腰椎不稳定的鼠标模型

摘要

我们通过切除L_3–L5旋转过程以及超脊椎和间旋韧带和寄生肌肉分离，开发了腰椎间盘退化小鼠模型。

摘要

椎间盘退化 （IDD） 是导致低背痛的常见病理变化。了解病理过程和评估新药需要适当的动物模型。在这里，我们介绍了一个手术诱导的腰椎不稳定（LSI）小鼠模型，从手术后1周开始开发DD。详细地，麻醉下的老鼠通过低背皮肤切口、L₃-L₅脊柱过程暴露、寄生肌肉分离、过程和韧带切除以及皮肤闭合来操作。L_4–L5 IVD被选为观察结果。LSI 模型在早期通过末板的孔隙和肥大开发腰椎 IDD，椎间盘体积下降，中间阶段核纸浆收缩，晚期腰椎 （L_5）骨质流失。LSI鼠标型号具有可操作性强、对特殊设备无要求、可重复性强、价格低廉、IDD开发周期相对较短等优点。然而，LSI手术仍然是在手术后第一周内引起炎症的创伤。因此，这种动物模型适合研究腰椎IDD。

引言

椎间盘退化（IDD）常见于衰老甚至年轻人造成的许多因素^1。为患有 IDD、导致背痛和运动障碍的患者进行手术，通常在后期或严重情况下进行，并具有潜在的风险，如非团结或感染²。理想的非手术治疗需要全面了解 IDD 机制。IDD 动物模型是研究 IDD 机制和评估 IDD 治疗的重要工具。

大型动物被选为IDD模型，如灵长类动物、绵羊、山羊、狗和兔子，它们在很大程度上与人类解剖结构相似，而且椎间盘（IVDs）3、4、5、6、7、8的大小具有很强的可操作性。然而，这些动物模型是耗时和成本密集的^9。鼠标IVD是基于纵横比的几何测量，核纸浆与圆盘面积比，以及规范化高度¹⁰的人类IVD的不良表现。尽管大小不同，小鼠腰椎IVD段表现出类似于人类IVD的机械特性，如压缩和躯干僵硬^11。此外，小鼠IDD模型具有成本低、IDD开发时间相对较短等优点，在进一步机械研究^{12、13、14、15}中，对转基因动物和抗体有更多的选择。

实验诱导的 IDD 模型因诱导器和应用而异。例如，拼贴酶引起的细胞外基质（ECM）退化是适合ECM再生研究^16。转基因表型适用于研究基因功能在DD过程中和基因疗法^17。安努卢斯纤维切口和烟雾模型模仿创伤和非炎症诱发的IDD^12，18。

脊柱不稳定 （SI） 导致脊柱不稳定，而脊柱不处于最佳平衡状态。它可能是由腰椎运动段的异常运动引起的，因为周围支撑组织（如韧带和肌肉）的弱点。它也是常见的后脊髓融合操作^19。SI 被认为是 IDD 的主要原因。因此，我们的目标是开发一个SI小鼠模型（专注于腰椎），模仿人类的IDD过程^20，21。

在协议中，我们介绍了通过腰椎第三（L_3）至腰椎第五（L_5）旋转过程以及超脊椎和间断韧带（图1A，B）的切除建立腰椎不稳定（LSI）小鼠模型的程序。动物模型最早在手术后1周开发IDD，如末板（EPs）中的肥大和孔隙性所示。IVD 体积在手术后 2 周内开始减少，持续 16 周，同时 IVD 评分增加，这表示 IDD 的程度。我们相信，详细和可视化的程序是有用的研究人员建立LSI小鼠模型在他们的实验室，并适用于IDD研究的需要。

研究方案

所描述的调查符合《国家卫生研究院实验室动物护理与使用指南》，并经上海中医药大学动物护理与使用委员会批准。所有的手术手术都是在深度麻醉下进行的，动物在手术的任何阶段都没有感到疼痛。

1. 手术前准备

1. 仪器灭菌:手术前在高压灭菌器械中蒸灭（121 °C，15分钟）。将仪器装在金属容器中，并加以维护，直到用于手术。
2. 手术平台设置:为手术分配至少 60 厘米 x 60 厘米的长凳区域。用75%的酒精清洁区域表面，用一次性医用毛巾盖住。将无菌手术器械包、试剂、手术用品放在区域上部 1/3 内的一次性医疗巾上。将剩余的 2/3 区域保持清洁，用于外科手术。在手术垫下方添加一个热垫，以获得热支持。
3. 动物制备
   1. 将动物（C57BL/6J小鼠，雄性，8周大）放入感应室。以 4% 的感应水平打开蒸发器，用于异氟素，4 升/分钟的氧气。动物完全麻醉后，用鼻锥保持麻醉，在手术过程中将异氟烷和氧气的麻醉分娩维持在1.5%的水平。0.4升/分钟。监测动物呼吸。
   2. 在手术过程中应用盐酸氯环素眼药膏，以防止角膜干燥。
   3. 使用小型动物修剪器将下胸部区域的手术区域剃到囊性区域顶部。用纸巾去除剃光的毛皮。
   4. 将脱毛霜涂抹在剃须区域，并将其留在那里不超过3分钟。用纱布取出奶油，用 2 mL 的 0.9% 无菌盐水冲洗。
   5. 将定制的手术圆柱形垫（图2A）放在小鼠腹部下方，以抬起腰椎，促进手术。

2. 腰椎第三至腰椎第五 （L₃– L_5）旋转过程的暴露

1. 使用食指触摸腰椎的皮下脊椎过程，后者更向外，并与胸椎和囊椎进行比较，以确定腰椎区域。
2. 用75%的酒精冲洗皮肤。使用手术刀刀片在木材区域（从中胸区到臀部）上进行 3–4 厘米的中线皮肤切口，以暴露筋膜。
3. 通过插入旋转过程尖端的后筋膜的形态识别腰椎。详细地说，第三个腰椎（L_3）到第一个囊（S_1）筋膜因其"V"形而不同于其他筋膜。最后一个"V"提示连接到第一个囊（S_1）筋膜，第一个"V"提示对应L₃旋转过程（图2B）。
4. 使用手术刀刀片（图 2C）沿两侧从 L₃到 L₅的旋转过程进行后侧侧肌肉切口。控制切口深度朝向面，以减少出血。
5. 使用两个眼力将肌肉层分开，以暴露 L₃ 到 L₅ 旋转过程和超脊髓。

3.L_3-L5旋转过程连同韧带的切除

1. 使用金星剪切（图2D）切断间夹韧带，从而分离单个旋转过程。
2. 与金星剪切剂（图2E）的交叉韧带一起重构L_3-L5旋转过程。
3. 用无菌丝编织（缝合尺寸 5.0）缝合皮肤切口，无需重新连接副脑肌肉。
4. 将盐酸氯环素眼药膏涂抹到手术部位。
5. 在LSI镇痛手术后立即施用丁丙诺啡-SR（每克小鼠体重25毫升）。
6. 将动物放在一个温暖的房间里，并在麻醉恢复期间进行监测。在将动物送回家庭笼子之前，先监测食物和水的摄入量。
7. 在手术后的前3天，每天监测动物一次。动物应该能够有正常的食欲，应该愈合没有脓，出血，或肿胀的迹象。他们可能在运动方面有轻微的损伤。
8. 仅通过从L_3-L5椎骨分离后半椎肌肉进行虚假操作。

结果

LSI小鼠模型应用于EP^{20、21、22、23}的IDD机理、IDD治疗、末板（EP）退化（如硬化症）和感官内向的研究。LSI 鼠标通过减少 IVD 体积和高度、增加 EP 体积以及增加 IVD 和 EP 分数来开发 IDD 和 EP 退行性变化（如所示）。

解剖和固定的下胸椎和腰椎由高分辨率微计算断层扫描（μCT）检查...

讨论

我们开发了腰椎不稳定小鼠模型的基础上，颈椎侧弯小鼠模型，其中从椎骨的后半椎肌肉分离，脊柱过程以及超脊椎和交叉韧带被重新切除^25。我们在腰椎上做了类似的手术，腰椎有更突出的脊柱过程。LSI 鼠标模型在腰椎中开发了类似的 IDD。

LSI 模型的优势包括可操作性强、无需特殊设备、可重复性和 IDD 开发周期相对较短。

此处介绍?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chlortetracycline Hydrochloride Eye Ointment	Shanghai General Pharmaceutical Co., Ltd.	H31021931	Prevent eye dry, Prevent wound infection
C57BL/6J male mice	Tian-jiang Pharmaceuticals Company (Jiangsu, CN)	SCXK2018-0004	Animal model
Disposable medical towel	Henan Huayu Medical Devices Co., Ltd.	20160090	Platform for surgical operation
Inhalant anesthesia equipment	MIDMARK	Matrx 3000	Anesthesia
Isoflurane	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd.	1903715	Anesthesia
Lidocaine hydrochloride	Shandong Hualu Pharmaceutical Co., Ltd.	H37022839	Pain relief
Medical suture needle	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd.	20S0401J	Suture skin
Ophthalmic forceps	Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd. Surgical Instruments Factory	JD1050	Clip the skin
Ophthalmic scissors(10cm)	Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd. Surgical Instruments Factory	Y00030	Skin incision
silk braided	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd.	11V0820	Suture skin
Small animal trimmer	Shanghai Feike Electric Co., Ltd.	FC5910	Hair removal
Sterile surgical blades(12#)	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd.	35T0707	Muscle incision
Veet hair removal cream	RECKITT BENCKISER (India) Ltd	NA	Hair removal
Venus shears	Mingren medical equipment	Length:12.5cm	Clip the muscle and spinous process