Неонатальная модель визуализации грамотрицательных бактериальных сепсисов

Резюме

Инфекция неонатальных мышей биолюминесцентной кишечной палочкой O1:K1:H7 приводит к септической инфекции со значительным воспалением легких и патологией легких. Здесь мы описываем процедуры моделирования и дальнейшего изучения неонатального сепсиса с использованием продольной интравитальной визуализации параллельно с перечислением системных бактериальных обременений, воспалительного профилирования и гистопатологии легких.

Аннотация

Новорожденные находятся на повышенный риск бактериального сепсиса из-за уникального иммунного профиля они отображают в первые месяцы жизни. Мы установили протокол для изучения патогенеза E. coli O1:K1:H7, серотипа, ответственного за высокие показатели смертности у новорожденных. Наш метод использует интравитаную визуализацию неонатальных щенков в разные моменты времени во время прогрессирования инфекции. Эта визуализация, параллельно с измерением бактерий в крови, воспалительным профилированием и гистопатологией тканей, означает строгий подход к пониманию динамики инфекции во время сепсиса. В настоящем докладе мы моделем два инфекционных инокулума для сравнения бактериального бремени и тяжести заболевания. Мы находим, что подкапулярная инфекция приводит к распространению инфекции на 10 ч после заражения. К 24 ч инфекция люминесцентной кишечной палочки была в изобилии в крови, легких и других периферических тканях. Выражение воспалительных цитокинов в легких является значительным на 24 ч, и это сопровождается клеточной инфильтрации и доказательства повреждения тканей, что увеличивается с инфекционной дозы. Интравитальная визуализация имеет некоторые ограничения. Это включает в себя люминесцентный порог сигнала и некоторые осложнения, которые могут возникнуть с новорожденными во время анестезии. Несмотря на некоторые ограничения, мы находим, что наша модель инфекции предлагает понимание продольной динамики инфекции во время неонатального сепсиса мурина, который не был тщательно изучен до сих пор. Мы ожидаем, что эта модель также может быть адаптирована для изучения других критических бактериальных инфекций в раннем возрасте.

Введение

Бактериальный сепсис является значительной проблемой для новорожденных, которые демонстрируют уникальный иммунный профиль в первые дни жизни, что не обеспечивает адекватной защиты от^{инфекции 1}. Неонатальный сепсис по-прежнему является важной проблемой здравоохранения США, на которую приходится более 75 000 случаев заболевания в год только в^{США 2}. Для углубленного изучения этих инфекций необходимы новые модели животных, которые подысовывают аспекты болезней человека. Мы создали модель неонатальной мыши инфекции с использованием Escherichia coli, O1:K1:H7³. E. coli является второй ведущей причиной неонатального сепсиса в США, но отвечает за большинство сепсиса связанных^{смертности 4,5}. Тем не менее, это ведущая причина, когда досрочные и очень низкой массы тела при рождении (VLBW) дети считаются^{самостоятельно 5}. Серотип К1 чаще всего ассоциируется с инвазивными инфекциями кровотока и менингитом у новорожденных^6,7. В настоящее время нет других вариантов лечения, кроме антибиотиков и поддерживающей помощи. Между тем, темпы устойчивости к антибиотикам продолжают расти для многих патогенных бактерий, с некоторыми штаммами кишечной палочки устойчивы к множеству антибиотиков, обычно используемых в^{лечении 8}. Таким образом, крайне важно, чтобы мы продолжали генерировать методы для изучения механизмов сепсиса и принимающей реакции у новорожденных. Эти результаты могут помочь улучшить текущее лечение и результаты инфекции.

Иммунное состояние новорожденных характеризуется как фенотипическими, так и функциональными различиями по сравнению со взрослыми. Например, повышенные уровни противовоспалительных и нормативных цитокинов, таких как интерлеукин (IL)-10 и IL-27, как было показано, производятся макрофагами, полученными пуповинной кровью, и присутствуют на более высоких уровнях в^{сыворотке крови муринных новорожденных 9,10,11}. Это согласуется с более низкими уровнями IFN-α, IFN-ɣ, IL-12 и TNF-α, которые часто сообщаются из неонатальных клеток по сравнению со взрослыми^{коллегами 10}. Кроме того, неонатальной иммунной системы перекос в сторону Th2 и нормативных Т-клеток ответ по сравнению со^{взрослыми 12}. Повышенное количество нейтрофилов, Т-клеток, В-клеток, НК-клеток и моноцитов также присутствует у новорожденных, но со значительными функциональными нарушениями. Это включает в себя дефекты в выражении маркеров поверхности клеток и антиген презентации, которые^{предлагают незрелость 13,14,15}. Кроме того, неонатальные нейтрофилов значительно не хватает их способности мигрировать к химиотатическим^{факторам 16}. Клетки супрессора, полученные из миелоида (MDSCs), также находятся на повышенных уровнях у новорожденных и недавно показали, что источник il-27¹¹. MDSCs являются весьма подавляющим к Т-клеток¹⁷. В совокупности эти данные демонстрируют ограничения в неонатальном иммунитете, которые придают повышенную восприимчивость к инфекции.

Для изучения прогрессирования бактериального бремени и вскрытия защитных иммунных реакций хозяина во время неонатального сепсиса, мы разработали новую модель инфекции. Неонатальным мышам в 3-4 дня жизни трудно вводить внутриперитонеашеическое пространство или хвостовую вену. В нашей модели, день 3 или 4 щенков вводят бактериальной инкулум или PBS подкожно в лопаткулярной области. Системная инфекция развивается и с использованием люминесцентной E. coli O1:K1:H7, мы можем продольно изображения отдельных неонатальных мышей следовать распространенной бактериальной нагрузки в периферических тканях. Это первая модель сообщили использовать интравитальной визуализации, чтобы понять кинетику распространения бактерий во время сепсиса в мурине новорожденных³.

Здесь мы описываем протокол, чтобы вызвать септические инфекции кишечной палочки у неонатальных мышей³. Мы описываем, как подготовить бактериальный инокулум к инъекциям, и как собрать ткани для оценки патологии, измерения воспалительных маркеров путем анализа экспрессии генов и перечисления бактериальной нагрузки. Кроме того, описано использование люминесцентной кишечной палочки для интравитальной визуализации инфицированных новорожденных и количественной оценки бактериальных убийств неонатальными иммунными клетками. Эти протоколы также могут быть адаптированы для изучения других важных бактериальных инфекций у новорожденных. Представленные здесь данные представляют собой общий новый подход к пониманию динамики инфекции в переводимой модели неонатального сепсиса.

протокол

Все процедуры были одобрены Комитетами по уходу и использованию животных Западной Вирджинии и проведены в соответствии с рекомендациями Руководства по уходу и использованию лабораторных животных Национальным исследовательским^{советом 18.}

1. Подготовка бактериального инокулума

1. Полоса триптического соевого агара (TSA) пластины с инокуляции петли для изоляции одной колонии из морозильной камеры фонда E. coli O1:K1:H7-люкс, который быстро выражает люцифераза и несет kanamycin сопротивление³. Инкубировать на ночь при 37 градусов по Цельсию.
2. На следующий день позвольте бульону Luria (LB) прийти к комнатной температуре (25 градусов по Цельсию) в кабинете биобезопасности.
3. Под капотом шкафа биобезопасности идентифицировать одну колонию из полосатой пластины и привить ее в 3 мл LB, дополненной канамицином (30 мкг/мл). Инкубировать на ночь при 37 градусов по Цельсию со тряской (220 об/мин). Это стартовая культура.
4. Разбавить культуру стартера 1:100 в свежие 3 мл LB под капотом шкафа биобезопасности и вернуть его в инкубатор на 2-3 ч при 37 градусов по Цельсию со тряской (220 об/мин). Это фондовая культура.
5. Прочитайте оптическую плотность (OD) как пустой, так и фондовой культуры на 600 нм с помощью спектрофотометра. Добавьте 100 л LB (не содержащий бактерий) в один колодец из 96 хорошо плоская нижняя анализная пластина; это пустой. Затем добавьте 100 мкл из биржевой культуры в отдельную колодец. Повторите еще две репликации. Абсорбанс читается с помощью считыватель пластин.
6. Вычесть пустое поглощение из стоимости абсорбции культуры акций (значение OD) и сравнить с ранее сгенерированной и проверенной кривой роста, чтобы определить приближение бактериальной плотности в культуре запасов для подготовки инфекционной дозы.
7. Создание целевых инокулумов в зависимости от исследовательского вопроса. Для этого исследования были использованы целевые инокулы 2^{х 10 6} (низкий)^{и 7 х 10 6} (высоких) колонийообразующих единиц (CFUs) на мышь (/мышь).
   1. Разделите целевую дозу на мышь (Dose_T)на оценочную концентрацию бактерий в биржевой культуре (Stock), чтобы получить объем бактерий, необходимых из биржевой трубки (V_S).
   2. _{Умножьте V S} на количество мышей (N_M), которые должны быть инфицированы вместе с достаточно для 5-10 дополнительных услуг для общего количества бактерий, необходимых для инфекции плюс 5-10 дополнительных доз. Удалите этот объем из стоковой трубки и добавьте его в новую центрифугу трубки.
   3. Используйте уравнение ниже:
      Доза_T/Stock - V_{S x} N_M - общий объем (V_T)бактерий, которые будут удалены из биржевой трубки.

8. Центрифуга бактерий на 2000 х г в течение 5 мин при 4 градусов по Цельсию и повторно бактериальных гранул в 50 МКЛ PBS (рН 7,2-7,6) на мышь, чтобы быть инфицированы (например, для 10 доз 2 х 10^{6 бактерий} каждую дозу, гранулы 2 х^{10 7} бактерий будут повторно использованы в 500 йл PBS). Опять же, рекомендуется готовить больше инокулов, чем это необходимо. Подготовь равный объем PBS только для контрольных прививок. Поддержание инфекционного инокулума и PBS контроля на льду до инфекции.
9. Выполните семь десятикратных серийных разбавлений в PBS в 96 хорошо пластиковых нижней разбавленной пластины, и пластины 25 йл разбавления в дублировать на квадрант TSA пластин, дополненных канамицин (30 мкг / мл), чтобы перечислить фактическое количество бактерий вводят. Инкубировать при 37 градусов по Цельсию на ночь для формирования колонии до перечисления.

2. Идентификация животных

1. Упорядочить достаточное количество пар разведения, так что пометы могут быть синхронизированы для возрастных щенков. Вариабельность ± 1 день приемлема.
2. Определите беременную мышь C57BL/6 и следите за рождением помета до запланированного эксперимента по точному определению возраста.
3. Чтобы различать контроль и инфицированных 3- или 4-дневных щенков, используйте пару небольших, тонко наконечником, ножницы радужной оболочки глаза, чтобы резать концы хвостов контроля щенков только. Зараженные щенки не получают хвостовые ножницы. Перед резки хвоста, дезинфицировать кожу с ватным тампоном облили 70% этанола. При необходимости нанесите давление на конец хвоста ватным тампоном или марлей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура выполняется под капотом шкафа биобезопасности. Хвост фрагмент примерно 1 / 8 дюйма достаточно.
4. Чтобы определить щенков в пределах контроля и инфицированных групп, используйте 1 мл инсулина шприц с 28 G х 1 / 2 'постоянная игла татуировку хвосты щенков. Перед татуировкой, дезинфицировать кожу с ватным тампоном облили 70% этанола. Эта процедура выполняется под капотом шкафа биобезопасности.
5. Чтобы татуировка хвост, применить животных чернила татуировки на кончике иглы. Далее, тщательно удерживайте щенка одной рукой, с их хвост полностью подвергается. Аккуратно вставьте иглу под кожу, сохраняя при этом поверхностный уровень глубины, и двигайте иглу параллельно коже несколько миллиметров, пока не будет создана небольшая маркировка, или точка. Подождите несколько секунд, прежде чем медленно удалить иглу из-под кожи, чтобы избежать избытка чернил, высвобождающих из-под кожи.
6. При необходимости нанесите давление на рану ватным тампоном или марлей. Удалите избыток чернил татуировки на поверхности кожи с 70% этанола.
7. Повторите этот процесс с последующими мышами в инфицированных и контрольных групп, добавляя дополнительную точку с каждым последующим щенком татуировку (например, щенок 1 будет иметь 1 точку на хвосте, щенок 2 будет иметь две точки на хвосте и т.д.).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для дополнительного уровня идентификации рекомендуется использовать отдельные цвета чернил татуировки животных для контроля и инфицированных групп.

3. Подкапулярная прививка

ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого исследования, 2 эксперимента были проведены с низкой дозы и высоких доз группы, предназначенные для каждого эксперимента. В первом эксперименте, 7 щенков получили низкие дозы инокулума (4 щенков были использованы в качестве контроля), и 5 щенков из отдельного помета были даны высокие дозы (3 щенков были использованы в качестве контроля). Детеныши из эксперимента 1 предоставили данные только для 24 часов времени. Во втором эксперименте, 8 щенков получили низкую дозу инокулума (2 щенков были использованы в качестве контроля), и 6 щенков получили высокую дозу инокулума (2 щенков были использованы в качестве контроля). Щенки из эксперимента 2 предоставили данные для точек времени 0, 10 и 24 ч.

1. Возраст матч щенков ≤ 1 день. Присвойте каждому помету либо низкую дозу, либо высокую дозу помета. В помете случайным образом назначить щенков в качестве контроля или инфицированных щенков.
2. На 3 или 4 день послеродовой, рекордный вес всех щенков до прививки с E. coli-lux или PBS управления. Отделить плотину от щенков в течение этого времени, чтобы убедиться, что они не перемещаются во время инфекции.
3. В кабинете биобезопасности с помощью инсулиновой иглы, аспират либо PBS или E. coli-lux inoculum. Для этой работы были использованы инокулумы 2 х^{10 6} и 7 х^{10 6} CFUs на мышь. Держите как инфекционные инокулум и PBS на льду до введения через подкапулярные инъекции.
4. Поместите новорожденных на чистую поверхность в капюшоне шкафа биобезопасности и поднимите кожу на затылке, как бы потертого щенка.
5. В пространстве, созданном между кожей и мышцей животного, вставьте иглу, скошенную вверх, прямо под кожей и ввись 50 МКЛ PBS или E. coli-lux. Одновременно отпустите ущипнул часть кожи, чтобы предотвратить инъекцию обратного потока.
6. Удалите иглу медленно и с осторожностью. Поместите щенков обратно с плотинами после инъекций закончены.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за их анатомической стадии развития, это технически сложно управлять хвостовой вены или внутриперитонеальной инъекции неонатальных щенков в день 3-4. Таким образом, маршрут подкапулярной инфекции был выбран для этого исследования из-за простоты исполнения.

4. Оценка заболеваний и критериев конечных точек

1. Мониторинг щенков два раза в день в течение всего срока инфекции. Обратите внимание на какие-либо отклонения во внешнем виде.
2. Рекордные веса как объективное измерение заболеваемости.
3. В дополнение к изменениям веса, проверить способность щенков, чтобы исправить себя, позиционирование новорожденного на спинной стороне. Больные животные не смогут перевернуться на вентраловую сторону и на ноги или с трудом заверят это действие.
4. Проверьте следующие, чтобы отметить животных близко к конечной точки критериев: менее 85% от нормальной массы тела; снижение движения и неспособность исправить себя; обесцвечивание кожи и более серый или прозрачный внешний вид, в отличие от розового; чувство прохлады на ощупь, свидетельствует о снижении температуры тела и геморрагических синяков по бокам, также свидетельствует о заблаговременной болезни.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если новорожденные не смогли набрать вес в течение двух дней и соответствовать любому из описаний в шагах 4.4, они соответствовали критериям конечной точки. Детеныши, которые получают высокую дозу, часто отвечают критериям конечной точки на 24 ч. Контроль щенков в пределах низких и высоких доз пометов будет усыплен в то же время, чтобы обеспечить сравнительный анализ между контрольными и экспериментальными группами. Перейти к эвтаназии разделе ниже.

5. In vivo визуализации бактериального бремени

1. Используйте микроКТ-изображение и программное обеспечение для визуализации и последующего анализа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Цвет кожи щенка не влияет на качество изображения.
2. Поместите клетку с E. coli-lux-инфицированныхнеонатальных мышей и плотины в BSL-2 уровне ламинарного потока капот. Удалите мышей, которые будут изображены, и поместите в прозрачную камеру изофлюрана внутри капота. Рекомендуется начать с неинфицированных элементов управления, чтобы оценить количество изофлюрана необходимо.
3. Откройте программное обеспечение на компьютере, прикрепленном к microCT. Инициализировать систему и ждать, пока температура CCD зафиксировать при температуре -90 градусов по Цельсию.
4. Включите испаритель изофлюрана и отрегулируйте циферблат до 5% потока изофлюрана. Держите мышей в камере с этой изофлюрановой смесью в течение 20-30 с, пока они не перестанут двигаться; более длиннее или более скоро времена выдержки анестезии могут быть необходимы для некоторых мышей. Как только мыши перестают двигаться, они достаточно анестезировано, и могут быть изображены.
5. Переместите мышей в камеру визуализации microCT и поместите их на окно для визуализации в положении, подверженном риску, с носом, обращенным перпендикулярно носу конусов. Используйте зубной воск, чтобы мягко сдерживать ноги на коробке для визуализации, чтобы ограничить любое движение. Одновременно можно увидеть до 4 неонатальных мышей.
6. Включите изофлюран испаритель до 2-4% потока держать мышей анестезии во время изображения. Закрой дверь камеры визуализации microCT. Проверьте на мышах несколько секунд спустя. Если они начинают двигаться, облить ватным тампоном в isoflurane и держать его к носу животного движущихся в течение 5 секунд, чтобы обезболить. Держите ватный шарик рядом с животными во время визуализации. Будьте осторожны, чтобы не более анестезировать и прекратить мышей.
7. Используя программное обеспечение, выберите параметр Luminescent для визуализации. Используйте фильтр возбуждения, установленный для блока, и фильтр выбросов, установленный для Open,500 нм, 520 нм, 560 нм, 580 нм, 600 нм и 620 нм. Для люминесценции будет установлено семь фильтров общего объема выбросов.
8. Изображение мышей в каждой точке времени (0, 10 и 24 ч после заражения) и сохранить все изображения в папку для каждой точки времени. Верните щенков в клетку с плотиной и убедитесь, что все щенки оправились от анестезии.
9. Для анализа 2D-изображений, открытые изображения в программном обеспечении. Изменение единиц на Radiance (фотоны); это превратится в Total Flux (фотоны/секунды).
10. Анализируйте только один набор изображений с его фильтрами множественного излучения одновременно. Из каждого набора изображений обратите внимание на минимальные и максимальные значения сияния, расположенные в правом нижнем углу каждого изображения (например, если есть 7 фильтров выбросов, будет 7 изображений, и 7 минимальных и максимальных значений). Повторите для каждого набора изображений, который должен быть сравнен.
11. Чтобы определить шкалу, которая будет охватывать значения и люминесценцию для всех изображений, найдите наименьшее минимальное значение и максимальное значение для каждого набора изображений. Для этого исследования изображения открытого фильтра использовались в качестве репрезентативных.
    1. Выделите и откройте изображение выбора, чтобы изменить шкалу. На палитре инструментов нажмитена вкладку Корректировка изображения и измените цветовую шкалу до самых низких минимальных и самых высоких максимальных значений, ранее идентифицированных. Сохраните каждый набор изображений в качестве TIFF. Индивидуально проанализируйте каждую точку времени таким образом, чтобы обеспечить отображение правильной шкалы.
12. Для количественной оценки общего потока (количество люминесцентного сигнала на мышь) для каждой отдельной мыши откройте изображение, описанное ранее в шаге 5.9-5.10. Откройте вкладку ROI Tools на палитре инструментов и выберите инструмент круга. Выберите 1 круг при анализе одной области люминесценции.
13. Перемести roi на наложение на область люминесценции. При необходимости отрегулируйте размер рентабельности инвестиций.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если требуется корректировка, отрегулируйте ИИ в других изображениях сравнительно для поддержания согласованности. Выберите меру ROIs. Окно ROI Measurements откроется с отображением Total Flux (p/s), Average Radiance (p/s/cm^2/sr), Стандартное отклонение радианса, минимальное сияние и максимальное сияние.
14. Запись общих измерений потока для каждого набора изображений. Это число является количественным количеством люминесценции мыши на 2D-изображениях.
15. Чтобы сделать 3D реконструированные изображения microCT, откройте панель DLIT 3D Reconstruction на палитре инструментов и проверьте все длины волн, которые будут включены под вкладку Analyze. Select Reconstruct.

6. Эвтаназия

1. Подготовка и маркировка труб для тканей / органов, представляющих интерес для некропсии и соответствующих приложений вниз по течению.
2. Отделить новорожденных от плотины в шкафе биобезопасности.
3. Замочите ватный шарик в изофлюране ветеринарного класса и поместите внутрь прозрачной камеры сдерживания.
4. При сборе крови подготовьте микропипет P200 кончиком и иметь трубку 1,5 мл с 10 МЛ 5 мМ ЭДТА в качестве антикоагулянта. Ожидается объем 50-200 мкл крови.
5. Поместите новорожденного в камеру и следите за щенком, пока он не станет неподвижным.
6. Быстро удалите новорожденных и обезглавите ножницами. Если позволить дышать свежим воздухом в течение длительного периода, щенок может восстановить сознание. Новорожденные снизили емкость легких по сравнению со взрослыми мышами, и, следовательно, не дышат достаточно глубоко для эвтаназии изофлюраном в одиночку.
7. Соберите кровь из ствола у основания головы с помощью микропипеда P200. Чтобы максимизировать количество собранной крови, выполните этот шаг как можно быстрее после обезглавливания. Перечислите бактерии в крови путем последовательного разбавления и стандартного подсчета пластин, как описано в шаге 1.9.
8. Стерилизовать весь новорожденный с 70% этанола до иссечения образцов тканей.

7. Урожай тканей

1. В биобезопасности шкаф, облить новорожденных с 70% этанола для предотвращения загрязнения. Положите животное на правую сторону.
2. Используя типсы, схватить кожу в точке между животом и задней левой ногой и сделать разрез с тонкой наконечником хирургических ножниц. Продолжайте отрезать кожу, двигаясь вверх к спине. Прогресс до тех пор, пока вся селезенка подвергается воздействию.
3. Используйте типсы, чтобы схватить селезенку и удалить ее из живота, используя ножницы, чтобы отключить соединительной ткани. Поместите селезенку в раствор, подходящий для ее применения ниже по течению.
4. Чтобы получить легкие, очистить кожу грудной клетки полностью.
5. Входя в основание грудины с ножницами, удерживаемыми вертикально, вырезать вверх, пока грудная клетка не будет разделена.
6. Используйте типсы, чтобы схватить правые и левые легкие по отдельности и удалить их из грудной полости. Удалить сердце из легочной ткани, разрезая ножницами.
7. Поместите легкое в раствор, подходящий для его применения ниже по течению. Для изоляции РНК используйте 500 л гуанидина тиоцианата/фенола (GTCP). Для гистопатологии используйте 5 мл 10% нейтрально-буферного формалина.

8. Изоляция РНК от легочной ткани для экспрессии генов

1. Предварительно охладить микроцентрифуг до 4 градусов по Цельсию.
2. Фарш легочной ткани в GTCP с ножницами. Далее гомогенизируйте ткани с помощью гомогенизатора, работающего от аккумулятора. Продолжайте до тех пор, пока решение не будет как можно более однородным. Инкубация при комнатной температуре 3-5 мин.
3. Используя фильтрованные наконечники пипеток, добавьте 100 мкл хлороформа. Переверните трубку на 15 с и инкубировать 3-5 мин при комнатной температуре.
4. Центрифуга в течение 15 мин при 12000 х г.
5. Во время вращения приготовьте 1,5 мл трубок с 500 л 70% этанола. Соберите и обозначите столбцы и трубки сбора из комплекта изоляции РНК.
6. Аккуратно удалите верхний, аковый слой, не нарушая межфазный слой, образовав его во время центрифугации. Поместите aqueous слой в трубах, содержащих 70% этанола.
7. Переместите этанол и лисатную смесь на колонку в трубке сбора.
8. С этого момента следуйте протоколу об изоляции РНК до окончательного элаутации РНК.
9. Проанализируйте РНК на чистоту и количество. Используйте немедленно или храните при -80 градусов по Цельсию до дальнейшего использования.

9. синтез кДНК

1. Этикетка ПЦР труб и отложите в сторону.
2. Добавьте 1 мкг РНК в смесь реакции cDNA для каждого образца.
3. Добавьте реагенты и шаблон в трубку PCR, как описано в протоколе cDNA. Добавить фермент в смесь в последнюю минуту.
4. Поместите ПЦР трубки в термоциклер со следующими настройками пробега: 5 мин при 25 градусов по Цельсию, 40 мин при 42 градусов по Цельсию, 15 мин при 85 градусов по Цельсию и 4 градуса по Цельсию.
5. Удалите ПЦР трубки из термоциклера и немедленно используйте или храните при -20 градусов по Цельсию до дальнейшего использования.

10. Количественный цикл ПЦР в реальном времени (qPCR)

1. Подготовь коктейль смеси реакции для каждого из генов, которые будут проанализированы. Каждая 15-й реакции ПЦР требует 7,5 мкл смеси реагентов 2x, 0,75 МЛ 20X 5'-FAM-маркированы ген-специфические грунтовки / зонд, и 3,75 мл нуклеазы свободной воды. Ампликоны обычно варьируются от 60-120 bp.
2. Добавьте 3 МКЛ шаблона cDNA для каждой экспериментальной группы к соответствующим скважинам.
3. Добавьте 12 мкл генно-специфического коктейля для смеси реакции в соответствующие скважины.
4. Обложка пластины с оптической клейкой пленкой и центрифугой в течение 1 мин при 1000 х г, чтобы удалить любые пузырьки, которые могут образоваться в скважинах.
5. Поместите пластину ПЦР в термоциклер PCR в режиме реального времени.
6. Установите метод запуска следующим образом: 3 мин при 95 градусов по Цельсию, 40 циклов по 95 градусов по Цельсию в течение 15 с, а затем 60 градусов по Цельсию в течение 1 мин.
7. Анализируйте данные путем нормализации гена, представляющий интерес для внутреннего контроля, и экспресс-данные из зараженных образцов по сравнению с неинфицированными образцами управления с использованием^{формулы} 2 -КТ и преобразования чисел в_{журнале 2.}

11. Гистопатология легких

1. Удалите легкие из неонатального щенка, как описано выше.
2. Поместите ткань в объем 10% нейтрально-буферного формалина так, чтобы соотношение раствора к тканям было примерно 20:1 в течение 3-7 дней.
3. Координировать с соответствующей гистологической службы для парафина встраивания, секции, и гематоксилин и эозин (Н И Е) окрашивания. Для этой работы, Западной Вирджинии университета гистопатологии ядро было использовано. Кроме того, следуйте ранее описанным^{протоколам 19}.

12. Анализ бактериального убийства in vitro

1. Удалите селезенку из неинфицированного неонатального щенка, как описано выше, и поместите его в 40 мкм нейлоновой корзины в стерильной 60 мм чашки Петри. Повторите это и бассейн селезенки в одну трубку, которые будут собраны и гомогенизированы вместе.
2. Добавьте 5 мл PBS, дополненный 10% FBS.
3. Дезагрегировать ткань с помощью стерильного 3 мл шприца поршень до тех пор, пока одна клеточная подвеска не будет создана.
4. Соберите одноклеточную подвеску за пределами нейлоновой корзины, перенесите в центрифугу 15 мл и гранулированные клетки по 350 х г в течение 5 минут.
5. Приостановить клетки в буфере лиза красных кровяных телец (2 мл до 7-8 селезенки) и дайте ему стоять в течение 5 минут при комнатной температуре для устранения эритроцитов.
6. Вымойте сплайкоциты с PBS и гранулы, как указано выше.
7. Приостановить спеноциты в 0,25 мл PBS дополняется 0,5% BSA и 2 мМ EDTA в соответствии с ожидаемой урожайностью клеток.
8. Подсчитайте спланоциты с помощью гемоцитометра или другого соответствующего применения.
9. Изолировать клетки Ly6B.2 (миелоидная популяция гранулоцитов/воспалительных моноцитов) с иммуномагнитными бусинами в соответствии с протоколом производителя.
10. Семя Ly6B.2 -^клетки при плотности 1 x 10^{5 клеток на колодец} в черной или белой пластине 96-колодец в объеме 0,1 мл DMEM, которая содержит 10% FBS, 2 мМ глутамина и 25 мМ HEPES (полная среда).
11. Перечислите биолюминесцентную кишечную палочку, описанную в разделе 1, и подготовьте бактериальный инокулум при желаемом множественности инфекции (МВД) в итоговом объеме 0,1 мл. Это лучше всего сделать, сделав то, что необходимо для всех скважин на общий МВД в партии.
12. Добавить 0,1 мл бактериальной инокулы или полной среды в одиночку в качестве контроля. Инкубировать многоясную пластину при 37 градусах Цельсия и 5% CO₂ в течение 1 ч.
13. Замените средства массовой информации на 0,2 мл свежих полных средств массовой информации, которые содержат гентамицин (100 мкг/мл), аккуратно удалив средства массовой информации с пипеткой и добавив свежие средства массовой информации с новым наконечником пипетки. Верните культуру инкубации еще на 2 ч.
14. На 3 ч после инфекции, мера люминесценции в каждом хорошо крышкой пластины культуры снизу с помощью пластины читателя, а затем вернуть культуру инкубации.
15. Повторите измерения люминесценции в других желаемых точках времени.

Результаты

Этот протокол индуцированных бактериального сепсиса у неонатальных мышей, и мы использовали продольные интравитальной визуализации, перечисление бактерий в крови, гистологические оценки патологии, и воспалительные профили экспрессии цитокинов для изучения хода заболевания. Призна?...

Обсуждение

Наша модель подкапулярной инфекции для индуцирования бактериального сепсиса у неонатальных мышей является новым методом для изучения продольного распространения бактериальных патогенов в режиме реального времени. Интравитальная визуализация дает возможность исследовать распрост...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Insulin Syringe	Coviden	1188128012	Inoculum or PBS injection
10% Neutral Buffered Formalin	VWR	89370-094	Histopathology
ACK Lysis Buffer	Gibco	LSA1049201	Bacterial clearance assay
Animal Tattoo Ink Paste	Ketchum	KI1482039	Animal identification
Animal Tattoo Ink Green Paste	Ketchum	KI1471039	Animal identification
Anti-Ly-6B.2 Microbeads	Miltenyi Biotec	130-100-781	Cell isolation
Escherichia coli O1:K1:H7	ATCC	11775
Escherichia coli O1:K1:H7-lux (expresses luciferase)	N/A	N/A	Constructed in-house at WVU
E.Z.N.A. HP Total Extraction RNA Kit	Omega Bio-tek	R6812	RNA extration
DPBS, 1X	Corning	21-031-CV
Difco Tryptic Soy Agar	Becton, Dickinson and Company	236950	Bacterial growth
IL-1 beta Primer/Probe (Mm00434228)	Thermo Fisher Scientific	4331182	Cytokine expression qPCR
IL-6 Primer/Probe (Mm00446190)	Thermo Fisher Scientific	4331182	Cytokine expression qPCR
iQ Supermix	Bio-Rad	1708860	Real-time quantitative PCR
iScript cDNA Synthesis Kit	Bio-Rad	1708891	cDNA synthesis
Isolation Buffer	Miltenyi Biotec	N/A	Bacterial clearance assay
IVIS Spectrum CT and Living Image 4.5 Software	Perkin Elmer	N/A	Intravital imaging
LB Broth, Lennox	Fisher BioReagents	BP1427-500	Bacterial growth
EASYstrainer (Nylon Basket)	Greiner Bio-one	542 040	Cell strainer
SpectraMax iD3	Molecular Devices	N/A	Plate reader
Pellet Pestle Motor	Grainger	6HAZ6	Tissue homogenization
Polypropylene Pellet Pestles	Grainger	6HAY5	Tissue homogenization
Prime Thermal Cycler	Techne	3PRIMEBASE/02	cDNA synthesis
TNF-alpha Primer/Probe (Mm00443258)	Thermo Fisher Scientific	4331182	Cytokine expression qPCR
TriReagent (GTCP)	Molecular Research Center	TR 118	RNA extration