Taurocolato de sodio inducido pancreatitis aguda grave en ratones C57BL/6

Resumen

Los modelos animales para la pancreatitis aguda grave permiten el estudio de los cambios fisiopatológicos en la etapa inicial, facilitando la observación de la evolución de los eventos inflamatorios. Aquí proporcionamos un protocolo para la inducción de pancreatitis biliar aguda grave por infusión retrógrada de taurocolato de sodio en el conducto pancreático de ratones C57BL/ 6 anestesiados.

Resumen

La inducción de la pancreatitis aguda biliar por infusión de taurocolato de sodio ha sido ampliamente utilizada por la comunidad científica debido a la representación de la condición clínica humana y la reproducción de eventos inflamatorios correspondientes a la aparición de pancreatitis biliar clínica. La gravedad del daño pancreático se puede evaluar midiendo la concentración, la velocidad y el volumen del ácido biliar infundido. Este estudio proporciona una lista de verificación actualizada de los materiales y métodos utilizados en la reproducción del protocolo y muestra los principales resultados de este modelo de pancreatitis aguda (AP). La mayoría de las publicaciones anteriores se han limitado a reproducir este modelo en ratas. Hemos aplicado este método en ratones, lo que proporciona ventajas adicionales (es decir, la disponibilidad de un arsenal de reactivos y anticuerpos para estos animales junto con la posibilidad de trabajar con cepas de ratones modificadas genéticamente) que pueden ser relevantes para el estudio. Para la inducción de pancreatitis aguda en ratones, presentamos un protocolo sistemático, con una dosis definida de taurocolato de sodio al 2,5% a una velocidad de infusión de 10 μL/min durante 3 min en ratones C57BL/6 que alcanza su nivel máximo de gravedad dentro de las 12 h de la inducción y destaca los resultados con resultados que validan el método. Con la práctica y la técnica, el tiempo total estimado, desde la inducción de la anestesia hasta la finalización de la infusión, es de 25 min por animal.

Introducción

En humanos, la presencia de cálculos biliares es la causa más frecuente de pancreatitis debido a la obstrucción de la porción terminal del coledocal, interrumpiendo el flujo de secreciones pancreáticas y provocando un intenso proceso inflamatorio en el páncreas, con un aumento de la concentración de enzimas digestivas en el suero y mediadores ^{inflamatorios1,2}.

Se han propuesto dos teorías diferentes para explicar el desarrollo de la pancreatitis aguda (PA). La teoría del "canal común" sugiere que los cálculos presentes en la vesícula biliar obstruyen el sistema de conductos biliares comunes distales, permitiendo que la secreción biliar fluya retrógrada hacia el conducto pancreático. La segunda teoría (la teoría de la "obstrucción del conducto") sugiere que la obstrucción del conducto pancreático por exceso de cálculos biliares provoca un bloqueo en el flujo de secreción pancreática al duodeno, causando hipertensión ^ductal3. Aunque los mecanismos que conducen a la pancreatitis biliar aguda no se comprenden completamente, el resultado es un proceso inflamatorio intenso. La erupción enzimática digestiva y la autodigestión del páncreas conducen a cambios histopatológicos, un aumento de las citoquinas inflamatorias (IL-1β, IL-6, TNF-α) en el líquido ascítico y el suero, y un aumento de las proteínas de fase ^aguda4,5,6.

La pancreatitis aguda grave es una afección que merece atención clínica debido a la afectación de múltiples órganos y a un alto riesgo de mortalidad. Los modelos animales para la reproducción de la pancreatitis aguda (PA) son importantes ya que explican los mecanismos fisiopatológicos de la enfermedad y ayudan a monitorear la evolución de los eventos inflamatorios, a partir de las etapas iniciales de la enfermedad. Esto generalmente no es posible en las ^clínicas2,7. Además, el acceso a los tejidos pancreáticos es fácil en estudios preclínicos, favoreciendo la elucidación de los cambios vinculados a las condiciones ^clínicas8 junto con la posibilidad de trabajar con especies isogénicas, eliminando variables indeseables y reflejando la similitud clínica con los resultados observados en la condición ^humana9.

Los modelos biliares y no biliares para la inducción de pancreatitis aguda en especies de ratas y ratones se han estudiado con frecuencia en la literatura científica. Los métodos no biliares de inducción incluyen la administración de dosis estimulantes supramáximas del secretagogo colecistoquinina o su análogo ^ceruleína10; administración de dosis casi letales de L-arginina; o la administración de una dieta deficiente en colina suplementada con ^etionina11. Aunque estos métodos son fáciles de reproducir y dan lugar a la inflamación pancreática, no replican los mecanismos que en teoría desencadenan la PA (es decir, el reflujo de la secreción biliar en el conducto pancreático). La técnica que aborda el modelo biliar se basa en la infusión retrógrada de ácidos biliares en el conducto pancreático y requiere de investigadores bien formados para llevar a cabo este protocolo. Se han publicado varios estudios utilizando este método en ratas (aparentemente por razones técnicas ya que estos experimentos implican procedimientos quirúrgicos)^12,13. Sin embargo, el abordaje en ratones puede ofrecer resultados más interesantes en el estudio de la inflamación3,14,15. En este estudio, mostraremos una lista de verificación de los pasos a seguir para la reproducción de la pancreatitis aguda grave por infusión de taurocolato de sodio en ratones anestesiados C57BL/6.

Para trabajos que impliquen la necesidad de experimentos con anticuerpos y análisis de la expresión génica y proteica, es preferible el uso de ratones por el mayor arsenal de materiales para estos animales y la posibilidad de trabajar con especies isogénicas y knockout, entre otras que pueden ser utilizadas relevantes para ^estudios16. Ratones C57BL/6 es una cepa endogámica de ratones desarrollada originalmente para el estudio de la actividad antitumoral y la inmunología. Esta cepa está siendo cada vez más preferida por los investigadores por ser isogénica, lo que permite una mayor reproducibilidad de los resultados, lo que puede implicar el uso de un menor número de animales en un experimento y una menor variabilidad de resultados entre un mismo ^grupo17,18.

Perides et al. (2010)¹⁴ publicaron un protocolo para la inducción de AP en ratones por infusión de taurocolato de sodio. Aquí actualizamos este modelo utilizando una mayor concentración de taurocolato de sodio (2,5%) en ratones C57BL/6, con un volumen y velocidad de infusión definidos (Figura 1). El nivel máximo de gravedad se alcanza dentro de las 12 h de la inducción en ratones. La elevación de la concentración de IL-6 tanto en el suero como en la cavidad peritoneal se correlaciona con la progresión de la PA. Con la práctica, el tiempo total estimado desde la inducción de la anestesia hasta la finalización de la infusión, es de 25 min por animal. Es esencial que un investigador capacitado realice este experimento. Para asegurarse de que la solución se inyecta correctamente en el conducto biliar común, realice varias sesiones de entrenamiento piloto utilizando azul de metileno en lugar de taurocolato de sodio.

Protocolo

Este protocolo fue aprobado por el Comité de Ética para el uso de animales de la Facultad de Medicina de la USP, Num. Proyecto: 1343/2019-CEUA: FMUSP. Para este protocolo se utilizaron ratones C57BL/6, de 6 semanas de edad, con un peso de 20 ± 2 g (n = 9/grupo).

1. Laparotomía

1. Anestesiar a los animales con xilazina (10 mg/kg) y solución de ketamina (80 mg/kg), por vía subcutánea (0,1 ml/10 g de peso corporal) utilizando una jeringa de 1 ml y una aguja de 13x0,45 mm 26G 1/2. Compruebe si hay suficiente profundidad de anestesia pellizcando el dedo del pie. Controle la temperatura corporal con almohadillas térmicas. Asegúrese de que todos los materiales quirúrgicos sean estériles.
2. Limpie el área abdominal con una solución de povidona yodada al 5% y use un recortador para eliminar el vello entre el pecho y la parte inferior del abdomen (aproximadamente 2 ^cm2). Limpie el área quirúrgica con alcohol al 70%.
3. Inmovilizar al animal en el tablero quirúrgico usando cinta quirúrgica. Use tijeras para cortar 5 mm de la piel horizontalmente, en la parte superior del abdomen y 1 cm por debajo del proceso xifoide. Repita el corte en el peritoneo. Esto dará como resultado una laparotomía con una exposición mínima de la cavidad.

2. Localizar y exponer el páncreas

1. Con la ayuda de un retractor, tire del hígado hacia la cabeza del ratón, ~ 1 cm del intestino.
2. Localice la región del páncreas a la que se le inyectará taurocolato de sodio (cabeza del páncreas). Ubique el duodeno con referencia al hígado, debajo del hígado, en el lado derecho (a la izquierda como se ve el ratón). El duodeno es la primera parte del intestino delgado y está conectado a la porción final del estómago.
3. Con la ayuda de fórceps, levante el hígado hacia la cabeza del animal y tire suavemente de la porción del intestino delgado. Fije los dos extremos laterales del intestino delgado con una sutura de polipropileno 6-0 para ver mejor la porción distal del conducto biliar común.

3. Inducción de pancreatitis aguda grave

1. Ocluya temporalmente el conducto biliar común proximal con un clip de microvasos para evitar que la infusión retrógrada se filtre en el hígado. El conducto biliar común se puede ver en el lado hepático del duodeno y su unión con el duodeno aparecerá blanca. Exponga el órgano fuera de la cavidad abdominal.
2. Punción de la región periampular (parte blanquecina de la pared del intestino delgado) para acceder al conducto biliar común con una aguja de 0,4 mm conectada a un tubo de polietileno de 0,54 mm.
3. Hacer una oclusión temporal del conducto biliar común distal con 8-0 sutura para evitar que la solución de taurocolato de sodio se filtre en el duodeno.
4. Inicie la bomba de perfusión y programe una infusión de solución de taurocolato de sodio al 2,5% (diluida en solución salina al 0,9%) a una velocidad constante de 10 μL/10 g de peso corporal durante 3 min.
5. Después de la infusión, retire el clip de microvaso, el temporal 8-0 sutura y la aguja de inyección del conducto pancreático biliar para reconstituir el flujo fisiológico de la bilis.
6. Al final, suture el abdomen con 6-0 sutura de polipropileno monofilamento no absorbente. El tiempo entre la laparotomía y la sutura final debe ser de un máximo de 30 min (ver Figura 1).
7. Después de la cirugía, aloje a los animales en cajas de polietileno forradas con virutas de madera y agua y alimentos ad libitum.
8. Trate a los ratones de control de la misma manera que a los ratones experimentales, pero asegúrese de que la infusión consista solo en solución salina. Realizar el procedimiento quirúrgico y la infusión de solución salina (10 ml/min, durante 3 min) en un grupo control (SHAM) para eliminar el sesgo inflamatorio causado por la cirugía y la canulación.
9. Use tramadol 12,5 mg/kg por vía subcutánea cada 8 horas, comenzando después de la recuperación postquirúrgica.

4. Métodos de análisis

1. A las 12 h después de la inducción de AP, anestesiar a los animales con xilazina (10 mg/kg) y ketamina (80 mg/kg) para recolectar aproximadamente 250 μL de sangre a través del plexo orbitario.
   1. Sostenga suavemente la piel en la espalda, promoviendo una ligera protuberancia del globo ocular, y colóquelo con el ojo hacia arriba.
   2. Inculque una gota de ungüento para los ojos que contenga anestésico local en el ojo del animal.
   3. Coloque el extremo del tubo capilar en la esquina medial del ojo e insértelo suavemente debajo del globo ocular, con un ángulo de ~ 30 ° -45 °. Gire el tubo capilar hasta que comience el flujo sanguíneo. Recuerde que no es necesario usar la fuerza para el procedimiento.
   4. Una vez finalizada la recolección, asegure la homeostasis manteniendo los párpados cerrados por compresión ligera con la gasa. Deseche el tubo capilar en el contenedor de objetos ^punzantes19.
   5. Centrifugar el suero (700 x g, 15 min) y almacenar el sobrenadante para la dosis de amilasa e IL-6 (pasos 4.7 y 4.8).
2. Sacrificar ratones por asfixia de _CO2 .
3. Use una aguja de 27 G para inyectar 4 ml de 1x PBS helado en la cavidad peritoneal. Tensar la piel abdominal y asegurarse de que la aguja se empuja lentamente en el peritoneo para no perforar ningún órgano. Después de la inyección, masajee suavemente el peritoneo durante 10 s para eliminar las células adheridas al peritoneo.
4. Usando tijeras y pinzas, haga un pequeño corte (0,5 cm) en la piel interna y la musculatura para exponer la cavidad abdominal. Inserte una pipeta de bulbo en el peritoneo y recoja el líquido. Tenga cuidado de no aspirar tejido graso u otros órganos.
5. Recolecte la mayor cantidad de líquido posible y deposite la suspensión celular recolectada en tubos mantenidos en hielo. Deseche la pipeta de la bombilla en el contenedor de objetos ^punzantes20. Centrifugar el líquido peritoneal (250 x g, 5 min) y almacenar el sobrenadante para la dosificación de IL-6 (paso 4.9).
6. Recoger la región del páncreas adyacente al duodeno (<5 mm).
7. Procesa el páncreas fijando en formalina al 10% e incorpóralo a la parafina.
   1. Tiñe los portaobjetos con hematoxilina y eosina para análisis histopatológicos bajo microscopía de luz. Utilice el protocolo de ^Schmidt21 (edema pancreático, célula acinar, lesión/necrosis, inflamación pancreática) para evaluar la extensión de la PA.
8. Mida la amilasa (U/dL) utilizando kits disponibles comercialmente de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
9. Mida IL-6 mediante ensayos Luminex utilizando kits comerciales de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
10. Guarde el suero y el sobrenadante de líquido peritoneal obtenidos en los pasos 4.1 y 4.4 en un congelador a -80 °C si es necesario.

Resultados

La gravedad de la pancreatitis se puntuó entre 0-3 según la escala de ^Schmidt21 donde cero corresponde a la ausencia, 1 corresponde a una presencia leve (<25%), 2 corresponde a una presencia moderada (entre 25 y 50%) y 3 corresponde a una presencia intensa (> 50%) (Tabla 1). Las mediciones realizadas fueron actividad plasmática de la amilasa, edema pancreático, célula acinar, lesión/necrosis, inflamación pancreática (por análisis histológ...

Discusión

El método de inducción de la pancreatitis aguda por infusión retrógrada de taurocolato de sodio ya se ha demostrado en ^{ratas22,23,24}. Tres trabajos similares, publicados en 2008, 2010 y 2015, sirvieron de referencia para el protocolo3,14,15. En este trabajo, enumeramos todos los pasos críticos para reproducir este método en ratone...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4 mm needle	INTRAG MEDICAL TECH	90183210	30G
0.54 mm polyethylene tube	Tygon	730010	-
Styrofoam block	-	-	-
masking tape for mounting the mouse	Missner	1236	-
Infusion pump scheduled to 10µL / min.	Havard aparatus-Peristaltic Pump Series	MA1 55-7766	Model 66 Small Peristaltic
Scissors and forceps
Antiseptic providine iodine	Pfizer	12086OR	antisepsis
70% ethanol	SIGMA	459836	Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O
Razor blade	Lord	bdk9a1ghk6	For trichotomy
Sodium taurocholate	Sigma-Aldrich	86339- 1G	CAS NUMBER- 345909-26-4
microvessel clip	Medicon Surgical	56.87.35	Approximator, opening 4.0 mm, closing pressure 30 - 40 g
6-0 prolene	Bioline	5162	Suture line
Ketamin NP (cloridrato de dextrocetamina) 50mg/mL	Cristália
Xilazine 2%	Syntec
Sterile saline solution (0.9% (wt/vol) saline)	Farmace	105851
Methyl Blue	Sigma-Aldrich Chemicals	M5528
MILLIPLEX MAP Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel - Immunology Multiplex Assay	MERCK	MCYTOMAG-70K	Simultaneously analyze multiple cytokine and chemokine biomarkers with Bead-Based Multiplex Assays using the Luminex technology, in mouse serum, plasma and cell culture samples.
Amylase Assay	Labtest	11
Desmarres retractor 13-mm width	ROBOZ	RS-6672