Gram-Negatif Bakteriyel Sepsisin Yenidoğan Görüntüleme Modeli

Özet

Neonatal farelerin biyolüminesans E. coli O1:K1:H7 ile enfeksiyonu, önemli pulmoner inflamasyon ve akciğer patolojisi ile septik enfeksiyona neden olur. Burada, sistemik bakteriyel yüklerin numaralandırılmasına paralel olarak uzunlamasına intravital görüntüleme, inflamatuar profilleme ve akciğer histopatolojisi ile birlikte neonatal sepsisin modellenmesi ve incelenmesi için yapılan prosedürleri açıklıyoruz.

Özet

Neonates onlar yaşamın ilk aylarında görüntülemek benzersiz bağışıklık profili nedeniyle bakteriyel sepsis riski altındadır. Yeninelerde yüksek mortalite oranlarından sorumlu bir serotip olan E. coli O1:K1:H7 patogenezinin incelenmesi için bir protokol oluşturduk. Yöntemimizde enfeksiyonun ilerlemesi sırasında farklı zaman noktalarında yenidoğan yavrularının intravital görüntülemesi kullanılmaktadır. Kandaki bakterilerin ölçülmesi, inflamatuar profilleme ve doku histopatolojisi ile paralel lik gösteren bu görüntüleme, sepsis sırasında enfeksiyon dinamiklerini anlamak için titiz bir yaklaşım anlamına gelir. Mevcut raporda, bakteriyel yüklerin karşılaştırılması ve hastalığın şiddetini karşılaştırmak için iki enfeksiyöz inokül modellenmiştir. Subscapular enfeksiyonun enfeksiyon sonrası 10 saat ile yaygın enfeksiyona yol açtığını bulduk. 24 saat, Parlak E. coli enfeksiyonu kan, akciğerler ve diğer periferik dokularda bol oldu. Akciğerlerde inflamatuar sitokinlerin ekspresyonu 24 saat önemlidir, ve bu hücresel infiltrasyon ve enfeksiyöz doz ile artar doku hasarı kanıt takip eder. İntravital görüntülemenin bazı sınırlamaları vardır. Bu bir Parlak sinyal eşiği ve anestezi sırasında neonates ile ortaya çıkabilecek bazı komplikasyonlar içerir. Bazı sınırlamalara rağmen, enfeksiyon modelimizin yenidoğan mürin sepsisi sırasında uzunlamasına enfeksiyon dinamiklerini anlamak için bir fikir verdiğini ve bugüne kadar iyice incelenmediğini görüyoruz. Biz bu model de erken yaşam sırasında diğer kritik bakteriyel enfeksiyonları incelemek için adapte edilebilir bekliyoruz.

Giriş

Bakteriyel sepsis^enfeksiyonakarşı yeterli koruma sağlamaz yaşamın ilk günlerinde benzersiz bir bağışıklık profili sergileyen yeniler için önemli bir endişe 1 . Yenidoğan sepsis önemli bir ABD sağlık sorunu sadece^ABD'deyılda 75.000 'den fazla vaka için muhasebe olmaya devam ediyor 2 . Bu enfeksiyonları derinlemesine incelemek için, insan hastalığının yönlerini özetleyen yeni hayvan modelleri gereklidir. Biz Escherichia colikullanarak bir neonatal fare enfeksiyonu modeli kurduk , O1:K1:H7³. E. coli ABD'de yenidoğan sepsisin ikinci önde gelen nedenidir, ancak sepsis ilişkili mortalite çoğunluğu sorumlu^4,5. Ancak, ön dönem ve çok düşük doğum ağırlığı (VLBW) bebekler bağımsız^olarak5 olarak kabul edildiğinde önde gelen nedenidir. K1 serotipi en sık invaziv kan dolaşımı enfeksiyonları ve menenjit ile ilişkilidir^6,7. Şu anda, antibiyotik ve destekleyici bakım dışında başka bir tedavi seçeneği vardır. Bu arada, antibiyotik direnci oranları birçok patojenik bakteriler için artmaya devam, E. coli bazı suşları ile yaygın tedavide kullanılan antibiyotik çok sayıda dirençli⁸. Bu nedenle, sepsis ve ev sahibi tepki mekanizmalarını yeniler üzerinde incelemek için yöntemler üretmeye devam etmek zorunludur. Bu sonuçlar mevcut tedaviler ve enfeksiyon sonuçları üzerine geliştirmek için yardımcı olabilir.

Neonatların bağışıklık durumu yetişkinlere göre hem henotibik hem de fonksiyonel farklılıklar ile karakterizedir. Örneğin, interlökin (IL)-10 ve IL-27 gibi anti-inflamatuar ve düzenleyici sitokinlerin yüksek seviyeleri, kordon kanı kaynaklı makrofajlar tarafından üretildiği gösterilmiştir ve^9,10,11. Bu, yenidoğan hücrelerinden erişkin retlere göre sıklıkla bildirilen IFN-α, IFN-on, IL-12 ve TNF-α düzeylerinin daha düşük olması ile tutarlıdır¹⁰. Ayrıca, neonatal bağışıklık sistemi yetişkinlere göre bir Th2 ve düzenleyici T hücre yanıtı doğru çarpık¹². Nötrofil, T hücreleri, B hücreleri, NK hücreleri ve monositlerin yüksek sayıda da neonatlarda mevcuttur, ancak önemli fonksiyonel bozukluklar ile. Bu hücre yüzey belirteçleri ve immaturity¹³,^14,15öneririz antijen sunumu ifade kusurları içerir. Ayrıca, neonatal nötrofiller kemotaktik faktörlere göç etme kabiliyetlerinde önemli ölçüde eksiktir¹⁶. Miyeloid türetilmiş baskılayıcı hücreler (MKHK) da neonatlarda yüksek seviyelerde bulunur ve son zamanlarda IL-27¹¹kaynağı olarak gösterilmiştir. MKh'ler T hücrelerine karşı son derece bastırıcıdır^17. Bu veriler, yenidoğan bağışıklığında enfeksiyona karşı duyarlılığın artmasına neden olan sınırlamaları toplu olarak göstermektedir.

Neonatal sepsis sırasında bakteriyel yükün ilerlemesini incelemek ve koruyucu konak immün yanıtlarını incelemek için yeni bir enfeksiyon modeli geliştirdik. Yaşamın 3-4 gününde yenidoğan farelerin intraperitoneal uzaya veya kuyruk damarına enjekte etmesi zordur. Bizim modelinde, gün 3 veya 4 yavru skapular bölgeye bakteriyel inoculum veya PBS subkutan olarak uygulanır. Sistemik bir enfeksiyon gelişir ve lüminesanE E. coli O1:K1:H7 kullanarak, periferik dokularda yayılan bakteriyel yükü takip etmek için tek tek yenidoğan farelerini boylamsal olarak görüntüleyebiliriz. Bu, intravital görüntülemeyi kullanarak sepsis sırasında bakterilerin yayılmasının kinetiklerini anlamak için kullanılan ilk rapor edilen modeldir³.

Burada, yenidoğan farelerde septik E. coli enfeksiyonları neden bir protokol tarif³. Bakteriyel inokülün enjeksiyoniçin nasıl hazırlanacağını ve patolojinin değerlendirilmesi için dokunun nasıl hasat edilebildiğini, gen ekspresyonu analizi ile inflamatuar belirteçlerin ölçülmesini ve bakteri yükünün numaralandırmasını anlatıyoruz. Buna ek olarak, enfekte yenidoğan yenidoğanların intravital görüntüleme ve neonatal bağışıklık hücreleri tarafından bakteri öldürme niceliksel için lüminesan E. coli kullanımı da açıklanmıştır. Bu protokoller aynı zamanda yeniniler diğer önemli bakteriyel enfeksiyonları incelemek için adapte edilebilir. Burada sunulan veriler, translatable neonatal sepsis modelinde enfeksiyon dinamiklerini anlamak için genel bir yeni yaklaşımı temsil etmektedir.

Protokol

Tüm prosedürler West Virginia Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri tarafından onaylanmış ve Ulusal Araştırma Konseyi¹⁸tarafından Laboratuvar Hayvanları Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nun tavsiyeleri doğrultusunda yürütülmüştür.

1. Bakteriyel Inokül Hazırlanması

1. Streak bir Tryptic soya agar (TSA) e. coli O1:K1:H7-lux bir dondurucu stok tek bir koloni izolasyon için bir aşılama döngü ile plaka bu stiferase ifade eder ve kanamisin direnci^{taşır 3}. Bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
2. Ertesi gün Luria suyu (LB) oda sıcaklığına (25 °C) bir biyogüvenlik kabininde gelmesine izin verin.
3. Bir biyogüvenlik kabine kaputu altında, çizgili plaka tek bir koloni belirlemek ve kanamisin (30 μg / mL) ile birlikte LB 3 mL aşılamak. Gece boyunca 37 °C'de sallayarak (220 rpm) kuluçkaya yatırın. Bu başlangıç kültürüdür.
4. Başlangıç kültürünü 1:100'ü biyogüvenlik dolabı kaputu altında taze 3 mL LB'ye seyreltin ve 37 °C'de 2-3 saat sallayarak (220 rpm) kuvöze geri döndürün. Bu stok kültürüdür.
5. Bir spektrofotometre kullanarak 600 nm'de hem boş hem de stok kültürünün optik yoğunluğunu (OD) okuyun. 96 iyi düz alt töz plakabir kuyu içine LB (bakteri içeren) 100 μL ekleyin; Bu boş. Daha sonra stok kültüründen ayrı bir kuyuya 100 μL ekleyin. İki ek yineleme için tekrarlayın. Emicilik bir plaka okuyucu kullanılarak okunur.
6. Stok kültürü emici değeri (OD değeri) boş emici çıkarın ve bulaşıcı doz hazırlanması için stok kültüründe bakteri yoğunluğu yaklaşık belirlemek için daha önce oluşturulmuş ve doğrulanmış büyüme eğrisi karşılaştırın.
7. Araştırma sorusuna bağlı olarak hedef inoküller oluşturun. Bu çalışmada fare başına 2 x 10⁶ (düşük) ve 7 x 10⁶ (yüksek) koloni oluşturan üniteler (CPU) hedef inokül kullanılmıştır.
   1. Stok tüpünden (V_S)gerekli bakteri hacmini elde etmek için fare başına hedef dozu (Doz_T)stok kültüründeki (Stok) bakterilerin tahmini konsantrasyonuna bölün.
   2. V_S'i, enfeksiyon için gerekli toplam bakteri miktarı artı 5-10 ek doz için yeterli 5-10 ekstra ile birlikte enfekte edilmesi gereken fare sayısı (N_M)ile çarpın. Stok tüpünden bu hacmi çıkarın ve yeni bir santrifüj tüpüne ekleyin.
   3. Aşağıdaki denklemi kullanın:
      Doz_T/Stok = V_S x N_M = stok tüpünden çıkarılacak bakterilerin toplam hacmi (V_T).

8. Bakterileri 2.000 x g'de 5 dakika 4 °C'de santrifüj edin ve fare başına 50 μL PBS (pH 7.2-7.6) halinde bakteri peletini yeniden askıya alın (örneğin, her doz 2 x 10⁶ bakterinin 10 dozu için, 2 x 10⁷ bakterinin peleti 500 μL PBS'de yeniden askıya alınır). Yine, gerekli olandan daha fazla inokül hazırlamak için tavsiye edilir. Yalnızca kontrol aşıları için eşit hacimli PBS hazırlayın. Enfeksiyon kadar buz üzerinde enfeksiyöz inoculum ve PBS kontrolü korumak.
9. 96 iyi plastik alt seyreltme plakası ile PBS içine yedi on kat seri seyreltme gerçekleştirin ve uygulanan bakterilerin gerçek miktarını doğrulamak için kanamisin (30 μg/mL) ile desteklenen quadrant TSA plakaları üzerine çoğaltılabilir seyreltme lerin plaka 25 μL. Numaralandırmadan önce koloni oluşumu için bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırın.

2. Hayvan tanımlama

1. Çöplerin yaşla eşleşen yavrular için senkronize edilebilmesi için yeterli sayıda üreme çifti düzenleyin. 1 günlük ± yaş değişkenliği kabul edilebilir.
2. Gebe bir C57BL/6 dişi fareyi tanımlayın ve yaşı doğru bir şekilde belirlemek için planlanan deneyden önce çöpün doğumuna yönelik monitörü belirleyin.
3. Kontrol ve enfekte 3- veya 4 günlük yavrular ayırt etmek için, sadece kontrol yavrularının kuyruklarının uçlarını koparmak için küçük, ince uçlu, iris makas kullanın. Enfekte yavrukuyruk parçacıkları almazlar. Kuyruğu kesmeden önce, % 70 etanol batırılmış bir pamuk topu ile cildi dezenfekte. Gerektiğinde bir pamuk topu veya gazlı bez ile kuyruk sonuna basınç uygulayın.
   NOT: Bu işlem biyogüvenlik kabini başlığı altında gerçekleştirilir. Bir inç yaklaşık 1/8 bir kuyruk parçası yeterlidir.
4. Kontrol ve enfekte gruplar içinde yavru tanımlamak için, yavruların kuyrukları dövme için 28 G x 1'' kalıcı iğne ile 1 mL insülin şırınga kullanın. Dövme önce, bir pamuk topu% 70 etanol batırılmış ile cildi dezenfekte. Bu işlem biyogüvenlik kabini başlığı altında gerçekleştirilir.
5. Kuyruk dövme için, iğne ucuna hayvan dövme mürektürü uygulayın. Sonra, dikkatle bir eliyle yavru dizginlemek, kuyrukları tamamen maruz. İğneyi yavaşça derinin altına yerleştirin, yüzeysel bir derinlik seviyesini korurken ve küçük bir işaretleme veya nokta oluşturulana kadar iğneyi deriyle birkaç milimetre paralel hareket ettirin. Derinin altından fazla mürekleden kaçınmak için iğneyi yavaşça derinin altından çıkarmadan önce birkaç saniye bekleyin.
6. Gerektiğinde bir pamuk topu veya gazlı bez ile yaraya basınç uygulayın. % 70 etanol ile cilt yüzeyinde aşırı dövme mürekkesi çıkarın.
7. Enfekte ve kontrol gruplarında sonraki fareler ile bu işlemi tekrarlayın, her ardışık yavru dövmeli ek bir nokta eklerken (örneğin, yavru 1 kuyruk 1 nokta olacak, yavru 2 kuyruk, vb iki nokta olacak).
   NOT: Ek bir tanımlama katmanı için, kontrol ve enfekte gruplar için hayvan dövme mürekkesinin ayrı renkleri kullanılması önerilir.

3. Subscapular aşılama

NOT: Bu çalışma için her deney için belirlenen düşük doz ve yüksek doz grubu ile 2 deney yapılmıştır. İlk deneyde, 7 yavruya düşük doz inokül verildi (kontrol olarak 4 yavru kullanıldı) ve ayrı bir çöpten 5 yavruya yüksek doz verildi (3 yavru kontrol olarak kullanıldı). Deney 1'deki yavrular sadece 24 saat zaman dilimi için veri sağladılar. İkinci deneyde 8 yavruya düşük doz inokül (2 yavru kontrol olarak kullanıldı) ve 6 yavruya yüksek doz inokül verildi (2 yavru kontrol olarak kullanıldı). Deney 2'deki yavrular 0, 10 ve 24 saat zaman noktaları için veri sağladı.

1. Yaş maç yavruları 1 gün ≤. Ya düşük doz veya yüksek doz çöp olarak her çöp atayın. Bir çöp içinde rasgele bir kontrol veya enfekte yavru olarak yavru atamak.
2. Doğum sonrası 3 veya 4 gün, E. coli-lux veya PBS kontrolü ile aşılamadan önce tüm yavruların rekor ağırlıkları. Bu süre zarfında barajı yavrulardan ayırın ve enfeksiyon sırasında hareket etmediklerinden emin olun.
3. Bir insülin iğnesi kullanarak bir biyogüvenlik kabine içinde, PBS veya E. coli-lux inoculum ya aspire. Bu çalışmada fare başına 2 x 10⁶ ve 7 x 10⁶ CPU'lar kullanılmıştır. Subscapular enjeksiyon yoluyla uygulama kadar buz üzerinde hem bulaşıcı inoculum ve PBS tutun.
4. Biyogüvenlik kabine kaputunda temiz bir yüzeye yenidoğan yerleştirin ve yavru scruff gibi boyun ense de deri yükseltmek.
5. Şimdi deri ve hayvanın kas arasında oluşturulan alanda, iğne eklemek, yukarı yas, sadece deri altında ve enjekte 50 μL PBS veya E. coli-lux. Aynı anda enjeksiyon geri akışını önlemek için cildin sıkıştırılmış kısmını bırakın.
6. İğneyi yavaşça ve özenle çıkarın. Enjeksiyonlar bittikten sonra yavruları barajlarla geri yerleştirin.
   NOT: Gelişimdeki anatomik evreleri nedeniyle 3-4. Böylece bu çalışma için subscapular enfeksiyon rotası infaz kolaylığı nedeniyle seçilmiştir.

4. Hastalık ve uç nokta kriterlerinin değerlendirilmesi

1. Enfeksiyon süresi boyunca günde iki kez yavruizlemek. Görünümdeki anormalliklere dikkat edin.
2. Morbiditenin objektif bir ölçümü olarak ağırlıkları kaydedin.
3. Ağırlık değişikliklerine ek olarak, dorsal tarafta yenidoğan yerleştirerek kendilerini düzeltmek için yavru yeteneğini test edin. Hasta hayvanlar ventral tarafa ve ayaklara dönemeyecek ya da bu eylemi zorlukla tamamlayacaklar.
4. Hayvanları uç nokta kriterlerine yakın işaretlemek için aşağıdakileri kontrol edin: normal vücut ağırlığının %85'inden azı; hareket ve kendilerini düzeltmek için yetersizlik azalması; pembenin aksine cildin renk değişikliği ve daha gri veya şeffaf bir görünüm; dokunmak için serin hissetmek, vücut ısısının azaldığını ve yanlarda hemorajik morlukların göstergesi, aynı zamanda ileri de hastalığın göstergesidir.
   NOT: Yeniler iki gün içinde kilo almayı başaramamışsa ve 4.4 adımdaki açıklamalardan herhangi birini sığdırmışsa, uç nokta ölçütlerini karşılamış olurlar. Yüksek doz alan yavrular genellikle 24 saat uç nokta kriterlerini karşılarlar. Kontrol ve deney grupları arasında karşılaştırmalı analiz için düşük ve yüksek doz çöp içinde kontrol yavruları aynı zamanda ötenazi olacaktır. Aşağıdaki ötenazi bölümüne gidin.

5. Bakteriyel yükün in vivo görüntüleme

1. Görüntüleme ve sonraki analizler için bir microCT görüntüleyici ve yazılım kullanın.
   NOT: Pup cilt rengi görüntüleme kalitesini etkilemez.
2. Kafesi E. coli-lux-enfekteneonatal fareler ve baraj ile BSL-2 seviye laminar akış kaputuna yerleştirin. Farelerin görüntülenerek çıkarılmasını ve kaputun içindeki saydam bir isoflurane haznesine yerleştirin. Gerekli isofluran miktarını ölçmek için enfekte olmayan kontroller ile başlamak için tavsiye edilir.
3. Yazılımı microCT'ye bağlı bilgisayarda açın. Sistemi başlatmayı ve CCD sıcaklığının -90 °C'de kilitlenmesini bekleyin.
4. Izofluran buharlaştırıcıyı açın ve kadranı %5 izofluran akışına ayarlayın. Fareleri bu isofluran karışımıyla hareket edene kadar 20-30 s'lik odada tutun; bazı fareler için daha uzun veya daha kısa anestezi maruz kalma süreleri gerekebilir. Fareler hareket etmeyi bıraktıktan sonra yeterince anestezi yedirilirler ve görüntülenebilirler.
5. Fareleri mikroCT görüntüleme odasına taşıyın ve burunlar burun konilerine dik bakacak şekilde, eğilimli pozisyondaki görüntüleme kutusuna yerleştirin. Herhangi bir hareketi sınırlamak için görüntüleme kutusunda ki ayakları nazikçe dizginlemek için diş balmumu kullanın. Bir seferde en fazla 4 yenidoğan fare görüntülenebilir.
6. Görüntüleme sırasında fareleri anestezi altında tutmak için izofluran buharlaştırıcıyı %2-4 akışa çevirin. MikroCT görüntüleme odasının kapısını kapatın. Birkaç saniye sonra fareleri kontrol et. Eğer hareket etmeye başlarlarsa, bir pamuk topun isoflurane içinde bekletin ve hayvanın burnuna tutun ve 5 saniye boyunca anestezi için hareket ettirin. Görüntüleme sırasında hayvanların yanında pamuk topu tutun. Anestezi ve fareler iyoklamak için dikkatli olun.
7. Yazılımı kullanarak, görüntüleme için Luminescent seçeneğini seçin. Blok için ayarlı bir uyarma filtresi ve 500 nm, 520 nm, 560 nm, 580 nm, 600 nm ve 620 nm'yi açmaküzere ayarlanan emisyon filtresikullanın. Parlaklık için ayarlanmış yedi toplam emisyon filtresi olacaktır.
8. Fareleri her zaman noktasında (0, 10 ve 24 saat enfeksiyon sonrası [hpi]) görüntüleyin ve tüm görüntüleri her zaman noktası için bir klasöre kaydedin. Yavruları barajla birlikte kafese geri getirin ve tüm yavruların anesteziden kurtulup iyileşmediğini kontrol edin.
9. 2B görüntüleri analiz etmek için, yazılımdaki görüntüleri açın. Birimleri Radyant (foton)olarak değiştirin; bu toplam akı (fotonlar / saniye)dönüşecektir.
10. Aynı anda birden fazla emisyon filtresi içeren yalnızca bir görüntü kümesini analiz edin. Her görüntü kümesinden, her görüntünün sağ alt köşesinde bulunan minimum ve maksimum parlaklık değerlerine dikkat edin (örneğin, 7 emisyon filtresi varsa, 7 görüntü ve 7 minimum ve maksimum değer olacaktır). Karşılaştırılacak olan her görüntü kümesi için tekrarlayın.
11. Tüm görüntüler için değerleri ve Parlaklığı kapsayacak bir ölçek belirlemek için, her görüntü kümesi için en düşük minimum değeri ve en yüksek en yüksek değeri bulun. Bu çalışma için, Açık filtre görüntüleri temsili olarak kullanılmıştır.
    1. Ölçeği değiştirmek için seçtiğiniz görüntüyü vurgulayın ve açın. AraçPaleti'nde, Resim Ayar sekmesine tıklayın ve Renk Ölçeğini önceden tanımlanan en düşük en küçük ve en yüksek maksimum değerlerle değiştirin. Her görüntüyü TIFF olarak kaydedin. Doğru ölçeğin görüntülendiğinden emin olmak için her zaman noktasını bu şekilde ayrı ayrı analiz edin.
12. Her fare için toplam akısı (fare başına parlak sinyal miktarı) ölçmek için, daha önce adım 5.9-5.10'da açıklandığı gibi bir görüntü açın. Araç Paleti'ndeki YG Araçları sekmesini açın ve daire aracını seçin. Bir lüminesans alanını analiz ediyorsanız 1 daire seçin.
13. YG'yi parlaklık alanında Yer Kaplamasına taşıyın. Gerekirse YG boyutunu ayarlayın.
    NOT: Ayarlama gerekiyorsa, tutarlılığı korumak için diğer görüntülerdeki RO'ları karşılaştırın. Ölçü ROI'larınıseçin. YG Ölçümleri penceresi Toplam Akı (p/s) ,Ortalama Parlaklık (p/s/cm²/sr), Standart Parlaklık Sapma, Minimum Parlaklık ve Maksimum Parlaklıkgörüntüleme açılacaktır.
14. Her görüntü kümesi için toplam akı ölçümlerini kaydedin. Bu sayı, 2B görüntülerde faredeki parlaklığın niceliksel miktarıdır.
15. 3B yeniden mikroCT görüntüleri yapmak için, Araç Paleti'ndeki DLIT 3D Yeniden Yapılandırma panelini açın ve Analiz sekmesinin altına dahil edilecek tüm dalga boylarını kontrol edin.

6. Ötenazi

1. Nekropsi ve uygun downstream uygulamaları için ilgi doku/organlar için tüpler hazırlamak ve etiket.
2. Biyogüvenlik kabinindeki yenileri barajdan ayırın.
3. Veteriner sınıfı isoflurane bir pamuk topu ıslatın ve şeffaf bir çevreleme odası içinde yerleştirin.
4. Kan topluyorsanız, bir ucu ile bir P200 mikropipet hazırlayın ve bir antikoagülan olarak 5 mM EDTA 10 μL ile 1.5 mL tüp var. 50-200 μL kan hacmi beklenmektedir.
5. Odaya bir yenidoğan yerleştirin ve yavrusu hareketsiz hale gelene kadar izleyin.
6. Hızlı bir şekilde, yenidoğan çıkarın ve makas ile decapitate. Uzun bir süre temiz hava solumak için izin verilirse, yavru bilincini geri kazanabilirsiniz. Yeniler yetişkin farelere göre akciğer kapasitesini azaltmıştır, ve bu nedenle, tek başına isofluran e göre ötanazi için yeterince derin nefes yok.
7. P200 mikropipet kullanarak başın tabanında gövdeden kan toplayın. Toplanan kan miktarını en üst düzeye çıkarmak için, kafa kesme sonrasında mümkün olduğunca çabuk bu adımı gerçekleştirin. 1.9 adımda açıklandığı gibi seri seyreltme ve standart plaka sayma ile kandaki bakterileri saymak.
8. Doku örneklerinin eksizyonu öncesinde% 70 etanol ile tüm yenidoğan sterilize.

7. Doku hasadı

1. Bir biyogüvenlik kabini içinde, kontaminasyonu önlemek için% 70 etanol ile yenidoğan douse. Hayvanı sağ tarafına yatırın.
2. Forceps kullanarak, karın ve arka sol bacak arasında bir noktada cilt kavramak ve ince uçlu cerrahi makas ile bir kesi yapmak. Geri doğru yukarı doğru hareket eden deri kesmeye devam edin. Tüm dalak açığa çıkana kadar ilerleyin.
3. Dalağını kavramak ve karından çıkarmak için, bağ dokusunu kesmek için makas kullanarak forceps kullanın. Dalağını aşağı akım uygulamasına uygun çözeltiye yerleştirin.
4. Akciğerleri elde etmek için, tamamen göğüs derisini soyma.
5. Göğüs kafesinin tabanına dikey olarak tutulan makaslarla girerek, göğüs kafesi bölünene kadar yukarı doğru kesin.
6. Sağ ve sol akciğerleri tek tek kavramak ve göğüs boşluğundan çıkarmak için forceps kullanın. Makasla keserek kalbi akciğer dokusundan çıkarın.
7. Akciğeri aşağı akım uygulamasına uygun çözeltiye yerleştirin. RNA izolasyonu için 500 μL guanidin tiyosiyanat/fenol (GTCP) kullanın. Histopatoloji için 5 mL %10 nötr tamponlu formalin kullanın.

8. Gen ekspresyonu için akciğer dokusundan RNA izolasyonu

1. Mikrocentrifuge'u 4 °C'ye kadar önceden soğutun.
2. GTCP'deki akciğer dokusunu makasla doğrama. Sonra, bir pille çalışan homogenizer ile doku homojenize. Çözüm mümkün olduğunca düzgün olana kadar devam edin. 3-5 dk oda sıcaklığında kuluçka.
3. Filtrelenmiş pipet uçlarını kullanarak 100 μL kloroform ekleyin. Tüpü 15 dakika ters çevirin ve oda sıcaklığında 3-5 dk kuluçkaya yatırın.
4. 12.000 x g15 dk için santrifüj .
5. Dönüş sırasında 1,5 mL'lik tüpler ve %70 etanol 500°L'lik tüpler hazırlayın. RNA izolasyon kitindeki sütunları ve toplama tüplerini birleştirin ve etiketlayın.
6. Santrifüj sırasında oluşan interfaz tabakasını rahatsız etmeden üst, sulu katmanı dikkatlice çıkarın. % 70 etanol içeren tüpler de sulu tabaka yerleştirin.
7. Etanol ve lysate karışımını toplama tüpündeki kolona taşıyın.
8. Bu noktadan itibaren, RNA'nın son elution kadar RNA izolasyon kiti ticari ürün protokolü izleyin.
9. Saflık ve miktar için RNA analiz edin. Hemen kullanın veya daha fazla kullanıma kadar -80 °C'de saklayın.

9. cDNA sentezi

1. Etiket PCR tüpler ve bir kenara koyun.
2. Her numune için cDNA reaksiyon karışımına 1 μg RNA ekleyin.
3. CDNA protokolünde açıklandığı gibi reaktifleri ve şablonu PCR tüpüne ekleyin. Enzimi karışıma son olarak ekleyin.
4. PCR tüplerini aşağıdaki çalışma ayarlarına sahip bir termocycler yerleştirin: 25 °C'de 5 dk, 42 °C'de 40 dk, 85 °C'de 15 dk ve 4 °C son tutun.
5. PCR tüplerini termocycler'dan çıkarın ve bir sonraki kullanıma kadar hemen kullanın veya -20 °C'de saklayın.

10. Gerçek zamanlı nicel PCR (qPCR) döngüsü

1. Analiz edilecek genlerin her biri için bir reaksiyon karışımı kokteyl hazırlayın. Her 15 μL PCR reaksiyonu 7,5 μL 2x reaktif karışımı, 0,75 μL 20X 5'-FAM etiketli gen-spesifik astar/prob ve 3,75°L nükleaz içermeyen su gerektirir. Amplicons genellikle 60-120 bp arasında değişmektedir.
2. Uygun kuyulara her deney grubu için 3 μL cDNA şablonu ekleyin.
3. Uygun kuyulara genlere özgü reaksiyon karışımı kokteylin 12 μL'sini ekleyin.
4. Kuyularda oluşmuş olabilecek kabarcıkları gidermek için plakayı 1000 x g'da 1 dk optik yapışkan film ve santrifüj ile kaplayın.
5. PCR plakayı gerçek zamanlı PCR termocycler'a yerleştirin.
6. Çalışma yöntemini şu şekilde ayarlayın: 95 °C'de 3 dk, 15 s için 95 °C'de 40 devir ve 1 dk için 60 °C.
7. 2^-ΔΔCt formülü ve sayıların günlük₂ dönüşümlerini kullanarak enfekte olmayan kontrol örneklerine göre enfekte örneklerden alınan ilgi genini normalleştirerek verileri analiz edin.

11. Akciğer histopatolojisi

1. Yukarıda açıklandığı gibi yenidoğan yavrusu akciğerleri çıkarın.
2. Dokuya çözelti oranı 3-7 gün boyunca yaklaşık 20:1 olacak şekilde% 10 nötr tamponlu formalin hacminde doku yerleştirin.
3. Parafin katıştırma, kesit ve hematoksilin ve eozin (H&E) boyama için uygun bir histoloji hizmeti ile koordine olun. Bu çalışma için, Batı Virginia Üniversitesi Histopatoloji Core kullanılmıştır. Alternatif olarak, daha önce açıklanan protokolleri^{izleyin 19}.

12. In vitro bakteriyel öldürme tetki

1. Yukarıda açıklandığı gibi enfekte olmayan yenidoğan yavrusundan dalağını çıkarın ve steril 60 mm Petri kabının içine 40 μm'lik bir naylon sepete yerleştirin. Bunu ve havuz dalaklarını bir tüp halinde tekrarlayın, hasat edilip homojenize edin.
2. %10 FBS ile desteklenen 5 mL PBS ekleyin.
3. Tek bir hücre süspansiyonu oluşturulana kadar steril 3 mL şırınga pistonu kullanarak dokuyu ayrıştırın.
4. Naylon sepetin dışında tek hücreli süspansiyonu toplayın, 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne ve 5 dk için 350 x g'da pelet hücrelerine aktarın.
5. Kırmızı kan hücreli lisis tampon hücreleri askıya (7-8 dalak için 2 mL) ve eritrositleri ortadan kaldırmak için oda sıcaklığında 5 dakika bekletin.
6. Yukarıdaki gibi PBS ve pelet ile splenositleri yıkayın.
7. Beklenen hücre verime göre 0.25 mL PBS'deki splenositleri %0.5 BSA ve 2 mM EDTA ile askıya alın.
8. Hemositmetre veya diğer uygun bir uygulama kullanarak splenositleri sayın.
9. Üretici protokolüne göre ly6B.2⁺ (granülositlerin/inflamatuar monositlerin miyeloid popülasyonu) hücreleri immünomanyetik boncuklarla izole edin.
10. %10 FBS, 2 mM glutamin ve 25 mM HEPES (komple orta) içeren 0,1 mL DMEM hacminde siyah veya beyaz 96-kuyu plakasında iyi başına 1 x 10⁵ hücre yoğunluğunda 1^x 10 + hücreler.
11. Bölüm 1'de açıklandığı gibi biyolüminesans E. coli'yi hesaplayın ve bakteriyel inokülü istenilen enfeksiyon çokluğunda (MOI) 0.1 mL'lik son hacimde hazırlayın. Bu en iyi toplu olarak ortak bir MOI tüm kuyular için gerekli olan yaparak yapılır.
12. Kontrol olarak 0,1 mL bakteriyel inokül veya tam orta tek başına ekleyin. Çok kuyulu plakayı 37 °C'de ve %5 CO_2'yi 1 saat için kuluçkaya yatırın.
13. Ortamı bir pipetle hafifçe sökerek ve yeni bir pipet ucuyla taze ortam ekleyerek, 0,2 mL'lik gentamisin (100 μg/mL) içeren taze tam ortamla değiştirin. Ek bir 2 saat için kuluçka için kültür dönün.
14. 3 saat sonrası enfeksiyon, bir tabak okuyucu kullanarak alttan kapaklı kültür plakaher kuyulu parlaklık ölçmek ve daha sonra kuluçka için kültür dönmek.
15. İstenilen diğer zaman noktalarında lüminesans ölçümlerini tekrarlayın.

Sonuçlar

Bu protokol neonatal farelerde bakteriyel sepsise neden oldu ve hastalığın seyrini incelemek için uzunlamasına intravital görüntüleme, kandaki bakterilerin numaralandırılması, patolojinin histolojik değerlendirmeleri ve inflamatuar sitokin ekspresyon profilleri kullandık. Zaman içinde hem düşük (~2 x 10⁶ CPU) hem de yüksek (~7 x 10⁶ CPU) inokülleri ile enfekte olan yenidoğan yavrularında morbidite belirtileri gözlendi. Daha fazla inokül alan yavrular, hareket kabiliye...

Tartışmalar

Neonatal farelerde bakteriyel sepsisi indükleyen subskapular enfeksiyon modelimiz, bakteriyel patojenlerin uzunlamasına yayılmasını gerçek zamanlı olarak incelemek için yeni bir yöntemdir. İntravital görüntüleme, bakteriyel yayılmayı gerçek zamanlı olarak yenini keşfetme fırsatı sağlar. Bu bakteriyel yayma kinetik anlamak ve daha fazla hastalığın uygun aşamasında konak yanıt ve hasar çalışma için önemlidir. Fare yavrularına bakteriyel inokülin subskapular enjeksiyonu deri altı, subskapu...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Insulin Syringe	Coviden	1188128012	Inoculum or PBS injection
10% Neutral Buffered Formalin	VWR	89370-094	Histopathology
ACK Lysis Buffer	Gibco	LSA1049201	Bacterial clearance assay
Animal Tattoo Ink Paste	Ketchum	KI1482039	Animal identification
Animal Tattoo Ink Green Paste	Ketchum	KI1471039	Animal identification
Anti-Ly-6B.2 Microbeads	Miltenyi Biotec	130-100-781	Cell isolation
Escherichia coli O1:K1:H7	ATCC	11775
Escherichia coli O1:K1:H7-lux (expresses luciferase)	N/A	N/A	Constructed in-house at WVU
E.Z.N.A. HP Total Extraction RNA Kit	Omega Bio-tek	R6812	RNA extration
DPBS, 1X	Corning	21-031-CV
Difco Tryptic Soy Agar	Becton, Dickinson and Company	236950	Bacterial growth
IL-1 beta Primer/Probe (Mm00434228)	Thermo Fisher Scientific	4331182	Cytokine expression qPCR
IL-6 Primer/Probe (Mm00446190)	Thermo Fisher Scientific	4331182	Cytokine expression qPCR
iQ Supermix	Bio-Rad	1708860	Real-time quantitative PCR
iScript cDNA Synthesis Kit	Bio-Rad	1708891	cDNA synthesis
Isolation Buffer	Miltenyi Biotec	N/A	Bacterial clearance assay
IVIS Spectrum CT and Living Image 4.5 Software	Perkin Elmer	N/A	Intravital imaging
LB Broth, Lennox	Fisher BioReagents	BP1427-500	Bacterial growth
EASYstrainer (Nylon Basket)	Greiner Bio-one	542 040	Cell strainer
SpectraMax iD3	Molecular Devices	N/A	Plate reader
Pellet Pestle Motor	Grainger	6HAZ6	Tissue homogenization
Polypropylene Pellet Pestles	Grainger	6HAY5	Tissue homogenization
Prime Thermal Cycler	Techne	3PRIMEBASE/02	cDNA synthesis
TNF-alpha Primer/Probe (Mm00443258)	Thermo Fisher Scientific	4331182	Cytokine expression qPCR
TriReagent (GTCP)	Molecular Research Center	TR 118	RNA extration