נתרן Taurocholate המושרה חמור דלקת לבלב חריפה ב C57BL/6 עכברים

Summary

מודלים של בעלי חיים לדלקת לבלב חריפה חמורה מאפשרים לחקור שינויים פתופיציולוגיים בשלב הראשוני, ומאפשרים התבוננות בהתפתחות של אירועים דלקתיים. כאן אנו מספקים פרוטוקול עבור אינדוקציה של דלקת לבלב מרה חריפה חמורה על ידי עירוי מדרדר של נתרן taurocholate לתוך צינור הלבלב של עכברי C57BL/6 מרדים.

Abstract

אינדוקציה דלקת לבלב חריפה מרה על ידי עירוי נתרן taurocholate כבר בשימוש נרחב על ידי הקהילה המדעית בשל ייצוג של המצב הקליני האנושי רבייה של אירועים דלקתיים המתאימים לתחלת דלקת הלבלב המרה קלינית. ניתן להעריך את חומרת הנזק בלבלב על ידי מדידת הריכוז, המהירות והנפח של חומצת המרה המושרשת. מחקר זה מספק רשימת פעולות לביצוע מעודכנת של החומרים והשיטות המשמשים ברביית הפרוטוקול ומראה את התוצאות העיקריות ממודל דלקת הלבלב החריפה (AP). רוב הפרסומים הקודמים הגבילו את עצמם לשחזור מודל זה בחולדות. יישמנו שיטה זו בעכברים, המספקת יתרונות נוספים (כלומר, הזמינות של ארסנל של ריאגנטים ונוגדנים עבור בעלי חיים אלה יחד עם האפשרות לעבוד עם זנים מהונדסים גנטית של עכברים) שעשויים להיות רלוונטיים למחקר. עבור אינדוקציה דלקת לבלב חריפה בעכברים, אנו מציגים פרוטוקול שיטתי, עם מנה מוגדרת של 2.5% נתרן taurocholate במהירות עירוי 10 μL / min במשך 3 דקות C57BL / 6 עכברים שמגיע לרמה המקסימלית של חומרה בתוך 12 שעות של אינדוקציה ולהדגיש תוצאות עם תוצאות המאמתות את השיטה. עם תרגול וטכניקה, הזמן המשוער הכולל, מן האינדוקציה של הרדמה עד השלמת עירוי, הוא 25 דקות לכל חיה.

Introduction

אצל בני אדם, נוכחות של אבני מרה היא הגורם הנפוץ ביותר לדלקת הלבלב עקב חסימת החלק הסופי של choledochal, הפרעה לזרימה של הפרשות הלבלב וגרימת תהליך דלקתי אינטנסיבי בלבלב, עם עלייה בריכוז אנזימי העיכול בסרום ומתווכים ^{דלקתיים1,2}.

שתי תיאוריות שונות הוצעו כדי להסביר את ההתפתחות של דלקת לבלב חריפה (AP). תיאוריית "הערוץ המשותף" מציעה כי האבנים הנמצאות בכיס המרה חוסמות את מערכת צינור המרה הנפוצה הדיסטלית, ומאפשרות להפרשת מרה לזרום מדרדרות לתוך צינור הלבלב. התיאוריה השנייה (תיאוריית "חסימת צינור") מציעה כי חסימת צינור הלבלב על ידי אבני מרה עודפות גורמת לחסימה בזרימת הפרשת הלבלב לתריסריון, וגורמת ליתר לחץ דם ^דביק3. למרות המנגנונים המובילים דלקת לבלב מרה חריפה אינם מובנים במלואם, התוצאה היא תהליך דלקתי אינטנסיבי. התפרצות אנזימי עיכול ועיכול עצמי בלבלב מובילים לשינויים היסטופתולוגיים, לעלייה בציטוקינים דלקתיים (IL-1β, IL-6, TNF-α) בנוזל אסיטי ובנסיוב, ולעלייה בחלבוני פאזה חריפים4,5,6.

דלקת לבלב חריפה חמורה היא מצב שראוי לתשומת לב קלינית בשל מעורבות של איברים מרובים וסיכון תמותה גבוה. מודלים בעלי חיים להתרבות של דלקת לבלב חריפה (AP) חשובים כמו אלה להסביר את המנגנונים הפתופיזיולוגיים של המחלה ולעזור ניטור האבולוציה של אירועים דלקתיים, החל מהשלבים הראשונים של המחלה. זה בדרך כלל לא אפשרי ^{במרפאות2,7}. בנוסף, גישה לרקמות הלבלב קלה במחקרים פרה-קליניים, לטובת ההבהרה של שינויים הקשורים לתנאים ^{קליניים8} יחד עם האפשרות לעבוד עם מינים איזוגניים, ביטול משתנים לא רצויים, ושיקוף דמיון קליני עם התוצאות שנצפו במצב ^{האנושי9}.

מודלים מרה ולא מרה עבור אינדוקציה של דלקת לבלב חריפה בחולדות ומינים של עכברים נחקרו לעתים קרובות בספרות המדעית. שיטות אינדוקציה שאינן מרה כוללות מתן מינונים מגרה סופרמקימליים של סודהוג cholecystokinin או cerulein ^{אנלוגי שלה10}; ניהול של מינונים כמעט קטלניים של L-ארגנין; או ניהול של דיאטה כולין לקוי בתוספת ^אתionine11. למרות שיטות אלה קל להתרבות ולגרום דלקת הלבלב, הם אינם לשכפל את המנגנונים כי בתיאוריה לעורר AP (כלומר, ריפלוקס של הפרשת מרה לתוך צינור הלבלב). הטכניקה המטפלת במודל המרה מבוססת על עירוי מדרדר של חומצות מרה לתוך צינור הלבלב ודורש חוקרים מאומנים היטב לבצע פרוטוקול זה. מספר מחקרים פורסמו בשיטה זו בחולדות (ככל הנראה מסיבות טכניות מאז ניסויים אלה כרוכים בהליכים כירורגיים)^12,13. עם זאת, הגישה בעכברים עשויה להציע תוצאות מעניינות יותר בחקר דלקת3,14,15. במחקר זה, אנו מראים רשימה של השלבים שיש לעקוב אחר להתרבות של דלקת לבלב חריפה חמורה על ידי עירוי של נתרן taurocholate ב C57BL / 6 עכברים מרדים.

עבור עבודות הכרוכות בצורך בניסויים בנוגדנים וניתוח של ביטוי הגן והחלבון, השימוש בעכברים עדיף בגלל הארסנל הגדול יותר של חומרים עבור בעלי חיים אלה והאפשרות לעבוד עם מינים איזוגניים ונוקאאוט, בין היתר שניתן להשתמש בהם רלוונטיים ^{למחקרים16}. עכברים C57BL/6 הוא זן לידה של עכברים שפותח במקור לחקר פעילות אנטי-טמור ואימונולוגיה. זן זה מועדף יותר ויותר על ידי החוקרים על היותו איזוגני, ומאפשר רבייה גדולה יותר של תוצאות, אשר עשוי לרמוז על שימוש במספר קטן יותר של בעלי חיים בניסוי ופחות שונות של תוצאות בין אותה ^{קבוצה17,18}.

Perides et al. (2010)¹⁴ פרסם פרוטוקול עבור אינדוקציה AP בעכברים על ידי עירוי נתרן taurocholate. כאן אנו מעדכנים את המודל הזה בריכוז נתרן טאורוכולאט גבוה יותר (2.5%) בעכברים C57BL/6, עם נפח ומהירות מוגדרים של עירוי (איור 1). הרמה המקסימלית של חומרה מגיעה בתוך 12 שעות של אינדוקציה בעכברים. העלאת הריכוז של IL-6 הן בסרום והן בחלל הצפק מתואמת עם ההתקדמות של AP. עם תרגול, הזמן המשוער הכולל מן אינדוקציה של הרדמה עד השלמת עירוי, הוא 25 דקות לכל חיה. זה חיוני כי חוקר מיומן מבצע את הניסוי הזה. כדי להבטיח כי הפתרון מוזרק כראוי לתוך צינור המרה המשותף, לבצע מספר אימונים פיילוט באמצעות מתילן כחול במקום נתרן taurocholate.

Protocol

פרוטוקול זה אושר על ידי ועדת האתיקה לשימוש בבעלי חיים של בית הספר לרפואה USP, מספר פרויקט: 1343/2019-CEUA: FMUSP. עבור פרוטוקול זה, עכברי C57BL/6, בגילאי 6 שבועות, במשקל 20 ± 2 גרם שימשו (n = 9/קבוצה).

1. לפרוסטומיה

1. בעלי חיים מרדים עם קסילאצין (10 מ"ג/ק"ג) ופתרון קטמין (80 מ"ג/ק"ג), באופן תת עורי (0.1 מ"ל / 10 גרם של משקל גוף) באמצעות מזרק 1 מ"ל ומחט 13x0.45 מ"מ 26G 1/2. בדוק עומק הרדמה מספיק על ידי צביטת בוהן. שלטו בטמפרטורת הגוף באמצעות רפידות מחוממות. ודא כי כל החומרים הכירורגיים הם סטריליים.
2. נקו את אזור הבטן עם תמיסה של 5% פוידון-יוד והשתמשו בגוזם להסרת השיער בין החזה לבטן התחתונה (כ-2 ס"^מ2). נקה את האזור הכירורגי עם 70% אלכוהול.
3. לשתק את החיה על הלוח הכירורגי באמצעות סרט ניתוחי. השתמש במספריים כדי לחתוך 5 מ"מ של העור אופקית, על החלק העליון של הבטן ו 1 ס"מ מתחת לתהליך xiphoid. חזור על החתך על צפק. התוצאה תהיה לפרוסטומיה עם חשיפה מינימלית של החלל.

2. איתור וחשיפת הלבלב

1. בעזרת מפסק, למשוך את הכבד לכיוון ראשו של העכבר, ~ 1 ס"מ מן המעי.
2. אתר את אזור הלבלב שיוזרק עם נתרן taurocholate (ראש הלבלב). אתר את התריסריון עם התייחסות לכבד - מתחת לכבד, בצד ימין (בצד שמאל כמו העכבר הוא צפה). התריסריון הוא החלק הראשון של המעי הדק ומחובר לחלק האחרון של הקיבה.
3. בעזרת מלקחיים, הרם את הכבד לכיוון ראש החיה, ומשוך בעדינות את חלק המעי הדק. תקן את שני הקצוות לרוחב של המעי הדק עם תפירת פוליפרופילן 6-0 כדי להציג טוב יותר את החלק הדיסטלי של צינור המרה המשותף.

3. אינדוקציה חמורה של דלקת לבלב חריפה

1. סוחם באופן זמני את צינור המרה המשותף הפרוקסימלי עם קליפ microvessel כדי למנוע עירוי מדרדר מדליף לתוך הכבד. צינור המרה המשותף ניתן לראות בצד הכבד של התריסריון ואת הצומת שלה עם התריסריון ייראה לבן. לחשוף את האיבר מתוך חלל הבטן.
2. לנקב את האזור periampullary (חלק לבנבן של הקיר של המעי הדק) כדי לגשת צינור המרה המשותף עם מחט 0.4 מ"מ מחובר צינור פוליאתילן 0.54 מ"מ.
3. הפוך חסם זמני של צינור המרה המשותף דיסטלי עם 8-0 תפילה כדי למנוע את פתרון נתרן taurocholate מדליף לתוך התריסריון.
4. התחל את משאבת עירוי ולתכנת פתרון נתרן taurocholate 2.5% (מדולל 0.9% מלוחים) עירוי במהירות קבועה של 10 μL / 10 גרם משקל גוף במשך 3 דקות.
5. לאחר עירוי, להסיר את קליפ microvessel, זמני 8-0 תפירה, ומחט ההזרקה מצינור הלבלב המרה כדי לשחזר את הזרימה הפיזיולוגית של המרה.
6. בסוף, לתפר את הבטן עם 6-0 פוליפרופילן מונופילן לאabsorbent. הזמן בין תפר הלפרוטומיה לתפר הקצה צריך להיות 30 דקות לכל היותר (ראו איור 1).
7. לאחר הניתוח, לשכן את בעלי החיים בקופסאות פוליאתילן מרופדים שבבי עץ ומים ומזון ad libitum.
8. לטפל בעכברים שליטה באותו אופן כמו העכברים הניסיוניים אבל להבטיח כי infusate מורכב מלוחים בלבד. בצע את ההליך הכירורגי ואת עירוי של תמיסת מלח (10 מ"ל / דקה, במשך 3 דקות) בקבוצת ביקורת (SHAM) כדי לחסל את ההטיה הדלקתית הנגרמת על ידי ניתוח ו cannulation.
9. השתמש tramadol 12.5 מ"ג/ ק"ג תת עורית כל 8 שעות, החל לאחר התאוששות לאחר הניתוח.

4. שיטות לניתוח

1. ב 12 שעות לאחר אינדוקציה AP, מרדים את בעלי החיים עם קסילאצין (10 מ"ג/ קילוגרם) וקטמין (80 מ"ג / קילוגרם) כדי לאסוף כ 250 μL של דם דרך מקלעת מסלולית.
   1. יש להחזיק בעדינות את העור על הגב, לקדם בלייה קלה של גלגל העין, ולמקם אותו כשהעין פונה כלפי מעלה.
   2. להחדיר טיפה של משחת עיניים המכילה הרדמה מקומית בעין החיה.
   3. מקם את קצה הצינור הנימי בפינה המהוכלת של העין והכנס אותו בעדינות מתחת לגלגל העין, עם זווית של ~ 30 ° - 45 °. סובב את הצינור הנימי עד שזרימת הדם תתחיל. זכור כי אין צורך להשתמש בכוח עבור ההליך.
   4. לאחר שהאוסף נגמר, ודא הומאוסטזיס על ידי שמירה על העפעפיים סגורים על ידי דחיסת אור עם גזה. להשליך את הצינור נימי במיכל ^חדה19.
   5. צנטריפוגה הסרום (700 x g, 15 דקות) ומלא את supernatant עבור עמילאז IL-6 מנונים (שלב 4.7 ו 4.8).
2. המתת חסד עכברים על ידי חנק _CO2 .
3. השתמש במחט 27 G כדי להזריק 4 מ"ל של PBS קר כקרח 1x לתוך חלל הצפק. Tened עור הבטן ולוודא כי המחט נדחפת לאט בצפק כדי לא לנקב את כל האיברים. לאחר ההזרקה, לעסות בעדינות את הצפק במשך 10 s כדי להסיר תאים דבק צפק.
4. באמצעות מספריים ופינצטה, לעשות חתך קטן (0.5 ס"מ) על העור הפנימי והשרירים כדי לחשוף את חלל הבטן. הכנס פיפטת נורה בצפק ולאסוף את הנוזל. היזהר לא לשאוף רקמת שומן או איברים אחרים.
5. לאסוף נוזלים רבים ככל האפשר ולהפקיד את השעיית התא שנאסף בצינורות נשמר על קרח. השלך את פיפטת הנורה במיכל ^החדות20. צנטריפוגה של נוזל הצפק (250 x g, 5 דקות) ומלא את supernatant עבור IL-6 מינון (שלב 4.9).
6. לאסוף את אזור הלבלב הסמוך לתריסריון (<5 מ"מ).
7. לעבד את הלבלב על ידי תיקון 10% פורמלין ולשלב אותו לתוך פרפין.
   1. להכתים את השקופיות עם המטוקסילין ואוסין לניתוחים היסטופתולוגיים תחת מיקרוסקופיה קלה. השתמש בפרוטוקול ^{של שמידט21} (בצקת בלבלב, תא אנסינאר, פציעה/נמק, דלקת בלבלב) כדי להעריך את היקף AP.
8. מדוד עמילאז (U/dL) באמצעות ערכות זמינות מסחרית בהתאם להמלצות היצרן.
9. מדד IL-6 על ידי בדיקות Luminex באמצעות ערכות מסחריות בהתאם להמלצות היצרן.
10. יש לאחסן את הסרום ואת נוזל צפק supernatant המתקבל בשלבים 4.1 ו 4.4 במקפיא ב -80 °C (80 °F) במידת הצורך.

תוצאות

חומרת דלקת הלבלב קיבלה ציון בין 0-3 על פי סולם ^שמידט21 שבו אפס מתאים להיעדרות, 1 מתאים לנוכחות קלה (<25%), 2 מתאים לנוכחות מתונה (בין 25 ל -50%) ו -3 תואמת לנוכחות אינטנסיבית (> 50%) (טבלה 1). המדידות שבוצעו היו פעילות עמילאז פלזמה, בצקת הלבלב, תא acinar, פציעה / נמק, דלקת ?...

Discussion

השיטה של גרימת דלקת לבלב חריפה על ידי עירוי נתרן taurocholate מדרדר כבר הוצג חולדות22,23,24. שלוש יצירות דומות, שפורסמו בשנים 2008, 2010 ו-2015, שימשו התייחסות לפרוטוקול3,14,15. בעבודה זו, אנו מפרטים את כל הש...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4 mm needle	INTRAG MEDICAL TECH	90183210	30G
0.54 mm polyethylene tube	Tygon	730010	-
Styrofoam block	-	-	-
masking tape for mounting the mouse	Missner	1236	-
Infusion pump scheduled to 10µL / min.	Havard aparatus-Peristaltic Pump Series	MA1 55-7766	Model 66 Small Peristaltic
Scissors and forceps
Antiseptic providine iodine	Pfizer	12086OR	antisepsis
70% ethanol	SIGMA	459836	Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O
Razor blade	Lord	bdk9a1ghk6	For trichotomy
Sodium taurocholate	Sigma-Aldrich	86339- 1G	CAS NUMBER- 345909-26-4
microvessel clip	Medicon Surgical	56.87.35	Approximator, opening 4.0 mm, closing pressure 30 - 40 g
6-0 prolene	Bioline	5162	Suture line
Ketamin NP (cloridrato de dextrocetamina) 50mg/mL	Cristália
Xilazine 2%	Syntec
Sterile saline solution (0.9% (wt/vol) saline)	Farmace	105851
Methyl Blue	Sigma-Aldrich Chemicals	M5528
MILLIPLEX MAP Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel - Immunology Multiplex Assay	MERCK	MCYTOMAG-70K	Simultaneously analyze multiple cytokine and chemokine biomarkers with Bead-Based Multiplex Assays using the Luminex technology, in mouse serum, plasma and cell culture samples.
Amylase Assay	Labtest	11
Desmarres retractor 13-mm width	ROBOZ	RS-6672