응답을 유도하는 것이 중요합니다. 방어 반응을 제어하는 뇌 회로의 이장애는 외상 후 스트레스 장애(PTSD), 공황 장애^4,특정 공포증^5,6과같은 다중 쇠약해지는 불안 장애와 관련된 적응반응에 기여할 가능성이 높다. 불안 장애에 대 한 미국에서 보급 률은 성인에 대 한 19.1% 그리고 31.9%^{청소년에 7,8.} 이 질병의 부담은 개별의 일상생활에 극단적으로 높고 그들의 삶의 질에 부정적인 영향을 미칩니다.

지난 수십 년 동안, 파블로비안 공포 컨디셔닝은 공포 관련 학습 및 메모리^9,10,11의근본적인 신경 메커니즘에 대한 엄청난 통찰력을 얻기 위한 강력한 모델 시스템으로 사용되었습니다. 파블로비안 공포 컨디셔닝은 조건부 자극(청각 자극과 같은 CS)과 역경무성 자극(미국; 예를 들어, 전기^{발자국)을}결합하는 것을 수반한다. 동결은 표준 파블로비안 컨디셔닝 패러다임에서 호출되고 측정되는 지배적인 행동이므로 탈출/비행 응답과 같은 능동적인 형태의 방어 행동의 신경 제어 메커니즘은 크게 미개척 상태로 유지됩니다. 이전 연구에 따르면 비행과 같은 다양한 형태의 방어 행동이 위협 강도, 근접성 및 컨텍스트^13,14에따라 제거됩니다. 뇌가 방어 행동의 다른 유형을 제어하는 방법을 연구하는 것은 크게 공포와 불안 장애에 난독증 신경 과정의 이해에 기여할 수 있습니다.

이러한 중요한 필요성을 해결하기 위해^15번을동결하는 것 외에도 비행과 탈출 점프를 유도하는 수정된 파블로비안 컨디셔닝 패러다임을 개발했습니다. 이 패러다임에서, 마우스는 백색 잡음 다음에 순수한 음색으로 구성된 연속 화합물 자극 (SCS)로 조절됩니다. 강한 전기 발자국과 SCS를 페어링의 이틀 후, 마우스는 백색 잡음 동안 톤 구성 요소 및 비행에 대한 응답으로 동결을 나타낸다. 조건부 동결 및 비행 동작 사이의 동작 스위치는 빠르고 일관적입니다. 흥미롭게도, 마우스는 백색 잡음 CS가 이전에 전달된 풋쇼크(컨디셔닝 컨텍스트)와 동일한 컨텍스트로 제시되지만 중립적인 맥락에서는 비행 동작을 나타낸다. 대신, 동결 응답이 중립적 인 맥락에서 지배, 톤에 비해 백색 잡음에 대한 응답으로 동결의 상당히 큰 수준. 이는 방어 반응 강도를 조절하는 컨텍스트의 역할과 전통적인 위협 컨디셔닝 패러다임^16,17에서발견되는 공포 관련 학습 및 메모리에 있는 상황별 정보의 규제 역할과 일치합니다. 이 모델을 사용하면 컨텍스트별 방식으로 여러 방어 동작을 직접, 피사체 내에서 비교할 수 있습니다.

프로토콜

다음 단계/절차는 툴레인 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인 후 제도적 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 마우스 의 준비

1. 3-5 개월 사이 세 남성 및 여성 성인 마우스를 사용 하 여. 본 연구에서는 잭슨 연구소에서 얻은 남성 C57BL/6J 마우스를 사용했지만 평판 좋은 공급업체로부터 마우스 변형을 사용할 수 있습니다.
2. 실험 전에 적어도 1 주일, 연구 결과 를 통해 12:12 h 빛/어두운 주기에 개별적으로 모든 마우스를 집. 생쥐에게 음식과 물에 대한 광고 리비툼 액세스를 제공합니다.
3. 라이트 사이클 동안 모든 행동 실험을 수행합니다. 개별 코호트 내에서 하루 중 동시에 모든 세션을 수행합니다. 예를 들어 1일째 에 오전 9시에 실험을 시작하는 경우 실험이 완료될 때까지 해당 시점부터 계속 시작합니다.

2. 연구 자료 준비

1. 연구 컨텍스트
   1. 실험을 수행하려면 두 가지 컨텍스트를 선택합니다.
   2. 맑은 플렉시글라스(직경 30cm)로 구성된 원통형 챔버를 문맥 A로 사용하고, 매끄러운 플렉시글라스 바닥을 사용한다. 챔버의 높이는 탈출을 방지하기에 충분해야한다 (적어도 30cm 높이).
   3. Context B의 경우 교대로 전류 발자국을 전달하는 데 사용되는 전기 그리드 바닥이 있는 직사각형 인클로저(25cm x 30cm)를 사용합니다. 이 챔버의 높이는 매우 중요하며 적어도 35cm 높이여야합니다. 또는 투명 한 지붕을 사용 하 여 (이 자료를 통해 비디오를 녹화할 수 있는지 확인).
      참고: 쉽게 세척할 수 있는 매끄러운 벽면이 있는 챔버를 사용합니다.
   4. 다른 클리닝 솔루션을 사용하여 컨텍스트를 청소합니다. 예를 들어, 깨끗한 컨텍스트 A와 1% 아세트산 과 컨텍스트 B 와 70% 에탄올. 첫 번째 세션을 시작하기 전에, 개별 마우스 를 테스트하는 것과 그 날의 세션이 완료된 후 컨텍스트를 청소합니다. 이것은 이전 마우스에서 후각 단서를 제거하는 것이 중요합니다. 철저한 청소는 또한 컨디셔닝 세션을 손상시킬 충격 그리드에 소변 스케일링을 방지하는 데 도움이됩니다.
      참고: 세척 솔루션은 후각 큐 역할을 하므로 특정 컨텍스트에 동일한 세척 액체를 사용합니다.
   5. 각 학습 세션 동안 컨텍스트 A 또는 컨텍스트 B를 사운드 감쇠 상자에 배치합니다.
2. 오디오 생성기
   1. 75dB에서 청각 자극을 전달하기 위해 컨텍스트 위에 오버헤드 스피커를 마운트합니다.
   2. 프로그래밍 가능한 오디오 생성기를 사용하여 미리 정의된 일정에 청각 자극을 생성합니다. 7.5 kHz 의 순수 톤은 부비동 파형이있는 소리이며 백색 잡음은 1-20,000 Hz에 이르는 다른 주파수에서 동일한 강도를 갖는 임의신호입니다.
   3. TTL 펄스를 사용하여 청각 자극및 충격 신호를 시간적 정밀도로 전달합니다.
      참고: 실험을 시작하기 전에 dB 미터를 사용하여 각 챔버의 장착된 스피커의 사운드 강도 출력을 측정합니다.
3. 쇼커: 충격기를 0.9 mA AC 충격을 전달하는 데 사용되는 전기 그리드 바닥과 연결합니다. 컴퓨터 프로그램의 빈도, 발병 및 충격 지속 시간을 정의합니다. 각 SCS의 끝에 각 충격 자극을 1s의 지속 시간 동안 전달하여 컨디셔닝 세션당 총 5개의 SCS 충격 페어링을 제공합니다.

3. 컴퓨터 프로그램 준비 및 비디오 추적

1. 소프트웨어 프로그램에서 코딩을 사용하여 동작 프로토콜을 생성합니다.
2. 프로그램에서 직렬 복합 자극 SCS를 정의합니다. 이 자극은 10 s 순수 한 톤의 연속 프리젠 테이션입니다 (각 핍은 7.5 kHz의 주파수와 1 Hz의 속도로 500 ms에 대해 제시됩니다) 및 10 s 백색 잡음 (1 Hz에서 500 ms 주사위).
3. 각 시험 에 따라 제시 된 시험 간 간격 (ITI)을 정의, 의사 무작위로.
4. 연구 하는 동안, 후속 분석을 위해 비디오에 모든 마우스 동작을 기록 합니다.
   참고: 상용 공포 컨디셔닝 박스는 상단에 장착된 카메라를 통해 동작을 기록하도록 설정되지 않을 수 있습니다. 녹화된 비디오가 동물이 이동하는 수평 이동, 속도 및 총 거리를 계산하는 데 사용되기 때문에 매우 중요합니다.
5. 소프트웨어 추적을 설정하기 위해 각 관련 컨텍스트에 테스트 마우스를 배치하고, 윤곽 추적 감도를 조정하고, 무게 중심을 정의합니다. 이렇게 하면 상대 위치에 대한 신뢰할 수 있는 데이터를 수집할 수 있습니다. 또한 피사체에 액세스할 수 있는 전체 컨텍스트 영역을 정의합니다.
   참고: 서로 다른 컨텍스트의 밝기 변경으로 등고선 크기가 변경되어 윤곽 크기를 변경하기 때문에 두 컨텍스트모두에 대한 등고선 크기를 조정하는 것이 중요합니다.
6. 챔버의 알려진 크기와 속도(cm/s)를 계산하는 데 사용할 수 있는 카메라의 픽셀 치수를 사용하여 교정 계수를 결정합니다.
7. 데이터 수집 컴퓨터의 타임스탬프 이벤트를 실시간 발생과 동기화합니다.

4. 행동 실험

1. 컴퓨터, 공포 컨디셔닝 박스 컨트롤러, 충격기, 비디오 및 타임스탬프 녹화 소프트웨어 : 모든 장비를 켭니다. 악기가 적절한 순서로 켜져 있는지 확인합니다.
2. 톤, 백색 잡음 및 충격 전달을 포함한 모든 기능을 확인하고 데이터 수집을 위한 시스템을 설정합니다.
3. 저장실에서 컨디셔닝 룸으로 동물을 운반합니다. 적어도 10 분 동안 거기에 적응할 수 있습니다.
4. 홈 케이지에서 동물을 꺼내 서 부드럽게 각 컨텍스트에 배치 한 다음 즉시 컴퓨터 프로그램을 활성화합니다.
   참고: 공포 컨디셔닝 시스템과 데이터 수집(타임스탬프, 마우스 추적 및 비디오 녹화) 소프트웨어의 초기화는 TTL 펄스 매개 활성화를 사용하여 동기화할 수 있습니다.
5. 사전 컨디셔닝/사전 노출
   1. 1일째에 피사체를 컨텍스트 A(중립 컨텍스트)에 배치합니다. 3분(기준기간)에 대해 챔버에 적응한 다음 총 지속시간 20s(그림1A-1B)의SCS 4시험에 노출되도록 한다.
   2. 90s 평균 의사 무작위 ITI (범위 80-100 s)를 유지합니다. 각 사전 노출 세션의 총 지속 시간은 590s입니다.
6. 공포 컨디셔닝
   1. 2일과 3일에는 피사체를 컨텍스트 B에 넣습니다. 3분 기준 기간에 따라 피사체를 1s, 0.9 mA AC 풋쇼크로 공동 종료하는 SCS의 5개의 페어링을 노출합니다.
   2. 120s 평균 의사 무작위 ITI(범위 90-150 s)를 유지합니다. 각 컨디셔닝 세션은 총 820s(그림1A)에대해 지속됩니다.
   3. 실험의 목표에 따라, 4일째에 대상 마우스를 리콜 테스트(단계 4.7 참조) 또는 멸종을 두려워하기 위해(단계 4.8 참조).
7. 공포 회수(컨텍스트 의존성 테스트)
   1. 4일째되는 날에는 피사체를 컨텍스트 A에 넣습니다. 3분 기준 기이 가후, 590초 이상 풋쇼크 없이 SCS의 4번의 시험으로 제시한다.
   2. 90s 평균 의사 무작위 ITI (범위 80-100 s)를 유지합니다.
8. 공포 멸종
   1. 4일째되는 날에는 피사체를 컨텍스트 B로 배치합니다. 3분 기준 기간에 따라 1910년 이상 풋쇼크 없이 SCS의 16번의 시험을 제시한다.
   2. 90s 평균 의사 무작위 ITI (범위 60-120 s)를 유지합니다.
9. 동물을 홈 케이지로 돌려보내 모든 동물에 대한 절차를 반복하십시오.

5. 행동의 정량화

1. 실험에 대한 관찰자 블라인드가 자동 동결 검출기 임계값을 사용하여 동결 동작에 대한 녹화된 비디오를 점수로 작성한 다음 픽셀 변경의 프레임별 분석이 수행됩니다.
   참고: 다른 소프트웨어 패키지를 사용하여 2개의 카메라 시스템을 사용하여 자동으로 동결을 계산할 수도 있습니다. 관찰자가 동결 동작을 수동으로 득점할 수도 있습니다.
2. 최소 1s에 대해 호흡에 필요한 운동을 제외하고 동결을 신체 운동의 완전한 중단으로 정의합니다.
3. 4개의 발이 바닥을 떠날 때 점수가 점프하여 수직 및/또는 수평 이동이 발생합니다.
4. 표시된 파일을 동결, 점프 및 이벤트 마커로 내보냅니다.
5. 정의된 기간(예: 각 평가판에 대해 SCS 이전, 톤 및 백색 잡음 의 10s 지속 시간)에서 관련 이벤트(동결 및 점프)를 추출합니다.
6. 스프레드시트 파일에서 추출된 시작 중지 지속 시간을 사용하여 각 평가판 기간에서 종료 시간부터 시작 시간을 빼서 동결 기간(들)을 계산합니다.
7. 모든 시험에서 동결 기간을 합산하여 이 데이터 평가판을 낮으로 표현합니다.
   참고: 연구의 목적에 따라 학습 세션의 시험/기간에서 비행 또는 동결 행동을 채점하고 계산할 수 있습니다.
8. 특정 평가판 기간의 총 점프 수를 합산합니다.
9. 마우스 의 무게 중심의 프레임 X-Y 축 이동에 의해 프레임에서 마우스 추적 좌표에 의해 생성 된 파일을 추출하고 마우스 (cm / s)의 속도를 계산합니다.
   참고: 속도 데이터는 cm/s 또는 픽셀/s 형식으로 표시될 수 있습니다. 해당 테스트 컨텍스트에 대해 비디오에 정의된 인치 또는 cm/픽셀 값을 사용하여 픽셀/s 단위를 cm/s로 변환합니다(섹션 3.6 참조).
10. 동물의 프레임 이동에 의한 프레임 에 대한 속도 데이터를 추출한 후, 비디오의 프레임 속도(바람직하게는 30프레임/s)에 기초하여, 특정 프레임 번호 브래킷에서 동물의 평균 속도를 계산합니다(시작 및 끝 프레임 번호를 얻기 위해 s에서 시작 및 종료 시간을 30으로 곱함).
11. 각 SCS의 평균 속도를 10s pre-SCS(기준선, BL)의 평균 속도로 나눈 다음 각 이스케이프 점프(speedCS/speedBL + 점프#)에 대해 1점을 추가하여 비행 점수를 계산합니다. 따라서 비행 점수 1은 SCS 이전 기간의 비행 동작에 변화가 없음을 나타냅니다.
12. 선택적으로, 사육 및 그루밍과 같은 다른 동작에 대해 수동으로 비디오를 점수 매기기.

6. 통계 분석

1. 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 통계적 유의를 위해 데이터를 분석합니다. 모든 시험의 경우 통계적 유의성의 정의는 P&05입니다.
2. 샤피로-윌크 정상 테스트(α=0.05)를 사용하여 일반 분포에 대한 데이터를 확인합니다.
3. 큐의 효과를 테스트하려면 적절한 파라메트릭(페어링 된 t-test) 또는 비 파라메트릭 (Wilcoxon 서명 순위 테스트) 테스트를 사용하여 쌍 방향으로 비교를 수행합니다.
4. 요인의 2 방향 상호 작용을 평가하기 (큐 X 평가판), 후 Hoc 테스트 다음 2 방향 ANOVA를 수행 (예를 들어, 본페로니의 다중 비교 테스트 / 투키의 테스트).

결과

다이어그램(그림1A)에설명된 바와 같이 세션은 사전 노출(1일)으로 시작하여 공포 컨디셔닝(2일과 3일) 다음 소멸 또는 검색(4일)으로 시작합니다.

사전 노출(1일) 세션에서 SCS의 프리젠테이션은 마우스(그림 2A-2B)에서비행 또는 동결 반응을 유도하지 않았다. 컨디셔닝 중 행동 분석(일2 및 3일)은 SCS의 톤 성분이 SCS

토론

설명된 사운드 및 충격 매개 변수는 이 프로토콜의 중요한 요소입니다. 따라서 실험을 시작하기 전에 충격 진폭과 음압 수준을 테스트하는 것이 중요합니다. 공포 컨디셔닝 연구는 일반적으로 70-80 dB 음압 수준과 0.1-1 mA 충격 강도^18을사용합니다. 따라서, 설명된 매개변수는 전통적인 공포 컨디셔닝 패러다임의 범위 내에 있다. 이전 CS 전용(footshock 없음) 대조실험에서, 우리는 마?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neutral context			Plexiglass cylinder 30 X 30 cm
Fear conditioning box	Med Associates, Inc.	VFC-008	25 X 30 X 35 cm dimentions
Audio generator	Med Associates, Inc.	ANL-926
Shocker	Med Associates Inc.	ENV-414S	Stainless steel grid
Speaker	Med Associates, Inc.	ENV-224AM	Suitable for pure tone and white noise
C57/BL6J mice	Jackson laboratory, USA	664	Aged 3-5 month
Cineplex software (Editor/ studio)	Plexon	CinePlex Studio v3.8.0	For video tracking and behavioral scoring analysis
MedPC software V	Med Associates, Inc.	SOF-736
Neuroexplorer	Plexon		Used to extract the freezing data scored in PlexonEditor
GraphPad Prism 8	GraphPad Software, Inc.	Version 8	Statistical analysis software