革兰阴性细菌败血症的新生儿成像模型

摘要

新生儿小鼠感染生物发光大肠杆菌O1:K1:H7导致败血症感染，引起严重的肺部炎症和肺部病理。 在这里，我们描述了使用纵向病毒内成像对新生儿败血症进行建模和进一步研究的程序，同时列举全身细菌负担、炎症特征分析和肺组织病理学。

摘要

新生儿在生命最初几个月表现出独特的免疫特征，因此患细菌败血症的风险增加。我们已经建立了一个协议，用于研究 大肠杆菌 O1:K1:H7的发病机制，这是一种对新生儿高死亡率负责的血清型。我们的方法利用在感染过程中不同时间点的新生儿幼崽的病毒内成像。这种成像与血液中细菌的测量、炎症特征和组织组织病理学的测量平行，意味着对败血症期间的感染动态的严格理解。在本报告中，我们模拟了两种传染性接种，以比较细菌负担和疾病严重程度。我们发现，亚皮外感染导致感染后10小时传播感染。到24小时，发光 大肠杆菌的感染在 血液、肺和其他周围组织中是丰富的。肺部炎症细胞因子的表达在24小时时显著，随后是细胞渗透和组织损伤的证据，随着感染剂量的增加。病毒内成像确实有一些局限性。这包括发光信号阈值和麻醉期间新生儿可能出现的一些并发症。尽管存在一些局限性，我们发现我们的感染模型为了解新生儿毛虫败血症期间的纵向感染动态提供了见解，而迄今为止，这种感染模型尚未经过彻底检查。我们预计这个模型也可以适应研究其他关键的细菌感染在早期生活。

引言

细菌败血症是新生儿的一个重大关注，在生命的最初几天表现出独特的免疫特征，不能提供足够的保护，免受感染^1。新生儿败血症仍然是美国严重的医疗保健问题，仅^美国每年就有75，000多例。为了深入研究这些感染，需要新的动物模型来概括人类疾病的各个方面。我们已经建立了一个新生儿小鼠感染模型使用大肠杆菌，O1:K1:H7^3。大肠杆菌是导致美国新生儿败血症的第二大原因，但占败血症相关死亡率^的4，5。然而，当早产儿和极低出生体重（VLBW）婴儿被独立考虑5时，这是^{主要的原因}。K1血清型最常与侵入性血液感染和脑膜炎在新生儿^6，7。目前，除了抗生素和支持性护理之外，没有其他治疗选择。同时，许多致病菌的抗生素耐药率继续上升，一些大肠杆菌菌株对^治疗中常用的多种抗生素具有耐药性。因此，我们必须继续制定方法，研究新生儿败血症的机制和宿主反应。这些结果可以帮助改善目前的治疗和感染结果。

与成人相比，新生儿的免疫状态具有表型和功能差异的特点。例如，抗炎和调节细胞因子的升高水平，如白细胞间（IL）-10和IL-27，已被证明由脐带血衍生的巨噬细胞产生，并存在于更高水平的穆林新生儿^{9，10，11。}这与与成人^{10 α}中经常报告的Α、IFN-ɣ、IL-12和TNF-α水平一致。此外，与¹²岁的成年人相比，新生儿免疫系统偏向于Th2和调节T细胞反应。新生儿中也存在增加的嗜中性粒细胞、T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞，但有显著的功能损伤。这包括细胞表面标记和抗原表达的缺陷，表明不成熟13，14，15。此外，新生儿中性粒细胞在迁移到化疗因子¹⁶的能力上明显不足。骨髓源抑制细胞（MDSC）在新生儿的高水平也被发现，最近被证明是IL-27^11的来源。MDSC对T细胞^{17具有很强的抑制性}。总的来说，这些数据表明新生儿免疫力有限，增加了感染的易感性。

为了研究新生儿败血症期间细菌负担的进展和保护性宿主免疫反应，我们开发了一种新的感染模型。新生儿小鼠在3-4天的生活是很难注射在内皮内空间或尾静脉。在我们的模型中，第3天或第4天幼崽被施用细菌注射或PBS皮下到肩骨区域。全身感染的发展和使用发光 大肠杆菌 O1:K1:H7，我们可以纵向成像个别新生儿小鼠，以遵循周围组织传播的细菌负担。这是首次报告模型，利用病毒内成像，以了解在穆林新生儿3败血症期间传播细菌的^动力学。

在这里，我们描述了一个在新生儿小鼠3 中 诱导化粪池大肠杆菌感染^的协议。我们描述了如何为注射准备细菌注射的内分，以及如何收获组织以评估病理学，通过基因表达分析测量炎症标记，并枚举细菌负担。此外，还介绍了使用发光 大肠杆菌对 受感染的新生儿进行病毒内成像和新生儿免疫细胞细菌杀伤的定量。这些协议也可以适应研究新生儿的其他重要的细菌感染。此处提供的数据代表了在可翻译的新生儿败血症模型中理解感染动态的总体新方法。

研究方案

所有程序都经西弗吉尼亚机构动物护理和使用委员会批准，并根据国家研究委员会18日根据《实验室动物护理和使用指南》^{的建议进行}。

1. 细菌性内分的制备

1. 条纹一个尝试大豆糖（TSA）板与接种循环隔离从大肠杆菌O1:K1:H7-lux的冰柜库存的单个菌落，稳定地表达荧光酶和携带卡那霉素抵抗^3。在37°C下孵育过夜。
2. 第二天，让 Luria 肉汤 （LB） 进入生物安全柜中的室温 （25 °C）。
3. 在生物安全柜罩下，从条纹板中识别单个菌落，并在 3 mL LB 中接种，并辅以卡那霉素（30 μg/mL）。在37°C下孵育，震动（220转/秒）。这是启动文化。
4. 在生物安全柜罩下将起动机培养物 1:100 稀释成新鲜 3 mL 的 LB，并在 37 °C 下以摇动（220 rpm）将启动培养素返回孵化器 2-3 小时。这就是股票文化。
5. 使用分光光度计读取 600 nm 处的空白和库存培养的光学密度 （OD）。将100μL（不含细菌）加入96井平底检测板的一个井中;这是空白。然后从库存培养中添加 100 μL 到单独的井中。重复两个额外的复制。使用板读卡器读取吸光度。
6. 从库存培养量吸收值（OD 值）中减去空白吸收度，并与以前生成和验证的生长曲线进行比较，以确定库存培养剂中细菌密度的近似值，以制备传染性剂量。
7. 根据研究问题生成目标接种。研究使用了每只小鼠（/小鼠）2 x 10⁶ 和7 x^{10 6（} 高）菌落形成单位（CCU）的目标内分。
   1. 将每只小鼠的目标剂量（Dose_T）除以库存培养物（库存）中细菌的估计浓度，以从库存管（V_S）获取所需的细菌量。
   2. 乘以_需要 感染的小鼠数量（N_M），以及足够5-10个额外的细菌，感染所需的细菌总量加上5-10个额外的剂量。从库存管中去除此体积，并将其添加到新的离心管中。
   3. 使用以下等式:
      剂量_T/Stock = V_S x N_M = 从库存管中去除的细菌总量 （V_T）。

8. 在 4 °C 下以 2，000 x g 离心 5 分钟，并每只小鼠将细菌颗粒重新在 50 μL PBS （pH 7.2-7.6） 中重新被感染（例如， 对于每剂量10剂2 x 10⁶ 细菌，2 x 10⁷ 细菌的颗粒将在500μL PBS中重新产生。同样，建议准备比需要的更多的幼崽。仅为控制接种准备等量的 PBS。保持冰上传染性 inoulum 和 PBS 控制，直到感染。
9. 在 96 孔塑料底部稀释板中对 PBS 进行七次 10 倍连续稀释，将 25 μL 的稀释板重复到象限 TSA 板上，并辅以卡那霉素（30 μg/mL），以列举所施用细菌的实际数量。在37°C下孵育，在枚举前孵育殖民地形成。

2. 动物鉴定

1. 安排足够数量的育种对，以便为年龄匹配的幼崽同步散落一地。年龄变化±1天是可以接受的。
2. 确定怀孕的C57BL/6雌性小鼠，并在计划实验之前监测垃圾的出生情况，以准确确定年龄。
3. 要区分对照和受感染的3天或4天大幼崽，使用一对小，细尖的虹膜剪刀，只狙击控制幼崽的尾巴的末端。受感染的幼崽不会收到尾部狙击。在切割尾巴之前，用70%乙醇中喷洒的棉球对皮肤进行消毒。根据需要用棉球或纱布对尾部的尾部施加压力。
   注:此过程在生物安全柜罩下执行。大约1/8英寸的尾部剪一只就足够了。
4. 要识别对照组和受感染群体中的幼崽，请使用 1 mL 胰岛素注射器，用 28 G x 1/2' 永久针头纹身幼崽的尾巴。在纹身之前，用70%乙醇的棉球对皮肤进行消毒。此过程在生物安全机柜罩下执行。
5. 要纹身尾巴，请将动物纹身墨水涂抹在针尖上。接下来，用一只手小心地约束小狗，尾巴完全露出来。轻轻地将针头插入皮肤下，同时保持表面的深度，并将针头与皮肤平行移动几毫米，直到创建一个小标记或点。等待几秒钟，然后慢慢从皮肤下取出针头，以避免多余的墨水从皮肤下释放。
6. 根据需要用棉球或纱布对伤口施加压力。用70%乙醇去除皮肤表面多余的纹身墨水。
7. 重复这个过程与随后的小鼠在感染组和控制组，同时添加一个额外的点与每一个连续的小狗纹身（例如，小狗1将有1点在他们的尾巴，小狗2将有两个点在他们的尾巴，等等）。
   注:对于额外的识别层，建议对控制和受感染群体使用单独的动物纹身墨水颜色。

3. 接种次帽

注:本研究用每个实验指定的低剂量和高剂量组进行了2次实验。在第一个实验中，7只幼崽被给予低剂量接种（4只幼崽用作对子），5只幼崽被给予高剂量（3只幼崽用作对子）。实验1的幼崽只提供了24小时时间点的数据。在第二个实验中，8只幼崽接受了低剂量接种（2只幼崽用作对子），6只幼崽接受了高剂量接种（2只幼崽用作对子）。实验 2 的小狗提供了 0、10 和 24 小时时间点的数据。

1. 年龄匹配幼≤ 1 天。将每个垃圾分配为低剂量或高剂量垃圾。在垃圾中随机分配幼崽作为控制或受感染的幼崽。
2. 在产后第 3 天或第 4 天，记录接种大肠杆菌或 PBS 控制之前所有幼崽的重量。在此期间，将大坝与幼崽分开，以确保它们在感染期间不会移动。
3. 在使用胰岛素针的生物安全柜内，吸气 PBS 或 大肠杆菌。对于这项工作，使用每只鼠标2 x 10⁶ 和7 x 10⁶ CFP的接种。将传染性注射液和 PBS 均留在冰上，直到通过亚胶囊注射进行管理。
4. 将新生儿放在生物安全柜罩的干净表面上，将皮肤放在颈部的尿布上，就像擦伤幼崽一样。
5. 在现在动物的皮肤和肌肉之间创造的空间，插入针头，斜上，就在皮肤下面，并注射50μL的PBS或 大肠杆菌。同时释放皮肤的夹紧部分，以防止注射回流。
6. 缓慢而小心地取出针头。注射完成后，用水坝将幼崽放回去。
   注:由于其解剖阶段的发展，这是技术上的挑战，管理尾静脉或内皮酮注射新生儿幼崽在第3-4天。因此，由于易于执行，因此为本研究选择了亚帽感染途径。

4. 疾病和终点标准的评价

1. 在整个感染期间，每天监测两次幼崽。注意外观的任何异常。
2. 记录权重，作为发病率的客观测量。
3. 除了重量变化外，还通过将新生儿定位在后侧来测试幼崽自我定位的能力。生病的动物将无法转向腹侧和脚上，或将完成这个动作困难。
4. 检查以下情况以标记动物接近终点标准:不到正常体重的85%;运动减少，无法自我选择;皮肤变色，外观更灰暗或透明，而不是粉红色;感觉凉爽的触摸， 指示体温下降和出血性淤青沿两侧， 也指示提前疾病。
   注:如果新生儿在两天内没有增加体重，并且符合步骤 4.4 中的任何描述，则它们符合端点标准。接受高剂量的小狗通常达到终点标准24小时。低剂量和高剂量垃圾中的对照幼崽将同时被安乐死，以便对照组和实验组进行比较分析。转到下面的安乐死部分。

5. 细菌负担的体内成像

1. 使用 microCT 成像仪和软件进行成像和后续分析。
   注:小狗肤色不会影响成像质量。
2. 将笼内 与大肠杆菌-lux感染的新生儿小鼠和大坝放入BSL-2级层状流罩中。取出要成像的小鼠，并放入罩内的透明异氟烃室中。建议从未感染的对控制开始，以测量所需的异氟兰量。
3. 打开连接到 microCT 的计算机上的软件。初始化系统并等待CCD温度锁定在-90°C。
4. 打开异氟蒸发器，将表盘调整为 5% 等氟兰流量。将小鼠与这种异氟混合物保持20-30 s，直到它们停止移动;某些小鼠可能需要更长或更短的麻醉暴露时间。一旦小鼠停止移动，它们就足够麻醉，并且可以成像。
5. 将小鼠移入 microCT 成像室，并将它们放置在易发位置的成像盒上，鼻子朝向垂直于鼻锥体。使用牙蜡轻轻约束成像盒上的脚，以限制任何运动。一次最多可以成像4只新生儿小鼠。
6. 将异氟蒸发器向下转动至2-4%的流量，使小鼠在成像过程中保持麻醉。关闭微CT成像室门。几秒钟后检查小鼠。如果他们开始移动，用异氟将棉球放在异氟中，并按住动物的鼻子移动5秒钟麻醉。在成像过程中，将棉球放在动物附近。小心不要过度麻醉和终止小鼠。
7. 使用该软件，选择用于成像的"发光"选项。使用"阻塞"的激励滤波器，将发射滤波器设置为"打开"，520 nm、560 nm、580 nm、600 nm 和 620 nm。 将有七个用于发光的总排放过滤器。
8. 在每个时间点（0、10 和 24 h 感染后 [hpi]）对鼠标进行图像成像，并保存每个时间点的所有图像到文件夹。把幼崽和水坝一起回到笼子里，检查所有的幼崽都已经从麻醉中恢复过来。
9. 要分析 2D 图像，请打开软件中的图像。将单位更改为辐射（光子）;这将变成总通量（光子/秒）。
10. 一次仅分析一个图像集及其多个发射滤波器。在每个图像集中，记下位于每个图像右下角的最小和最大辐射值（例如，如果有 7 个发射滤镜，则有 7 个图像，以及 7 个最小值和最大值）。对要比较的每个图像集重复。
11. 要确定包含所有图像的值和亮度的刻度，请找到每个图像集的最低最小值和最高最大值。在这项研究中， 使用开放 滤镜图像作为代表性。
    1. 突出显示并打开选择的图像以更改比例。在" 工具调色板"上，单击 "图像调整 "选项卡， 将"颜色比例 "更改为以前标识的最低最小值和最大值。将每个图像集另存为 TIFF。以这种方式单独分析每个时间点，以确保显示正确的比例。
12. 要量化每只鼠标的总通量（每只鼠标的发光信号量），请打开步骤 5.9-5.10 中前面描述的图像。打开工具 调色板上的 ROI 工具选项卡 并选择圆圈工具。如果 分析一 个发光区域，请选择 1 个圆。
13. 将 ROI 移动到 发光区域的叠加。如有必要，调整 ROI 的大小。
    注:如果需要调整，请比较地调整其他图像中的 RBI 以保持一致性。选择度量值 PI。ROI 测量窗口将打开，显示总通量 （p/s），平均辐射（p/s/cm²/sr），辐射标准偏差，最小辐射和最大辐射。
14. 记录每个图像集的总通量测量值。此数字是 2D 图像中鼠标中亮度的量化量。
15. 要制作 3D 重建微CT图像，请打开工具调色板上的DLIT 3D 重建面板，并检查要包含在"分析"选项卡下的所有波长。

6. 安乐死

1. 为有关组织/器官准备和标记管，用于进行尸检和适当的下游应用。
2. 将新生儿与大坝分离在生物安全柜中。
3. 将棉球浸泡在兽医级异氟烃中，并放在透明密封室内。
4. 如果采集血液，准备一个P200微管与尖端，并具有一个1.5 mL管与10μL的5 mM EDTA作为抗凝剂。预计血液量为50-200微升。
5. 将新生儿放在室内，并监控幼崽，直到它变得一动不动。
6. 快速，用剪刀清除新生儿并斩首。如果允许长时间呼吸新鲜空气，幼崽可以恢复知觉。与成年小鼠相比，新生儿的肺活量已经下降，因此，仅靠异氟作用对安乐死呼吸不够深。
7. 使用 P200 微管从头部底部的树干收集血液。为了最大限度地增加采集的血液量，在斩首后尽快执行此步骤。如步骤1.9所述，通过连续稀释和标准板计数来枚举血液中的细菌。
8. 在切除组织样本之前，用70%的乙醇对整个新生儿进行消毒。

7. 组织收获

1. 在生物安全柜内，用70%乙醇给新生儿注入乙醇，以防止污染。把动物放在它的右边。
2. 使用钳子，抓住腹部和左后腿之间的一个点的皮肤，用细尖的手术剪刀做切口。继续切割皮肤向上朝背部移动。进展，直到整个脾脏暴露。
3. 使用钳子抓住脾脏，然后从腹部取出，用剪刀断开结缔组织。将脾脏放在适合其下游应用的溶液中。
4. 要获得肺，完全剥回胸部的皮肤。
5. 进入胸骨底部，用剪刀垂直保持，向上切割，直到肋骨笼分裂。
6. 使用钳子分别抓住左右肺，并将其从胸腔中去除。用剪刀切掉心脏。
7. 将肺放在适合其下游应用的溶液中。对于RNA分离，使用500μL的瓜尼丁硫氰酸酯/苯酚（GTCP）。对于病理学，使用 5 mL 的 10% 中性缓冲形式。

8. 从肺组织分离用于基因表达的RNA

1. 将微离心预冷却至4°C。
2. 用剪刀在GTCP中切碎肺组织。接下来，使用电池供电的均质器使组织均质化。继续，直到解决方案尽可能均匀。在室温下孵育3-5分钟。
3. 使用过滤移液器尖端，加入100μL的氯仿。反转管15秒，在室温下孵育3-5分钟。
4. 在 12，000 x g 下离心 15 分钟。
5. 在旋转过程中，用 500 μL 的 70% 乙醇制备 1.5 mL 管。从RNA隔离试剂盒中组装并标记柱和收集管。
6. 小心地去除顶部水层，而不会干扰离心过程中形成的相间层。将水层放在含有70%乙醇的管子中。
7. 将乙醇和糖分离混合物移动到收集管中的柱。
8. 从这一点开始，遵循RNA分离试剂盒商业产品协议，直到RNA最终洗脱。
9. 分析RNA的纯度和数量。立即使用或在 -80 °C 下存放，直到进一步使用。

9. cDNA合成

1. 给 PCR 管贴上标签并放在一边。
2. 在每个样品的cDNA反应混合物中加入1μgRNA。
3. 如cDNA协议所述，将试剂和模板添加到PCR管中。最后将酶加入混合物中。
4. 将 PCR 管放在具有以下运行设置的热循环器中:25 °C 时 5 分钟，42 °C 时 40 分钟，85 °C 下 15 分钟，最终保持 4 °C。
5. 从热循环器中拆下 PCR 管，立即使用或储存在 -20°C，直到进一步使用。

10. 实时定量 PCR （qPCR） 循环

1. 为要分析的每个基因准备一种反应混合鸡尾酒。每个 15 μL PCR 反应需要 7.5 μL 的 2x 试剂混合物、0.75 μL 的 20X 5' -FAM 标记基因特异性底流器/探针，以及 3.75 μL 无核酸酶水。安普利森通常范围从 60-120 bp。
2. 将每个实验组的3μLcDNA模板添加到相应的油井中。
3. 将12μL的基因特异性反应混合混合物加入适当的井中。
4. 用光学胶粘膜盖住板，离心机1分钟，1，000 x g， 以清除在井中可能形成的任何气泡。
5. 将 PCR 板放在实时 PCR 热循环器中。
6. 将运行方法设置为如下:95 °C 时为 3 分钟，40 个周期为 95 °C，15 秒，然后是 60°C 1 分钟。
7. 通过将感兴趣的基因规范化到内部控制，并使用 2^-++Ct公式和数字的对数转换来分析受感染样本中与未受感染的控制样本的数据。

11. 肺组织学

1. 如上文所述，从新生儿幼崽中去除肺部。
2. 将组织放在10%中性缓冲的甲醛体积中，使溶液与组织的比例在3-7天内约为20:1。
3. 与适当的组织学服务协调石蜡嵌入、切块、赤氧林和 eosin （H&E） 染色。为这项工作，西弗吉尼亚大学历史学核心被利用。或者，按照前面描述的协议¹⁹。

12. 体外细菌杀菌测定

1. 如上文所述，从未感染的新生儿幼崽中取出脾脏，并将其放在无菌 60 mm 培养皿内的 40 μm 尼龙篮子中。重复这一点，将水池池化成一根管子，以收获并一起均质。
2. 添加 5 mL 的 PBS，辅以 10% FBS。
3. 使用无菌 3 mL 注射器柱塞分解组织，直到创建单个细胞悬浮液。
4. 收集尼龙篮外的单细胞悬浮液，转移到 15 mL 离心管，以 350 x g 的颗粒细胞进行 5 分钟。
5. 将细胞悬浮在红血球解液缓冲液中（2 mL，最多7-8个样本），让它在室温下站立5分钟，以消除红细胞。
6. 如上文所述，用 PBS 和颗粒清洗飞溅细胞。
7. 根据预期细胞产量，在0.25 mL的PBS中悬浮飞毛细胞，并辅以0.5%BSA和2 mM EDTA。
8. 使用血细胞计或其他适当的应用计算血小板。
9. 根据制造商协议，用免疫磁珠分离 Ly6B.2⁼ （粒细胞/炎症单核细胞的骨髓体群体） 细胞。
10. 种子Ly6B.2^– 每井密度为1×10⁵ 细胞的细胞，在黑色或白色96井板中，体积为0.1 mL，含有10%FBS、2mM谷氨酰胺和25mM HEPES（完整介质）。
11. 列举第 1 节中描述的 生物发光大肠杆菌，并在 0.1 mL 的最终体积内以所需的感染倍数 （MOI） 准备细菌性。这是最好的完成，通过使所有井在一个共同的MOI批量所需的。
12. 添加0.1 mL的细菌加入或单独完整培养基作为控制。在37°C和5%CO2下孵育多井_板 1小时。
13. 用含有根霉素 （100 μg/mL） 的 0.2 mL 新完整介质更换介质，用移液器轻轻去除介质，并添加新移液器尖端的新鲜介质。将培养本再孵育2小时。
14. 感染后3小时，使用板读卡器从底部测量盖有培养板每井的发光度，然后将培养本返回孵化。
15. 在其他所需时间点重复测量亮度。

结果

该协议诱导新生儿小鼠的细菌败血症，我们使用纵向体内成像，在血液中的细菌枚举，病理学的组织学评估和炎症细胞因子表达配置文件，以研究疾病的过程。在感染大肠杆菌的低（+2 x 10⁶ CCO）和高（+7 x 10⁶ CCO）的新生儿幼崽中观察到发病迹象。 接受较大幼崽的小狗表现出更突出的求救迹象，包括行动不便、无法纠正姿势，以及感染后24小时保持直立姿势的能力受损（hpi）...

讨论

我国诱导新生儿小鼠细菌败血症的亚帽感染模型是实时研究细菌病原体纵向传播的一种新方法。病毒内成像为探索新生儿中细菌实时传播提供了机会。这对于了解细菌传播的动力学和进一步研究宿主反应和疾病适当阶段的损伤至关重要。小鼠幼崽被施用皮下，下皮注射细菌性结节。这种注射技术比其他常用的替代品（如尾静脉和内皮内感染）更简单，因为它在注射部位内需要的精度较低。考虑到?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Insulin Syringe	Coviden	1188128012	Inoculum or PBS injection
10% Neutral Buffered Formalin	VWR	89370-094	Histopathology
ACK Lysis Buffer	Gibco	LSA1049201	Bacterial clearance assay
Animal Tattoo Ink Paste	Ketchum	KI1482039	Animal identification
Animal Tattoo Ink Green Paste	Ketchum	KI1471039	Animal identification
Anti-Ly-6B.2 Microbeads	Miltenyi Biotec	130-100-781	Cell isolation
Escherichia coli O1:K1:H7	ATCC	11775
Escherichia coli O1:K1:H7-lux (expresses luciferase)	N/A	N/A	Constructed in-house at WVU
E.Z.N.A. HP Total Extraction RNA Kit	Omega Bio-tek	R6812	RNA extration
DPBS, 1X	Corning	21-031-CV
Difco Tryptic Soy Agar	Becton, Dickinson and Company	236950	Bacterial growth
IL-1 beta Primer/Probe (Mm00434228)	Thermo Fisher Scientific	4331182	Cytokine expression qPCR
IL-6 Primer/Probe (Mm00446190)	Thermo Fisher Scientific	4331182	Cytokine expression qPCR
iQ Supermix	Bio-Rad	1708860	Real-time quantitative PCR
iScript cDNA Synthesis Kit	Bio-Rad	1708891	cDNA synthesis
Isolation Buffer	Miltenyi Biotec	N/A	Bacterial clearance assay
IVIS Spectrum CT and Living Image 4.5 Software	Perkin Elmer	N/A	Intravital imaging
LB Broth, Lennox	Fisher BioReagents	BP1427-500	Bacterial growth
EASYstrainer (Nylon Basket)	Greiner Bio-one	542 040	Cell strainer
SpectraMax iD3	Molecular Devices	N/A	Plate reader
Pellet Pestle Motor	Grainger	6HAZ6	Tissue homogenization
Polypropylene Pellet Pestles	Grainger	6HAY5	Tissue homogenization
Prime Thermal Cycler	Techne	3PRIMEBASE/02	cDNA synthesis
TNF-alpha Primer/Probe (Mm00443258)	Thermo Fisher Scientific	4331182	Cytokine expression qPCR
TriReagent (GTCP)	Molecular Research Center	TR 118	RNA extration