Pancréatite aiguë sévère induite par le taurocholate de sodium chez les souris C57BL/6

Résumé

Les modèles animaux pour la pancréatite aiguë sévère permettent l’étude des changements physiopathologiques au stade initial, facilitant l’observation de l’évolution des événements inflammatoires. Nous fournissons ici un protocole pour l’induction de la pancréatite biliaire aiguë sévère par perfusion rétrograde de taurocholate de sodium dans le canal pancréatique de souris C57BL/6 anesthésiées.

Résumé

L’induction de la pancréatite aiguë biliaire par perfusion de taurocholate de sodium a été largement utilisée par la communauté scientifique en raison de la représentation de l’état clinique humain et de la reproduction des événements inflammatoires correspondant à l’apparition de la pancréatite biliaire clinique. La gravité des lésions pancréatiques peut être évaluée en mesurant la concentration, la vitesse et le volume de l’acide biliaire infusé. Cette étude fournit une liste de contrôle mise à jour des matériaux et des méthodes utilisés dans la reproduction du protocole et montre les principaux résultats de ce modèle de pancréatite aiguë (PA). La plupart des publications précédentes se sont limitées à reproduire ce modèle chez le rat. Nous avons appliqué cette méthode chez la souris, ce qui offre des avantages supplémentaires (c’est-à-dire la disponibilité d’un arsenal de réactifs et d’anticorps pour ces animaux ainsi que la possibilité de travailler avec des souches de souris génétiquement modifiées) qui peuvent être pertinents pour l’étude. Pour l’induction de la pancréatite aiguë chez la souris, nous présentons un protocole systématique, avec une dose définie de taurocholate de sodium à 2,5% à une vitesse de perfusion de 10 μL / min pendant 3 min chez les souris C57BL / 6 qui atteint son niveau maximal de gravité dans les 12 heures suivant l’induction et mettons en évidence les résultats avec des résultats qui valident la méthode. Avec la pratique et la technique, le temps total estimé, de l’induction de l’anesthésie à la fin de la perfusion, est de 25 min par animal.

Introduction

Chez l’homme, la présence de calculs biliaires est la cause la plus fréquente de pancréatite due à l’obstruction de la partie terminale du cholédochal, interrompant le flux des sécrétions pancréatiques et provoquant un processus inflammatoire intense dans le pancréas, avec une augmentation de la concentration d’enzymes digestives dans le sérum et les médiateurs ^{inflammatoires1,2}.

Deux théories différentes ont été proposées pour expliquer le développement de la pancréatite aiguë (PA). La théorie du « canal commun » suggère que les calculs présents dans la vésicule biliaire obstruent le système des voies biliaires communes distales, permettant à la sécrétion biliaire de s’écouler rétrograde dans le canal pancréatique. La deuxième théorie (la théorie de « l’obstruction des canaux ») suggère que l’obstruction du canal pancréatique par un excès de calculs biliaires provoque un blocage de l’écoulement de la sécrétion pancréatique vers le duodénum, provoquant une hypertension ^canalaire3. Bien que les mécanismes qui conduisent à la pancréatite biliaire aiguë ne soient pas entièrement compris, le résultat est un processus inflammatoire intense. L’éruption des enzymes digestives et l’auto-digestion du pancréas entraînent des changements histopathologiques, une augmentation des cytokines inflammatoires (IL-1β, IL-6, TNF-α) dans le liquide ascitique et le sérum, et une augmentation des protéines de phase aiguë4,5,6.

La pancréatite aiguë sévère est une affection qui mérite une attention clinique en raison de l’implication de plusieurs organes et d’un risque de mortalité élevé. Les modèles animaux pour la reproduction de la pancréatite aiguë (PA) sont importants car ils expliquent les mécanismes physiopathologiques de la maladie et aident à surveiller l’évolution des événements inflammatoires, à partir des stades initiaux de la maladie. Cela n’est généralement pas possible dans les ^cliniques2,7. En outre, l’accès aux tissus pancréatiques est facile dans les études précliniques, favorisant l’élucidation des changements liés aux conditions ^cliniques8 ainsi que la possibilité de travailler avec des espèces isogéniques, éliminant les variables indésirables et reflétant la similitude clinique avec les résultats observés dans la condition ^humaine9.

Les modèles biliaires et non biliaires pour l’induction de la pancréatite aiguë chez les espèces de rats et de souris ont été fréquemment étudiés dans la littérature scientifique. Les méthodes non biliaires d’induction comprennent l’administration de doses supramaximales stimulantes du sécrétagogue de la cholécystokinine ou de son analogue cérulérine10; administration de doses presque létales de L-arginine; ou l’administration d’un régime alimentaire déficient en choline complété par de l’éthionine11. Bien que ces méthodes soient faciles à reproduire et entraînent une inflammation pancréatique, elles ne répliquent pas les mécanismes qui, en théorie, déclenchent l’AP (c’est-à-dire le reflux de la sécrétion biliaire dans le canal pancréatique). La technique qui aborde le modèle biliaire est basée sur l’infusion rétrograde d’acides biliaires dans le canal pancréatique et nécessite des chercheurs bien formés pour réaliser ce protocole. Plusieurs études ont été publiées utilisant cette méthode chez le rat (apparemment pour des raisons techniques puisque ces expériences impliquent des interventions chirurgicales)^12,13. Cependant, l’approche chez la souris peut offrir des résultats plus intéressants dans l’étude de l’inflammation3,14,15. Dans cette étude, nous montrerons une liste de contrôle des étapes à suivre pour la reproduction de la pancréatite aiguë sévère par perfusion de taurocholate de sodium chez des souris anesthésiées en C57BL/6.

Pour les travaux qui impliquent la nécessité d’expériences avec des anticorps et l’analyse de l’expression des gènes et des protéines, l’utilisation de souris est préférable en raison de l’arsenal plus important de matériaux pour ces animaux et de la possibilité de travailler avec des espèces isogéniques et knock-out, entre autres qui peuvent être utilisées en rapport avec des ^études16. Souris C57BL/6 est une souche consanguine de souris développée à l’origine pour l’étude de l’activité antitumorale et de l’immunologie. Cette souche est de plus en plus préférée par les chercheurs pour être isogénique, ce qui permet une plus grande reproductibilité des résultats, ce qui peut impliquer l’utilisation d’un plus petit nombre d’animaux dans une expérience et moins de variabilité des résultats entre le même ^groupe17,18.

Perides et coll. (2010)^{14 ont} publié un protocole pour l’induction de l’AP chez la souris par perfusion de taurocholate de sodium. Ici, nous mettons à jour ce modèle en utilisant une concentration plus élevée de taurocholate de sodium (2,5%) chez les souris C57BL / 6, avec un volume et une vitesse de perfusion définis (Figure 1). Le niveau maximal de gravité est atteint dans les 12 heures suivant l’induction chez la souris. L’élévation de la concentration d’IL-6 à la fois dans le sérum et dans la cavité péritonéale est corrélée à la progression de l’AP. Avec la pratique, le temps total estimé entre l’induction de l’anesthésie et la fin de la perfusion est de 25 min par animal. Il est essentiel qu’un chercheur qualifié mène cette expérience. Pour vous assurer que la solution est correctement injectée dans le canal biliaire commun, effectuez plusieurs séances de formation pilote en utilisant du bleu de méthylène au lieu du taurocholate de sodium.

Protocole

Ce protocole a été approuvé par le Comité d’éthique pour l’utilisation des animaux de l’USP Medicine School, Num. Projet: 1343/2019-CEUA: FMUSP. Pour ce protocole, des souris C57BL/6, âgées de 6 semaines, pesant 20 ± 2 g ont été utilisées (n = 9/groupe).

1. Laparotomie

1. Anesthésier les animaux avec de la xylazine (10 mg/kg) et une solution de kétamine (80 mg/kg), par voie sous-cutanée (0,1 mL/10 g de poids corporel) à l’aide d’une seringue de 1 mL et d’une aiguille de 13x0,45 mm 26G 1/2. Vérifiez la profondeur d’anesthésie suffisante en pinçant l’orteil. Contrôlez la température corporelle à l’aide de coussinets chauffants. Assurez-vous que tout le matériel chirurgical est stérile.
2. Nettoyez la région abdominale avec une solution de povidone-iode à 5% et utilisez une tondeuse pour enlever les poils entre la poitrine et le bas-ventre (environ 2 ^cm2). Nettoyez la zone chirurgicale avec 70% d’alcool.
3. Immobilisez l’animal sur le tableau chirurgical à l’aide de ruban chirurgical. Utilisez des ciseaux pour couper 5 mm de la peau horizontalement, sur la partie supérieure de l’abdomen et 1 cm en dessous du processus xiphoïde. Répétez la coupe sur le péritoine. Cela entraînera une laparotomie avec une exposition minimale de la cavité.

2. Localisation et exposition du pancréas

1. À l’aide d’un rétracteur, tirez le foie vers la tête de la souris, à environ 1 cm de l’intestin.
2. Localisez la région du pancréas qui sera injectée avec du taurocholate de sodium (tête du pancréas). Localisez le duodénum en référence au foie - sous le foie, sur le côté droit (à gauche lorsque la souris est vue). Le duodénum est la première partie de l’intestin grêle et est relié à la dernière partie de l’estomac.
3. À l’aide de pinces, soulevez le foie vers la tête de l’animal et tirez doucement la partie de l’intestin grêle. Fixez les deux extrémités latérales de l’intestin grêle avec une suture en polypropylène 6-0 pour mieux voir la partie distale du canal biliaire commun.

3. Induction de la pancréatite aiguë sévère

1. Obstruer temporairement le canal biliaire commun proximal avec un clip de microvaisseau pour empêcher la perfusion rétrograde de s’infiltrer dans le foie. Le canal biliaire commun peut être vu sur le côté hépatique du duodénum et sa jonction avec le duodénum apparaîtra blanche. Exposez l’organe hors de la cavité abdominale.
2. Perforer la région périampullaire (partie blanchâtre de la paroi de l’intestin grêle) pour accéder au canal biliaire commun avec une aiguille de 0,4 mm reliée à un tube en polyéthylène de 0,54 mm.
3. Faire une occlusion temporaire du canal biliaire commun distal avec 8-0 suture pour empêcher la solution de taurocholate de sodium de s’infiltrer dans le duodénum.
4. Démarrez la pompe à perfusion et programmez une perfusion de solution de taurocholate de sodium à 2,5 % (diluée dans une solution saline à 0,9 %) à une vitesse constante de 10 μL/10 g de poids corporel pendant 3 min.
5. Après la perfusion, retirez le clip du microvaisseau, le 8-0 temporaire suture, et l’aiguille d’injection du canal pancréatique biliaire pour reconstituer le flux physiologique de la bile.
6. À la fin, suturez l’abdomen avec 6-0 suture de polypropylène monofilament non absorbant. Le temps entre la laparotomie et la suture d’extrémité doit être d’un maximum de 30 minutes (voir figure 1).
7. Après la chirurgie, hébergez les animaux dans des boîtes en polyéthylène bordées de copeaux de bois et d’eau et de nourriture ad libitum.
8. Traiter les souris témoins de la même manière que les souris expérimentales, mais s’assurer que l’infusat est constitué uniquement de solution saline. Effectuer l’intervention chirurgicale et la perfusion d’une solution saline (10 mL/min, pendant 3 min) dans un groupe témoin (SHAM) afin d’éliminer le biais inflammatoire causé par la chirurgie et la canulation.
9. Utiliser le tramadol 12,5 mg / kg par voie sous-cutanée toutes les 8 heures, à partir de la récupération post-chirurgicale.

4. Méthodes d’analyse

1. À 12 h après l’induction de l’AP, anesthésier les animaux avec de la xylazine (10 mg/kg) et de la kétamine (80 mg/kg) pour prélever environ 250 μL de sang via le plexus orbitaire.
   1. Tenez doucement la peau sur le dos, favorisant une légère saillie du globe oculaire, et positionnez-la avec l’œil tourné vers le haut.
   2. Instillez une goutte de pommade pour les yeux contenant un anesthésique local dans l’œil de l’animal.
   3. Placez l’extrémité du tube capillaire dans le coin médian de l’œil et insérez-la doucement sous le globe oculaire, avec un angle d’environ 30 ° à 45 °. Faites pivoter le tube capillaire jusqu’à ce que le flux sanguin commence. Rappelez-vous qu’il n’est pas nécessaire d’utiliser la force pour la procédure.
   4. Une fois la collecte terminée, assurez-vous de l’homéostasie en gardant les paupières fermées par une légère compression avec la gaze. Jetez le tube capillaire dans le récipient pour objets ^tranchants19.
   5. Centrifuger le sérum (700 x g, 15 min) et stocker le surnageant pour le dosage de l’amylase et de l’IL-6 (étapes 4.7 et 4.8).
2. Euthanasier les souris par asphyxie au _CO2 .
3. Utilisez une aiguille de 27 G pour injecter 4 mL de PBS glacé 1x dans la cavité péritonéale. Tenez la peau abdominale et assurez-vous que l’aiguille est poussée lentement dans le péritoine pour ne pas percer d’organes. Après l’injection, massez doucement le péritoine pendant 10 s pour éliminer les cellules adhérées au péritoine.
4. À l’aide de ciseaux et de pinces à épiler, faites une petite coupe (0,5 cm) sur l’intérieur de la peau et la musculature pour exposer la cavité abdominale. Insérez une pipette à bulbe dans le péritoine et collectez le liquide. Veillez à ne pas aspirer les tissus adipeux ou d’autres organes.
5. Recueillez autant de liquide que possible et déposez la suspension cellulaire recueillie dans des tubes maintenus sur la glace. Jetez la pipette à ampoule dans le récipient pour objets ^tranchants20. Centrifuger le liquide péritonéal (250 x g, 5 min) et stocker le surnageant pour le dosage de l’IL-6 (étape 4.9).
6. Recueillir la région du pancréas adjacente au duodénum (<5mm).
7. Traiter le pancréas en le fixant à 10% de formol et l’incorporer dans la paraffine.
   1. Tassez les lames avec de l’hématoxyline et de l’éosine pour des analyses histopathologiques en microscopie optique. Utilisez le protocole de ^Schmidt21 (œdème pancréatique, cellule acineuse, blessure/nécrose, inflammation pancréatique) pour évaluer l’étendue de l’AP.
8. Mesurez l’amylase (U/dL) à l’aide de kits disponibles dans le commerce conformément aux recommandations du fabricant.
9. Mesurez l’IL-6 par des tests Luminex à l’aide de kits commerciaux conformément aux recommandations du fabricant.
10. Conserver le sérum et le liquide péritonéal surnageant obtenus aux étapes 4.1 et 4.4 dans un congélateur à -80 °C si nécessaire.

Résultats

La gravité de la pancréatite a été notée entre 0-3 selon l’échelle de ^Schmidt21 où zéro correspond à l’absence, 1 correspond à une présence légère (<25%), 2 correspond à une présence modérée (entre 25 et 50%) et 3 correspond à une présence intense (> 50%) (tableau 1). Les mesures effectuées étaient l’activité plasmatique de l’amylase, l’œdème pancréatique, la cellule acineuse, la lésion / nécrose, l’inflammati...

Discussion

La méthode d’induction de la pancréatite aiguë par perfusion rétrograde de taurocholate de sodium a déjà été démontrée chez le rat22,23,24. Trois ouvrages similaires, publiés en 2008, 2010 et 2015, ont servi de référence pour le protocole3,14,15. Dans ce travail, nous énumérons toutes les étapes critiques pour reprodui...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4 mm needle	INTRAG MEDICAL TECH	90183210	30G
0.54 mm polyethylene tube	Tygon	730010	-
Styrofoam block	-	-	-
masking tape for mounting the mouse	Missner	1236	-
Infusion pump scheduled to 10µL / min.	Havard aparatus-Peristaltic Pump Series	MA1 55-7766	Model 66 Small Peristaltic
Scissors and forceps
Antiseptic providine iodine	Pfizer	12086OR	antisepsis
70% ethanol	SIGMA	459836	Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O
Razor blade	Lord	bdk9a1ghk6	For trichotomy
Sodium taurocholate	Sigma-Aldrich	86339- 1G	CAS NUMBER- 345909-26-4
microvessel clip	Medicon Surgical	56.87.35	Approximator, opening 4.0 mm, closing pressure 30 - 40 g
6-0 prolene	Bioline	5162	Suture line
Ketamin NP (cloridrato de dextrocetamina) 50mg/mL	Cristália
Xilazine 2%	Syntec
Sterile saline solution (0.9% (wt/vol) saline)	Farmace	105851
Methyl Blue	Sigma-Aldrich Chemicals	M5528
MILLIPLEX MAP Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel - Immunology Multiplex Assay	MERCK	MCYTOMAG-70K	Simultaneously analyze multiple cytokine and chemokine biomarkers with Bead-Based Multiplex Assays using the Luminex technology, in mouse serum, plasma and cell culture samples.
Amylase Assay	Labtest	11
Desmarres retractor 13-mm width	ROBOZ	RS-6672