Un modelo de imagen neonatal de sepsis bacteriana gram-negativa

Resumen

La infección de ratones neonatales con E. coli O1:K1:H7 bioluminiscente produce una infección séptica con inflamación pulmonar significativa y patología pulmonar. Aquí, describimos procedimientos para modelar y estudiar más a fondo la sepsis neonatal utilizando imágenes intravitales longitudinales en paralelo con la enumeración de cargas bacterianas sistémicas, perfiles inflamatorios e histopatología pulmonar.

Resumen

Los neonatos tienen un mayor riesgo de sepsis bacteriana debido al perfil inmune único que muestran en los primeros meses de vida. Hemos establecido un protocolo para estudiar la patogénesis de E. coli O1:K1:H7, un serotipo responsable de altas tasas de mortalidad en neonatos. Nuestro método utiliza imágenes intravitales de cachorros neonatales en diferentes momentos durante la progresión de la infección. Esta imagen, paralela a la medición de bacterias en la sangre, el perfilo inflamatorio y la histopatología tisular, significa un enfoque riguroso para entender la dinámica de la infección durante la sepsis. En el informe actual, modelamos dos inóculos infecciosos para la comparación de las cargas bacterianas y la gravedad de la enfermedad. Encontramos que la infección subescapular conduce a la infección diseminada por 10 h después de la infección. A las 24 horas, la infección de E. coli luminiscente era abundante en la sangre, los pulmones y otros tejidos periféricos. La expresión de citoquinas inflamatorias en los pulmones es significativa a las 24 h, y esto es seguido por la infiltración celular y la evidencia de daño tisular que aumenta con la dosis infecciosa. Las imágenes intravitales tienen algunas limitaciones. Esto incluye un umbral de señal luminiscente y algunas complicaciones que pueden surgir con los neonatos durante la anestesia. A pesar de algunas limitaciones, encontramos que nuestro modelo de infección ofrece una visión para entender la dinámica longitudinal de la infección durante la sepsis murina neonatal, que no ha sido examinada a fondo hasta la fecha. Esperamos que este modelo también se pueda adaptar para estudiar otras infecciones bacterianas críticas durante la vida temprana.

Introducción

La sepsis bacteriana es una preocupación significativa para los neonatos que presentan un perfil inmune único en los primeros días de vida que no proporciona una protección adecuada contra la infección¹. La sepsis neonatal sigue siendo un problema de atención médica importante en los Estados Unidos que representa más de 75.000 casos anuales solo en los Estados Unidos². Para estudiar estas infecciones en profundidad, se requieren nuevos modelos animales que recapitulan aspectos de la enfermedad humana. Hemos establecido un modelo de infección de ratón neonatal utilizando Escherichia coli,O1:K1:H7³. E. coli es la segunda causa principal de sepsis neonatal en los Estados Unidos, pero responsable de la mayoría de la mortalidad asociada a la sepsis^4,5. Sin embargo, es la causa principal cuando los bebés prematuros y con muy bajo peso al nacer (VLBW) se consideran independientemente⁵. El serotipo K1 se asocia con mayor frecuencia con infecciones invasivas del torrente sanguíneo y meningitis en neonatos^6,7. Actualmente, no hay otras opciones de tratamiento más allá de los antibióticos y la atención de apoyo. Mientras tanto, las tasas de resistencia a los antibióticos siguen aumentando para muchas bacterias patógenas, con algunas cepas de E. coli resistentes a una multitud de antibióticos comúnmente utilizados en el tratamiento⁸. Por lo tanto, es imperativo que sigamos generando métodos para estudiar los mecanismos de la sepsis y la respuesta del huésped en los neonatos. Estos resultados pueden ayudar a mejorar los tratamientos actuales y los resultados de la infección.

El estado inmunológico de los neonatos se caracteriza por diferencias fenotípicas y funcionales en comparación con los adultos. Por ejemplo, se ha demostrado que los niveles elevados de citoquinas antiinflamatorias y reglamentarias, como la interleucina (IL)-10 y la IL-27, se producen por macrófagos derivados de la sangre del cordón umbilical y están presentes a niveles mayores en el suero de neonatos muriados^9,10,11. Esto es consistente con los niveles más bajos de α IFN, IFN-ɣ, IL-12 y TNF-α que se notifican con frecuencia de células neonatales en comparación con las contrapartes adultas¹⁰. Además, el sistema inmunitario neonatal está sesgado hacia una respuesta de la célula T Th2 y reguladora en comparación con los adultos¹². Un número elevado de neutrófilos, células T, células B, células NK y monocitos también están presentes en los neonatos, pero con deficiencias funcionales significativas. Esto incluye defectos en la expresión de marcadores de superficie celular y presentación de antígenos que sugieren inmadurez^13,14,15. Además, los neutrófilos neonatales son significativamente deficientes en su capacidad de migrar a factores quimiotácticos^16. Las células supresoras derivadas de mieloides (MDSC) también se encuentran en niveles elevados en neonatos y recientemente se ha demostrado que son una fuente de IL-27^11. Los MDSC son altamente supresivos hacia las células T^17. Colectivamente, estos datos demuestran limitaciones en la inmunidad neonatal que prestan a una mayor susceptibilidad a la infección.

Para estudiar la progresión de la carga bacteriana y diseccionar las respuestas inmunitarias del huésped protector durante la sepsis neonatal, hemos desarrollado un nuevo modelo de infección. Los ratones neonatales en los días 3-4 de vida son difíciles de inyectar en el espacio intraperitoneal o en la vena de la cola. En nuestro modelo, día 3 o 4 cachorros se administran el inóculo bacteriano o PBS por vía subcutánea en la región escapular. Una infección sistémica se desarrolla y utilizando E. coli luminiscente O1:K1:H7, podemos imaginar longitudinalmente ratones neonatales individuales para seguir la carga bacteriana diseminada en los tejidos periféricos. Este es el primer modelo reportado para utilizar imágenes intravitales para entender la cinética de la diseminación de bacterias durante la sepsis en neonatos muridos^3.

Aquí, describimos un protocolo para inducir infecciones sépticas de E. coli en ratones neonatales^3. Describimos cómo preparar el inóculo bacteriano para inyección, y cómo cosechar tejido para la evaluación de la patología, la medición de marcadores inflamatorios por análisis de expresión génica, y la enumeración de la carga bacteriana. Además, también se describe el uso de E. coli luminiscente para imágenes intravitales de neonatos infectados y la cuantificación de la matanza bacteriana por parte de células inmunitarias neonatales. Estos protocolos también pueden adaptarse para estudiar otras infecciones bacterianas importantes en neonatos. Los datos presentados aquí representan un enfoque novedoso general para entender la dinámica de la infección en un modelo de sepsis neonatal traducible.

Protocolo

Todos los procedimientos fueron aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales de Virginia Occidental y llevados a cabo de acuerdo con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio por el Consejo Nacional de Investigación¹⁸.

1. Preparación del Inóculo Bacterial

1. Raya una placa de agar de soja tríptica (TSA) con un bucle de inoculación para el aislamiento de una sola colonia de un stock congelador de E. coli O1:K1:H7-lux que expresa establemente la luciferasa y lleva resistencia a la kanamicina³. Incubar durante la noche a 37oC.
2. Al día siguiente permitir que el caldo de Luria (LB) llegue a temperatura ambiente (25 oC) en un gabinete de bioseguridad.
3. Bajo una campana del gabinete de bioseguridad, identifique una sola colonia de la placa rayada y inocularla en 3 ml de LB complementada con kanamicina (30 g/ml). Incubar durante la noche a 37oC con agitación (220 rpm). Esta es la cultura de inicio.
4. Diluir el cultivo de arranque 1:100 en un fresco de 3 ml de LB bajo una campana de gabinete de bioseguridad y devolverlo a la incubadora durante 2-3 h a 37 oC con temblor (220 rpm). Esta es la cultura de las acciones.
5. Lea la densidad óptica (OD) del cultivo en blanco y de stock a 600 nm utilizando un espectrofotómetro. Añadir 100 l de LB (que no contenga bacterias) en un pocó si hay una placa de ensayo de fondo plano de 96 pozos; este es el espacio en blanco. A continuación, añada 100 l del cultivo de stock a un pozo separado. Repita el proceso para dos réplicas adicionales. La absorbancia se lee con un lector de placas.
6. Restar la absorbancia en blanco del valor de absorción del cultivo de stock (el valor de OD) y comparar con una curva de crecimiento previamente generada y validada para determinar una aproximación de la densidad bacteriana en el cultivo de stock para la preparación de la dosis infecciosa.
7. Generar inóculos objetivo dependiendo de la pregunta de investigación. Para este estudio se utilizaron inóculo objetivo de 2 x^{10 6} (bajo) y 7 x^{10 6} (altos) unidades formadoras de colonias (altas) por ratón (/ratón).
   1. Divida la dosis objetivo por ratón (Dosis_T) por la concentración estimada de bacterias en el cultivo de stock (Stock) para obtener el volumen de bacterias necesarias del tubo de stock (V_S).
   2. Multiplicar V_S por el número de ratones (N_M) que necesitan ser infectados junto con suficiente para 5-10 extras para la cantidad total de bacterias necesarias para la infección más 5-10 dosis adicionales. Retire este volumen del tubo de almacenamiento y agréguelo a un nuevo tubo de centrífuga.
   3. Utilice la siguiente ecuación:
      Dosis_T/Stock á V_S x N_M - volumen total (V_T) de bacterias que se eliminarán del tubo de stock.

8. Centrifugar las bacterias a 2.000 x g durante 5 min a 4 oC y resuspender el gránulo bacteriano en 50 l de PBS (pH 7.2-7.6) por ratón a infectar (p. ej., para 10 dosis de 2 x 10⁶ bacterias cada dosis, el pellet de 2 x 10⁷ bacterias se resuspendía en 500 l de PBS). Una vez más, se recomienda preparar más inóculo del necesario. Prepare un volumen igual de PBS solo para inoculaciones de control. Mantener el control infeccioso del inóculo y el PBS sobre el hielo hasta la infección.
9. Realizar siete diluciones seriales de diez veces en PBS en una placa de dilución inferior de plástico de 96 pozos, y la placa de 25 l de las diluciones en duplicado en placas TSA cuadrantes complementadas con kanamicina (30 g/ml) para enumerar la cantidad real de bacterias administradas. Incubar a 37oC durante la noche para la formación de colonias antes de la enumeración.

2. Identificación animal

1. Organizar un número suficiente de parejas reproductoras de tal manera que las camadas puedan sincronizarse para los cachorros emparejados por edad. La variabilidad de la edad de ± 1 día es aceptable.
2. Identifique un ratón hembra C57BL/6 embarazada y monitoree el nacimiento de la camada antes del experimento planeado para determinar con precisión la edad.
3. Para distinguir entre el control y los cachorros infectados de 3 o 4 días de edad, utilice un par de tijeras de iris pequeñas de punta fina para cortar los extremos de las colas de los cachorros de control solamente. Los cachorros infectados no reciben recortes de cola. Antes de cortar la cola, desinfectar la piel con una bola de algodón empacada en 70% etanol. Aplique presión en el extremo de la cola con una bola de algodón o gasa según sea necesario.
   NOTA: Este procedimiento se realiza bajo una campana de gabinete de bioseguridad. Un recorte de cola de aproximadamente 1/8 de pulgada es suficiente.
4. Para identificar cachorros dentro del control y grupos infectados, utilice una jeringa de insulina de 1 ml con una aguja permanente de 28 G x 1/2'' para tatuar las colas de los cachorros. Antes de tatuar, desinfectar la piel con una bola de algodón empacada en 70% etanol. Este procedimiento se realiza bajo una campana de gabinete de bioseguridad.
5. Para tatuar la cola, aplica tinta de tatuaje animal en la punta de la aguja. A continuación, sujeta cuidadosamente al cachorro con una mano, con la cola completamente expuesta. Inserte suavemente la aguja debajo de la piel, manteniendo un nivel superficial de profundidad, y mueva la aguja paralela con la piel unos pocos milímetros hasta que se haya creado una pequeña marca, o punto. Espere unos segundos antes de retirar lentamente la aguja de debajo de la piel, para evitar el exceso de la falta de aire de la tinta que se desprende de debajo de la piel.
6. Aplique presión sobre la herida con una bola de algodón o una gasa según sea necesario. Retire el exceso de tinta de tatuaje en la superficie de la piel con 70% de etanol.
7. Repita este proceso con ratones posteriores en los grupos infectados y de control, mientras que la adición de un punto adicional con cada cachorro sucesivo tatuado (por ejemplo, cachorro 1 tendrá 1 punto en su cola, cachorro 2 tendrá dos puntos en su cola, etc.).
   NOTA: Para una capa adicional de identificación, se recomienda utilizar colores separados de tinta de tatuaje animal para el control y grupos infectados.

3. Inoculación subescapular

NOTA: Para este estudio, se realizaron 2 experimentos con un grupo de dosis baja y dosis altas designados para cada experimento. En el primer experimento, 7 cachorros recibieron la dosis baja de inóculo (4 cachorros se utilizaron como controles), y 5 cachorros de una camada separada recibieron la dosis alta (3 cachorros se utilizaron como controles). Los cachorros del experimento 1 proporcionaron datos solo para el punto de tiempo de 24 horas. En el segundo experimento, se les dio a 8 cachorros la dosis baja de inóculo (se utilizaron 2 cachorros como controles), y 6 cachorros recibieron la dosis alta de inóculo (2 cachorros se utilizaron como controles). Los cachorros del experimento 2 proporcionaron datos para los puntos de tiempo de 0, 10 y 24 horas.

1. Los cachorros de partido de edad ≤ 1 día. Asigne cada camada como una dosis baja o una camada de dosis alta. Dentro de una camada asignar aleatoriamente cachorros como un control o cachorro infectado.
2. En el día 3 o 4 postnatal, registre los pesos de todos los cachorros antes de la inoculación con E. coli-lux o el control PBS. Separe la presa de los cachorros durante este tiempo para asegurarse de que no se mueven durante la infección.
3. Dentro de un gabinete de bioseguridad utilizando una aguja de insulina, aspirar PBS o el inóculo E. coli-lux. Para este trabajo, se utilizaron inóculos de 2 x 10⁶ y 7 x 10^{6 6} UFC por ratón. Mantenga el inóculo infeccioso y el PBS en hielo hasta la administración mediante inyección subescapular.
4. Coloque el neonato sobre una superficie limpia en la capucha del gabinete de bioseguridad y levante la piel en la nuca como si fuera a escrúpulos al cachorro.
5. En el espacio creado ahora entre la piel y el músculo del animal, inserte la aguja, bisele, justo debajo de la piel e inyecte 50 l de PBS o E. coli-lux. Suelte simultáneamente la porción pellizcada de la piel para evitar el contraflujo de la inyección.
6. Retire la aguja lentamente y con cuidado. Coloque a los cachorros de nuevo con las presas después de que las inyecciones hayan terminado.
   NOTA: Debido a su etapa anatómica en el desarrollo, es técnicamente difícil administrar una vena de cola o una inyección intraperitoneal a los cachorros neonatales en el día 3-4. Por lo tanto, la ruta de infección subescapular fue elegida para este estudio debido a la facilidad de ejecución.

4. Evaluación de la enfermedad y criterios finales

1. Controlar a los cachorros dos veces al día durante toda la duración de la infección. Tenga en cuenta cualquier anomalía en la apariencia.
2. Registre los pesos como una medida objetiva de la morbilidad.
3. Además de los cambios de peso, probar la capacidad de los cachorros para a derecharse colocando el neonato en el lado dorsal. Los animales enfermos no podrán dar la vuelta al lado ventral y a los pies o completarán esta acción con dificultad.
4. Compruebe lo siguiente para marcar los animales cerca de los criterios finales: menos del 85% del peso corporal normal; disminución del movimiento y la incapacidad para encarnarse; decoloración de la piel y un aspecto más gris o transparente en comparación con el rosa; sensación de frío al tacto, indicativo de disminución de la temperatura corporal y hematomas hemorrágicos a lo largo de los lados, también indicativo de enfermedad avanzada.
   NOTA: Si los neonatos no han podido aumentar de peso durante dos días y se ajustan a cualquiera de las descripciones de los pasos 4.4, han cumplido los criterios de punto final. Los cachorros que reciben la dosis alta a menudo cumplen los criterios finales en 24 h. Los cachorros de control dentro de las camadas de dosis baja y alta serán eutanasiados al mismo tiempo para permitir un análisis comparativo entre los grupos de control y experimentales. Proceda a la sección de eutanasia a continuación.

5. Imágenes in vivo de la carga bacteriana

1. Utilice un imager microCT y un software para la creación de imágenes y el análisis posterior.
   NOTA: El color de la piel del cachorro no afecta la calidad de las imágenes.
2. Coloque la jaula con ratones neonatales infectados por E. coli-luxy presa en una capucha de flujo laminar de nivel BSL-2. Retire los ratones que se van a tomar la imagen y colóquelos en una cámara de isoflurano transparente dentro de la capucha. Se recomienda comenzar con controles no infectados para medir la cantidad de isoflurano necesaria.
3. Abra el software del ordenador conectado al microCT. Inicializar el sistema y esperar a que la temperatura del CCD se bloquee a -90 oC.
4. Encienda el vaporizador de isoflurano y ajuste el dial al flujo de isoflurano del 5%. Mantener los ratones en la cámara con esta mezcla de isoflurano durante 20-30 s hasta que dejen de moverse; algunos ratones pueden necesitar tiempos de exposición a la anestesia más largos o más cortos. Una vez que los ratones dejan de moverse, son lo suficientemente anestesiados y pueden ser imageados.
5. Mueva los ratones a la cámara de imágenes microCT y colóquelos en la caja de imágenes en la posición propensa, con narices orientadas perpendicularmente a los conos nasales. Use cera dental para sujetar suavemente los pies en la caja de imágenes para limitar cualquier movimiento. Se pueden tomar imágenes de hasta 4 ratones neonatales a la vez.
6. Gire el vaporizador de isoflurano a un flujo de 2-4% para mantener a los ratones anestesiados durante la toma de imágenes. Cierre la puerta de la cámara de imágenes microCT. Revise a los ratones unos segundos más tarde. Si comienzan a moverse, douse una bola de algodón en isoflurano y sosténlo a la nariz del animal moviéndose durante 5 segundos para anestesiar. Mantenga la bola de algodón cerca de los animales durante la toma de imágenes. Tenga cuidado de no anestesiar y terminar con los ratones.
7. Con el software, elija la opción Luminescent para la creación de imágenes. Utilice un filtro de excitación establecido en Bloquear y el filtro de emisión establecido en Open, 500 nm, 520 nm, 560 nm, 580 nm, 600 nm y 620 nm. Habrá siete filtros de emisión total configurados para luminiscencia.
8. Imagen de los ratones en cada punto de tiempo (0, 10 y 24 h después de la infección [hpi]) y guarde todas las imágenes en una carpeta para cada punto de tiempo. Devolver a los cachorros a la jaula con la presa y comprobar que todos los cachorros se han recuperado de la anestesia.
9. Para analizar imágenes 2D, abra imágenes en el software. Cambie las unidades a Radiance (fotones); esto se convertirá en el Flujo Total (fotones/segundo).
10. Analice solo un conjunto de imágenes con sus múltiples filtros de emisión a la vez. De cada conjunto de imágenes, tome nota de los valores de resplandor mínimo y máximo situados en la esquina inferior derecha de cada imagen (por ejemplo, si hay 7 filtros de emisión, habrá 7 imágenes y 7 valores mínimos y máximos). Repita el proceso para cada conjunto de imágenes que se va a comparar.
11. Para determinar una escala que abarque los valores y la luminiscencia de todas las imágenes, localice el valor mínimo más bajo y el valor máximo más alto para cada conjunto de imágenes. Para este estudio, las imágenes de filtro abierto se utilizaron como representante.
    1. Resalte y abra la imagen de su elección para cambiar la escala. En la Paleta de herramientas, haga clic en la pestaña Ajuste de imagen y cambie la Escala de color a los valores mínimos y máximos más altos identificados anteriormente. Guarde cada conjunto de imágenes como TIFF. Analice individualmente cada punto de tiempo de esta manera para asegurarse de que se muestra la escala correcta.
12. Para cuantificar el flujo total (cantidad de señal luminiscente por ratón) para cada ratón individual, abra una imagen como se describió anteriormente en el paso 5.9-5.10. Abra la pestaña Herramientas de ROI en la Paleta de herramientas y seleccione la herramienta de círculo. Elija 1 círculo si analiza un área de luminiscencia.
13. Mueva el ROI a Superponer en el área de luminiscencia. Ajuste el tamaño del ROI si es necesario.
    NOTA: Si es necesario realizar un ajuste, ajuste los ROI en otras imágenes de forma comparable para mantener la coherencia. Elija Medir ROI . Se abrirá la ventana Mediciones de ROI que muestra Total Flux (p/s), Average Radiance (p/s/cm²/sr), Desviación estándar de radiación, Radiancia mínima y Radiancia máxima.
14. Registre las mediciones de flujo total para cada conjunto de imágenes. Este número es la cantidad cuantificada de luminiscencia en el ratón en imágenes 2D.
15. Para crear imágenes microCT reconstruidas en 3D, abra el panel Reconstrucción 3D de DLIT en la paleta de herramientas y compruebe todas las longitudes de onda que se incluirán en la pestaña Analizar .

6. Eutanasia

1. Preparar y etiquetar tubos para tejidos/órganos de interés para la necropsía y aplicaciones posteriores apropiadas.
2. Separe a los neonatos de la presa en un gabinete de bioseguridad.
3. Remoje una bola de algodón en isoflurano de grado veterinario y colóquela dentro de una cámara de contención transparente.
4. Si recoge sangre, prepare una micropipeta P200 con una punta y tenga un tubo de 1,5 ml con 10 l de EDTA de 5 mM como anticoagulante. Se espera un volumen de 50-200 l de sangre.
5. Coloque un neonato en la cámara y monitoree al cachorro hasta que quede inmóvil.
6. Rápidamente, retire el neonato y decapitar con tijeras. Si se le permite respirar aire fresco durante un período prolongado, el cachorro puede recuperar la conciencia. Los neonatos han reducido la capacidad pulmonar en relación con los ratones adultos y, por lo tanto, no respiran lo suficientemente profundamente para la eutanasia solo por isoflurano.
7. Recoger la sangre del tronco en la base de la cabeza con una micropipeta P200. Para maximizar la cantidad de sangre recolectada, realice este paso lo más rápido posible después de la decapitación. Enumerar las bacterias en la sangre por dilución en serie y conteo de placas estándar como se describe en el paso 1.9.
8. Esterilice todo el neonato con 70% de etanol antes de la escisión de las muestras de tejido.

7. Recolección de tejidos

1. Dentro de un gabinete de bioseguridad, douse el neonato con 70% etanol para evitar la contaminación. Poner el animal en su lado derecho.
2. Usando fórceps, agarra la piel en un punto entre el abdomen y la pierna izquierda trasera y haz una incisión con tijeras quirúrgicas de punta fina. Continúe cortando la piel moviéndose hacia arriba hacia la parte posterior. Progresa hasta que todo el bazo esté expuesto.
3. Usa los fórceps para agarrar el bazo y extraerlo del abdomen, usando tijeras para desconectar el tejido conectivo. Coloque el bazo en la solución adecuada para su aplicación posterior.
4. Para obtener los pulmones, pelar la piel del pecho por completo.
5. Entrando en la base del esternón con tijeras sujetas verticalmente, corte hacia arriba hasta que la caja torácica se divida.
6. Usa fórceps para agarrar los pulmones derecho e izquierdo individualmente y retíralos de la cavidad torácica. Retire el corazón del tejido pulmonar cortando con tijeras.
7. Coloque el pulmón en la solución adecuada para su aplicación posterior. Para el aislamiento de ARN, utilice 500 l de tiocianato/fenol de guanidina (GTCP). Para la histopatología, utilice 5 ml de formalina con búfer neutro al 10%.

8. Aislamiento de ARN del tejido pulmonar para la expresión génica

1. Pre-enfriar la microcentrífuga a 4 oC.
2. Mince el tejido pulmonar en GTCP con tijeras. A continuación, homogeneizar el tejido con un homogeneizador alimentado por batería. Continúe hasta que la solución sea lo más uniforme posible. Incubar a temperatura ambiente durante 3-5 min.
3. Usando puntas de pipeta filtradas, agregue 100 l de cloroformo. Invertir el tubo durante 15 s e incubar 3-5 min a temperatura ambiente.
4. Centrífuga durante 15 min a 12.000 x g.
5. Durante el giro, preparar tubos de 1,5 ml con 500 l de etanol al 70%. Ensamble y etiquete las columnas y los tubos de recogida del kit de aislamiento de ARN.
6. Retire cuidadosamente la capa superior y acuosa sin alterar la capa de interfase que se formó durante la centrifugación. Coloque la capa acuosa en los tubos que contienen 70% de etanol.
7. Mueva la mezcla de etanol y izado a la columna del tubo de recogida.
8. A partir de este momento, siga el protocolo de producto comercial del kit de aislamiento de ARN hasta la elución final del ARN.
9. Analice el ARN en busca de pureza y cantidad. Utilizar inmediatamente o conservar a -80 oC hasta su uso posterior.

9. síntesis de ADNn.

1. Etiquetar los tubos PCR y reservar.
2. Añadir 1 g de ARN a la mezcla de reacción del ADNn a larta de CINA para cada muestra.
3. Agregue los reactivos y la plantilla al tubo PCR como se describe en el protocolo cDNA. Añadir la enzima a la mezcla en último lugar.
4. Coloque los tubos de PCR en un termociclador con los siguientes ajustes de carrera: 5 min a 25oC, 40 min a 42oC, 15 min a 85oC y 4oC de retención final.
5. Retire los tubos PCR del termociclo y úselos inmediatamente o guárdelos a -20 oC hasta su uso posterior.

10. Ciclo de PCR cuantitativo en tiempo real (qPCR)

1. Preparar un cóctel de mezcla de reacción para cada uno de los genes a analizar. Cada reacción de PCR de 15 l requiere 7,5 l de mezcla de reactivos de 2x, 0,75 l de imprimación/sonda específica de 20X 5'-FAM y 3,75 ml de agua sin nucleasas. Los amplicons suelen oscilar entre 60-120 bp.
2. Agregue 3 l de plantilla de ADNc para cada grupo experimental a los pozos apropiados.
3. Agregue 12 l del cóctel de mezcla de reacción específico del gen a los pomos apropiados.
4. Cubra la placa con película adhesiva óptica y centrífuga durante 1 min a 1.000 x g para eliminar cualquier burbuja que pueda haberse formado en los pozos.
5. Coloque la placa PCR en un termociclador PCR en tiempo real.
6. Establezca el método de carrera de la siguiente manera: 3 min a 95 oC, 40 ciclos de 95 oC durante 15 s seguidos de 60 oC durante 1 min.
7. Analizar los datos normalizando el gen de interés a un control interno y expresar los datos de muestras infectadas en relación con las muestras de control no infectadas utilizando la fórmula 2^-Ct y una transformación del registro₂ de los números.

11. Histopatología pulmonar

1. Retire los pulmones del cachorro neonatal como se describió anteriormente.
2. Coloque el tejido en un volumen de formalina de búfer neutro al 10% de modo que la proporción de solución al tejido sea de aproximadamente 20:1 durante 3-7 días.
3. Coordinar con un servicio de histología apropiado para la incrustación de parafina, seccionamiento, y hematoxilina y eosina (H&E) tinción. Para este trabajo, se utilizó el Núcleo de Histopatología de la Universidad de Virginia Occidental. Alternativamente, siga los protocolos descritos anteriormente¹⁹.

12. Ensayo de muerte bacteriana in vitro

1. Retire el bazo del cachorro neonatal no infectado como se describió anteriormente y colóquelo en una cesta de nylon de 40 m dentro de un plato estéril de 60 mm de Petri. Repita esto y agrupe el bazo en un tubo para ser cosechado y homogeneizado juntos.
2. Añadir 5 mL de PBS complementado con 10% FBS.
3. Desagregue el tejido utilizando un émbolo estéril de jeringa de 3 ml hasta que se cree una sola suspensión celular.
4. Recoger la suspensión de una sola célula fuera de la cesta de nylon, transferir a un tubo centrífuga de 15 ml, y células de pellet a 350 x g durante 5 min.
5. Suspenda las células en el tampón de lylisis de glóbulos rojos (2 ml para hasta 7-8 bazos) y déjelo reposar durante 5 minutos a temperatura ambiente para eliminar los eritrocitos.
6. Lave los splenocitos con PBS y pellets como se indica arriba.
7. Suspenda los espleocitos en 0,25 ml de PBS complementados con 0,5% de BSA y EDTA de 2 mM según el rendimiento celular esperado.
8. Cuente los esplocitos utilizando un hemocicómetro u otra aplicación apropiada.
9. Aislar Ly6B.2⁺ (población mieloide de granulocitos/monocitos inflamatorios) células con perlas inmunomagnéticas según el protocolo del fabricante.
10. Semilla Ly6B.2⁺ células a una densidad de 1 x 10⁵ células por pozo en una placa negra o blanca de 96 pozos en un volumen de 0,1 ml de DMEM que contiene 10% FBS, 2 mM de glutamina y 25 mM HEPES (medio completo).
11. Enumerar la E. coli bioluminiscente como se describe en la sección 1 y preparar el inóculo bacteriano en la multiplicidad de infección deseada (MOI) en un volumen final de 0,1 ml. Esto se hace mejor haciendo lo que es necesario para todos los pozos en un MOI común en lote.
12. Añadir 0,1 ml de inóculo bacteriano o medio completo solo como control. Incubar la placa multi-pozo a 37oC y 5% de_CO2 durante 1 h.
13. Sustituya el soporte por 0,2 ml de medios nuevos y completos que contengan gentamicina (100 g/ml) retirando suavemente los medios con una pipeta y añadiendo medios frescos con una nueva punta de pipeta. Devolver el cultivo a la incubación durante 2 h adicionales.
14. A las 3 horas después de la infección, mida la luminiscencia en cada pocólite de la placa de cultivo tapada desde la parte inferior usando un lector de placas y luego devuelva el cultivo a la incubación.
15. Repita las medidas de luminiscencia en otros puntos de tiempo deseados.

Resultados

Este protocolo indujo sepsis bacteriana en ratones neonatales, y utilizamos imágenes intravitales longitudinales, enumeración de bacterias en la sangre, evaluaciones histológicas de patología y perfiles inflamatorios de expresión de citoquinas para estudiar el curso de la enfermedad. Se observaron signos de morbilidad en cachorros neonatales infectados con inóculos bajos (2 x^{10 6} UFC) y altos (7 x 10⁶ UFC) de E.coli a lo largo del tiempo. Los cachorros que recibieron el mayor inóculo...

Discusión

Nuestro modelo de infección subescapular para inducir sepsis bacteriana en ratones neonatales es un método novedoso para estudiar la propagación longitudinal de patógenos bacterianos en tiempo real. La imagen intravital ofrece la oportunidad de explorar la diseminación bacteriana en tiempo real en neonatos. Esto es fundamental para entender la cinética de la diseminación bacteriana y para seguir estudiando la respuesta del huésped y el daño en la fase apropiada de la enfermedad. A los cachorros de ratón se les ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Insulin Syringe	Coviden	1188128012	Inoculum or PBS injection
10% Neutral Buffered Formalin	VWR	89370-094	Histopathology
ACK Lysis Buffer	Gibco	LSA1049201	Bacterial clearance assay
Animal Tattoo Ink Paste	Ketchum	KI1482039	Animal identification
Animal Tattoo Ink Green Paste	Ketchum	KI1471039	Animal identification
Anti-Ly-6B.2 Microbeads	Miltenyi Biotec	130-100-781	Cell isolation
Escherichia coli O1:K1:H7	ATCC	11775
Escherichia coli O1:K1:H7-lux (expresses luciferase)	N/A	N/A	Constructed in-house at WVU
E.Z.N.A. HP Total Extraction RNA Kit	Omega Bio-tek	R6812	RNA extration
DPBS, 1X	Corning	21-031-CV
Difco Tryptic Soy Agar	Becton, Dickinson and Company	236950	Bacterial growth
IL-1 beta Primer/Probe (Mm00434228)	Thermo Fisher Scientific	4331182	Cytokine expression qPCR
IL-6 Primer/Probe (Mm00446190)	Thermo Fisher Scientific	4331182	Cytokine expression qPCR
iQ Supermix	Bio-Rad	1708860	Real-time quantitative PCR
iScript cDNA Synthesis Kit	Bio-Rad	1708891	cDNA synthesis
Isolation Buffer	Miltenyi Biotec	N/A	Bacterial clearance assay
IVIS Spectrum CT and Living Image 4.5 Software	Perkin Elmer	N/A	Intravital imaging
LB Broth, Lennox	Fisher BioReagents	BP1427-500	Bacterial growth
EASYstrainer (Nylon Basket)	Greiner Bio-one	542 040	Cell strainer
SpectraMax iD3	Molecular Devices	N/A	Plate reader
Pellet Pestle Motor	Grainger	6HAZ6	Tissue homogenization
Polypropylene Pellet Pestles	Grainger	6HAY5	Tissue homogenization
Prime Thermal Cycler	Techne	3PRIMEBASE/02	cDNA synthesis
TNF-alpha Primer/Probe (Mm00443258)	Thermo Fisher Scientific	4331182	Cytokine expression qPCR
TriReagent (GTCP)	Molecular Research Center	TR 118	RNA extration