牛磺胆酸钠诱导C57BL / 6小鼠严重急性胰腺炎

摘要

严重急性胰腺炎的动物模型能够在初始阶段研究病理生理变化，促进观察炎症事件的演变。在这里，我们提供了通过将牛磺草酸钠逆行输注到麻醉的C57BL / 6小鼠的胰管中来诱导严重急性胆汁性胰腺炎的方案。

摘要

通过牛磺胆酸钠输注诱导胆道急性胰腺炎已被科学界广泛使用，因为代表了人类临床状况和与临床胆道胰腺炎发作相对应的炎症事件的再现。胰腺损伤的严重程度可以通过测量输注胆汁酸的浓度、速度和体积来评估。本研究提供了方案生殖中使用的材料和方法的更新清单，并显示了该急性胰腺炎（AP）模型的主要结果。以前的大多数出版物都仅限于在大鼠中复制这种模型。我们已经将这种方法应用于小鼠，这提供了可能与研究相关的其他优势（即，这些动物的试剂和抗体库的可用性以及使用转基因小鼠品系的可能性）。对于小鼠急性胰腺炎诱导，我们提出了一个系统方案，在C57BL / 6小鼠中以10μL / min的输注速度以2.5%牛磺胆酸钠的定义剂量3分钟，在诱导后12小时内达到其最大严重程度，并突出结果并具有验证该方法的结果。通过实践和技术，从麻醉诱导到输注完成的总估计时间为每只动物25分钟。

引言

在人类中，胆结石的存在是胰腺炎的最常见原因，这是由于胆总管末端部分的阻塞，中断了胰腺分泌物的流动并导致胰腺中强烈的炎症过程，血清和炎症介质中消化酶的浓度增加^1，2。

已经提出了两种不同的理论来解释急性胰腺炎（AP）的发展。"共通道"理论表明，胆囊中存在的结石会阻塞远端胆总管系统，从而使胆汁分泌逆行流入胰管。第二种理论（"导管阻塞"理论）表明，过量胆结石阻塞胰管会导致胰腺分泌物流向十二指肠的阻塞，从而导致导管高血压³。虽然导致急性胆道胰腺炎的机制尚不完全清楚，但结果是强烈的炎症过程。消化酶出疹和胰腺自身消化导致组织病理学改变，腹水和血清中炎症细胞因子（IL-1β，IL-6，TNF-α）增加，以及急性期蛋白增加^4，5，6。

严重的急性胰腺炎是一种值得临床关注的疾病，因为它涉及多个器官和高死亡风险。用于急性胰腺炎（AP）繁殖的动物模型很重要，因为它们解释了疾病的病理生理机制，并有助于监测炎症事件的演变，从疾病的初始阶段开始。这在诊所中通常是不可能的^2，7。此外，在临床前研究中，胰腺组织的获取很容易，有利于阐明与临床条件^{相关的变化8} 以及使用等基因物种的可能性，消除不良变量，并反映临床与人类状况中观察到的结果的相似性⁹。

用于诱导大鼠和小鼠急性胰腺炎的胆道和非胆道模型已在科学文献中频繁研究。非胆道诱导方法包括给予超近端刺激剂量的胆囊收缩素促分泌剂或其类似物^cerulein10;给予几乎致命剂量的l-精氨酸;或给予补充乙硫氨酸的胆碱缺乏饮食¹¹。虽然这些方法很容易复制并导致胰腺炎症，但它们不会复制理论上触发AP的机制（即胆汁分泌物反流进入胰管）。解决胆道模型的技术是基于胆汁酸逆行输注到胰管中，需要训练有素的研究人员来执行该协议。已经发表了几项在大鼠中使用这种方法的研究（显然是出于技术原因，因为这些实验涉及外科手术）^12，13。然而，在小鼠中的方法可能会在炎症研究中提供更有趣的结果^3，14，15。在这项研究中，我们将展示通过输注牛磺胆酸钠在C57BL / 6麻醉小鼠中繁殖严重急性胰腺炎的步骤清单。

对于涉及需要抗体实验以及基因和蛋白质表达分析的工作，使用小鼠是优选的，因为这些动物的材料库更多，并且有可能使用等基因和敲除物种，以及其他可用于研究¹⁶。小鼠C57BL / 6是一种小鼠近交系，最初用于研究抗肿瘤活性和免疫学。该菌株越来越被研究人员视为同种异基因，允许结果具有更大的可重复性，这可能意味着在实验中使用较少数量的动物，并且同一组之间结果的变异性较小^17，18。

Perides等人（2010）¹⁴ 发表了一种通过牛磺胆酸钠输注在小鼠中诱导AP的方案。在这里，我们使用C57BL / 6小鼠中更高的牛磺胆酸钠浓度（2.5%）更新该模型，并具有定义的输注体积和速度（图1）。在小鼠诱导后12小时内达到最大严重程度。血清和腹膜腔中IL-6浓度的升高与AP的进展相关。通过实践，从麻醉诱导到输注完成的总估计时间为每只动物25分钟。训练有素的研究人员进行这项实验至关重要。为确保将溶液正确注射到胆总管中，请使用亚甲蓝而不是牛磺胆酸钠进行几次飞行员培训课程。

研究方案

该协议已获得USP医学院动物使用伦理委员会的批准，编号项目:1343/2019-CEUA:FMUSP。对于该协议，使用C57BL / 6小鼠，年龄为6周，体重20±2g（n = 9 /组）。

1. 剖腹手术

1. 使用1 mL注射器和13x0.45mm针头26G 1/2皮下注射（0.1 mL / 10g体重）用木精（10mg / kg）和氯胺酮溶液（80mg / kg）麻醉动物。通过捏住脚趾检查是否有足够的麻醉深度。使用加热垫控制体温。确保所有手术材料都是无菌的。
2. 用5%聚维酮碘溶液清洁腹部区域，并使用修剪器去除胸部和下腹部之间的毛发（约2 cm ²）。用70%的酒精清洁手术区域。
3. 使用手术胶带将动物固定在手术板上。使用剪刀水平切割5毫米的皮肤，在腹部上部和西腓骨下1厘米。在腹膜上重复切口。这将导致剖腹手术，并且腔暴露最小。

2. 定位和暴露胰腺

1. 在牵开器的帮助下，将肝脏拉向小鼠的头部，距离肠道约1厘米。
2. 定位将注射牛磺胆酸钠（胰头）的胰腺区域。参考肝脏定位十二指肠 - 在肝脏下方，右侧（在观察鼠标时在左侧）。十二指肠是小肠的第一部分，与胃的最后一部分相连。
3. 在镊子的帮助下，将肝脏抬向动物头部，轻轻拉动小肠部分。用6-0聚丙烯缝合线固定小肠的两个外侧端，以更好地观察胆总管的远端。

3. 重症急性胰腺炎诱导

1. 用微血管夹暂时阻塞近端胆总管，以防止逆行输注泄漏到肝脏中。胆总管可见于十二指肠的肝脏侧，其与十二指肠的交界处将呈现白色。将器官暴露在腹腔外。
2. 刺穿壶腹周围区域（小肠壁的白色部分），用连接到0.54毫米聚乙烯管的0.4毫米针头进入胆总管。
3. 用8-0暂时阻塞远端胆总管缝合以防止牛磺胆酸钠溶液泄漏到十二指肠中。
4. 启动输注泵，以10μL / 10g体重的恒定速度将2.5%牛磺胆酸钠溶液（稀释在0.9%盐水中）滴注3分钟。
5. 输液后，取下微血管夹，临时8-0缝合线，并将注射针从胆汁胰管中重建胆汁的生理流动。
6. 最后，用6-0非吸水性单丝聚丙烯缝合线缝合腹部。剖腹手术和终缝线之间的时间最长应为30分钟（见 图1）。
7. 手术后，将动物放在聚乙烯箱中，里面衬有木屑和水，随意食物。
8. 以与实验小鼠相同的方式治疗对照小鼠，但确保输液仅由盐水组成。在对照组（SHAM）中进行外科手术和输注生理盐水溶液（10毫升/分钟，持续3分钟），以消除手术和插管引起的炎症偏倚。
9. 从术后恢复后开始，皮下注射12.5mg/kg曲马多，每8小时一次。

4. 分析方法

1. 在AP诱导后12小时，用木肼（10mg / kg）和氯胺酮（80mg / kg）麻醉动物，通过眼眶丛收集约250μL血液。
   1. 轻轻地将皮肤保持在背部，促进眼球的轻微突出，并将其定位为眼睛朝上。
   2. 在动物的眼睛中滴入含有局部麻醉剂的眼药膏。
   3. 将毛细管的末端置于眼角，并将其轻轻插入眼球下方，角度约为30°-45°。旋转毛细管直至血流开始。请记住，没有必要对程序使用武力。
   4. 收集结束后，通过用纱布轻轻按压来保持眼睑闭合，以确保体内平衡。将毛细管丢弃在尖锐容器中¹⁹。
   5. 离心血清（700× g，15分钟）并储备上清液用于淀粉酶和IL-6剂量（步骤4.7和4.8）。
2. 通过_CO2 窒息对小鼠实施安乐死。
3. 使用27 G针头将4 mL冰冷的1x PBS注射到腹膜腔中。绑住腹部皮肤，确保针头在腹膜中缓慢推动，以免刺穿任何器官。注射后，轻轻按摩腹膜10秒，以去除粘附在腹膜上的细胞。
4. 使用剪刀和镊子，在内层皮肤和肌肉组织上做一个小切口（0.5厘米），以暴露腹腔。将球形移液管插入腹膜并收集液体。注意不要吸入脂肪组织或其他器官。
5. 收集尽可能多的液体，并将收集的细胞悬浮液沉积在冰上保存的管中。将灯泡移液器丢弃在尖锐容器中²⁰。离心腹膜液（250× g，5分钟）并储备上清液进行IL-6给药（步骤4.9）。
6. 收集十二指肠附近的胰腺区域（<5mm）。
7. 通过固定在10%福尔马林中并将其掺入石蜡中来处理胰腺。
   1. 用苏木精和曙红染色载玻片，以便在光学显微镜下进行组织病理学分析。使用施密特方案²¹ （胰腺水肿，腺泡细胞，损伤/坏死，胰腺炎症）来评估AP的程度。
8. 根据制造商的建议，使用市售试剂盒测量淀粉酶（U / dL）。
9. 根据制造商的建议，使用商用试剂盒通过Luminex测定法测量IL-6。
10. 如果需要，将步骤4.1和4.4中获得的血清和腹膜液上清液储存在-80°C的冰箱中。

结果

根据施密特量表²¹ ，胰腺炎严重程度的评分在0-3之间，其中0对应于不存在，1对应于轻度存在（<25%），2对应于中度存在（在25和50%之间），3对应于强烈的存在（>50%）（表1）。进行的测量是血浆淀粉酶活性，胰腺水肿，腺泡细胞，损伤/坏死，胰腺炎症（通过H&E染色切片的组织学分析）以及血清和PerC液体中的IL-6细胞因子浓度。严重AP12小时后?...

讨论

通过逆行牛磺胆酸钠输注诱导急性胰腺炎的方法已经在大鼠^{中显示22，23，24}。分别于2008年、2010年和2015年出版的三部类似作品作为议定书的参考^3，14，15。在这项工作中，我们列出了在C57BL / 6小鼠中重现该方法的所有关键步骤以及验证它的一些可能性。

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4 mm needle	INTRAG MEDICAL TECH	90183210	30G
0.54 mm polyethylene tube	Tygon	730010	-
Styrofoam block	-	-	-
masking tape for mounting the mouse	Missner	1236	-
Infusion pump scheduled to 10µL / min.	Havard aparatus-Peristaltic Pump Series	MA1 55-7766	Model 66 Small Peristaltic
Scissors and forceps
Antiseptic providine iodine	Pfizer	12086OR	antisepsis
70% ethanol	SIGMA	459836	Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O
Razor blade	Lord	bdk9a1ghk6	For trichotomy
Sodium taurocholate	Sigma-Aldrich	86339- 1G	CAS NUMBER- 345909-26-4
microvessel clip	Medicon Surgical	56.87.35	Approximator, opening 4.0 mm, closing pressure 30 - 40 g
6-0 prolene	Bioline	5162	Suture line
Ketamin NP (cloridrato de dextrocetamina) 50mg/mL	Cristália
Xilazine 2%	Syntec
Sterile saline solution (0.9% (wt/vol) saline)	Farmace	105851
Methyl Blue	Sigma-Aldrich Chemicals	M5528
MILLIPLEX MAP Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel - Immunology Multiplex Assay	MERCK	MCYTOMAG-70K	Simultaneously analyze multiple cytokine and chemokine biomarkers with Bead-Based Multiplex Assays using the Luminex technology, in mouse serum, plasma and cell culture samples.
Amylase Assay	Labtest	11
Desmarres retractor 13-mm width	ROBOZ	RS-6672