Um modelo de mouse de instabilidade lombar

Resumo

Desenvolvemos um modelo de rato de degeneração de disco intervertebral lombar por ressecção de processos spinous L₃–L_5, juntamente com ligamentos supra e inter-espinhosos e desprendimento de músculos paraspinos.

Resumo

A degeneração do disco intervertebral (IDD) é uma mudança patológica comum que leva à dor lombar. São desejados modelos animais adequados para entender os processos patológicos e avaliar novas drogas. Aqui, introduzimos um modelo de mouse de instabilidade lombar (LSI) induzido cirurgicamente que desenvolve IDD a partir de 1 semana após a operação. Em detalhes, o camundongo submetido à anestesia foi operado por incisão lombar, exposição de processos espinhosos L₃-L_5, descolamento de músculos paraspinos, ressecção de processos e ligamentos e fechamento da pele. Foram escolhidos para observação os IVDs L₄-L_5. O modelo LSI desenvolve IDD lombar por porosidade e hipertrofia em placas finais em estágio inicial, diminuição no volume de disco intervertebral, encolhimento na pulposo do núcleo em um estágio intermediário e perda óssea em vértebras lombares (L₅) em um estágio posterior. O modelo de mouse LSI tem as vantagens da forte operabilidade, sem exigência de equipamentos especiais, reprodutibilidade, inexpensivo e período relativamente curto de desenvolvimento de IDD. No entanto, a operação LSI ainda é um trauma que causa inflamação na primeira semana após a operação. Assim, este modelo animal é adequado para estudo de IDD lombar.

Introdução

A degeneração do disco intervertebral (IDD) é comumente vista no envelhecimento e até mesmo em jovens causada por muitos fatores¹. A cirurgia para pacientes que sofrem de IDD, causando dor lombar e movimento prejudicado, geralmente é realizada em estágio posterior ou em casos graves e tem riscos potenciais como não-união ou infecção². O tratamento não-operacional ideal requer uma compreensão abrangente do mecanismo de IDD. O modelo animal IDD serve como ferramenta crucial para estudos do mecanismo de IDD e avaliação do tratamento do IDD.

Animais maiores foram escolhidos para modelos de IDD, como primatas, ovinos, cabras, cães e coelhos devido à sua semelhança com a estrutura anatômica humana em grande medida e à forte operabilidade em termos de tamanho de discos interverteberais (IVDs)^3,4,5,6,7,8. No entanto, esses modelos animais são demorados e intensivos em^{custos 9}. O IVD do Rato é uma representação ruim do IVD humano com base em medições geométricas da proporção, razão de pulposo de núcleo para área discal, e altura normalizada¹⁰. Apesar da diferença de tamanho, o segmento ivD lombar do rato exibe propriedades mecânicas semelhantes ao IVD humano, como compressão e rigidez de torção¹¹. Além disso, o modelo de IDD do mouse tem a vantagem do baixo custo, desenvolvimento de IDD relativamente curto e mais opções para animais e anticorpos geneticamente modificados utilizados em estudos mais mecanicistas^12,13,14,15.

Os modelos de IDD induzidos por experimentais variam de indutores e aplicações. Por exemplo, a degeneração da matriz extracelular induzida pela colagem (ECM) é apropriada para a pesquisa de regeneração de ECM¹⁶. Fenótipo geneticamente modificado são adequados para estudar a função genética no processo de IDD e em terapias genéticas¹⁷. Modelos de incisão fibrosa e fumaça de Annulus imitam trauma e não inflamação induzida iDD^12,18.

A instabilidade espinhal (SI) leva a uma coluna instável que não está em um estado de equilíbrio ideal. Pode ser causada pelo movimento anormal de um segmento de movimento lombar devido à fraqueza do tecido de apoio circundante, como ligamentos e músculos. Também é comumente visto após a operação de fusão^{espinhal 19}. O SI é considerado como a principal causa do IDD. Por isso, buscamos desenvolver um modelo de camundongos SI (focado na coluna lombar) que imita o processo de IDD humano^20,21.

No protocolo, introduziu-se o procedimento de estabelecimento do modelo de camundongos de instabilidade lombar (LSI) pela ressecção do terço lombar (L₃) para o quinto lombar (L₅) processos espinhosos, juntamente com os ligamentos supraespinhals e interspinos(Figura 1A,B). O modelo animal desenvolve IDD já em uma semana pós-cirurgia, como mostrado pela hipertrofia e porosidade em placas finais (EPs). O volume de IVD começa a diminuir 2 semanas após a cirurgia até 16 semanas, juntamente com o aumento do escore de IVD, o que indica o grau de IDD. Acreditamos que o procedimento detalhado e visualizado é útil para os pesquisadores estabelecerem o modelo de camundongos LSI em seu laboratório e aplicarem-se à pesquisa de IDD conforme necessário.

Protocolo

As investigações descritas estão em conformidade com as Diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde e foram aprovadas pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Xangai. Todas as manipulações cirúrgicas foram realizadas sob anestesia profunda e os animais não sentiram dor em nenhum momento durante o procedimento.

1. Preparação para pré-operação

1. Esterilização do instrumento: Instrumentos cirúrgicos esterilizados a vapor em uma autoclave (121 °C por 15 min) antes da cirurgia. Embalar instrumentos em um recipiente de metal e mantê-los até que sejam usados na cirurgia.
2. Configuração da plataforma de cirurgia: Atribua uma área de banco de pelo menos 60 cm x 60 cm para a operação. Limpe a superfície da área com 75% de álcool e cubra com uma toalha médica descartável. Coloque um pacote de instrumentos cirúrgicos estéreis, reagentes, itens cirúrgicos em uma toalha médica descartável dentro da parte superior de 1/3 da área. Deixe o restante 2/3 da área limpa para operação cirúrgica. Adicione um hotpad por baixo da almofada cirúrgica para suporte térmico.
3. Preparação animal
   1. Coloque o animal (camundongos C57BL/6J, macho, de 8 semanas) na câmara de indução. Ligue o vaporizador a um nível de indução de 4% para isoflurane e 4 L/min para oxigênio. Após o animal ser totalmente anestesiado, mantenha o anestésico com o cone do nariz e o parto anestésico a um nível de 1,5% para isoflurane e 0,4 L/min para oxigênio durante a cirurgia. Monitore o animal para respirar.
   2. Aplique pomada ocular de clortracícte para evitar o ressecamento da córnea durante a cirurgia.
   3. Raspe a área cirúrgica na superfície dorsal da região torácica inferior até o topo da região sacral usando um pequeno aparador animal. Remova a pele raspada com lenços umedecidos.
   4. Aplique creme depilatório na área raspada e deixe-o lá não mais do que 3 min. Retire o creme com gaze e lave com 2 mL de soro fisiológico estéril de 0,9%.
   5. Coloque uma almofada cilíndrica cirúrgica personalizada(Figura 2A)sob o abdômen do camundongo para elevar a coluna lombar e facilitar o funcionamento cirúrgico.

2. Exposição do terço lombar ao quinto lombar (L₃–L₅) processos espinhosos

1. Use o dedo indicador para tocar os processos espinhosos subcutâneos das vértebras lombares, que são mais externas, e compare com vértebras torácicas e vértebras sacrais para identificar a região lombar.
2. Enxágüe a pele usando 75% de álcool. Realize uma incisão de pele média de 3-4 cm sobre a região madeireira da região torácica média até o quadril usando uma lâmina de bisturi para expor a fáscia.
3. Identifique a coluna lombar pela morfologia da fáscia posterior inserida nas pontas dos processos espinhosos. Em detalhes, a terceira lombar (L₃) para o primeiro sacral (S₁) fasciae são distintas de outras fáscias por suas formas "V". A última dica "V" se conecta à primeira fáscia sacral (S₁) e a primeira dica "V" corresponde ao processo spinous L₃ (Figura 2B).
4. Faça as incisões musculares paraspinos posteriores ao longo dos processos espinhosos de L₃ a L₅ em ambos os lados lateralmente com uma lâmina de bisturi(Figura 2C). Controle a profundidade da incisão em direção às facetas para reduzir a hemorragia.
5. Separe as camadas musculares usando duas fórceps oftálmicas para expor processos espinhosos L₃ a L₅ e ligamentos supraspinos.

3. Ressecção de processos espinhosos L₃–L₅ junto com os ligamentos

1. Separar processos espinhosos individuais cortando ligamentos interspinos usando tesouras de Vênus(Figura 2D).
2. Ressecante os processos spinous L₃–L₅ juntamente com os ligamentos interspinos com cisalhamento de Vênus(Figura 2E).
3. Suturar a incisão da pele com tranças de seda estéril (tamanho sutura 5.0) sem recolocar os músculos paravertebral.
4. Aplique a Pomada Ocular do Cloridrato de Clortracíctada no local cirúrgico.
5. Administre buprenorfina-SR (25 L por grama de peso do rato) imediatamente após a cirurgia de LSI para analgesia.
6. Coloque os animais em uma câmara quente e monitore durante a recuperação da anestesia. Monitore a ingestão de alimentos e água antes de devolver os animais à gaiola.
7. Monitore o animal uma vez por dia durante os primeiros 3 dias após a operação. O animal deve ser capaz de ter um apetite normal e deve curar sem sinal de pus, hemorragia ou inchaço. Eles podem ter um pequeno prejuízo na locomoção.
8. Realizar operações falsas apenas pelo desprendimento dos músculos paravertebral posteriores das vértebras L₃-L_5.

Resultados

O modelo de mouse LSI é aplicado nos estudos do mecanismo IDD, tratamento de IDD, degeneração da placa endplata (EP), como esclerose, e inervação sensorial em EP^20,21,22,23. O mouse LSI desenvolve alterações degenerativas de IDD e EP, conforme identificado, pela diminuição do volume e altura do IVD, aumento do volume de EP e aumento das pontuações de IVD e EP.

Discussão

Desenvolvemos o modelo de camundongo de instabilidade lombar baseado no modelo de camundongos espondilose cervical no qual os músculos paravertebral posteriores das vértebras foram separados e os processos espinhosos, juntamente com os ligamentos supraspinos e interspinos foram ressecados²⁵. Realizamos uma operação semelhante na coluna lombar, que tem processos espinhosos mais proeminentes. O modelo de mouse LSI desenvolveu IDD semelhante na coluna lombar.

As vantag...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chlortetracycline Hydrochloride Eye Ointment	Shanghai General Pharmaceutical Co., Ltd.	H31021931	Prevent eye dry, Prevent wound infection
C57BL/6J male mice	Tian-jiang Pharmaceuticals Company (Jiangsu, CN)	SCXK2018-0004	Animal model
Disposable medical towel	Henan Huayu Medical Devices Co., Ltd.	20160090	Platform for surgical operation
Inhalant anesthesia equipment	MIDMARK	Matrx 3000	Anesthesia
Isoflurane	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd.	1903715	Anesthesia
Lidocaine hydrochloride	Shandong Hualu Pharmaceutical Co., Ltd.	H37022839	Pain relief
Medical suture needle	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd.	20S0401J	Suture skin
Ophthalmic forceps	Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd. Surgical Instruments Factory	JD1050	Clip the skin
Ophthalmic scissors(10cm)	Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd. Surgical Instruments Factory	Y00030	Skin incision
silk braided	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd.	11V0820	Suture skin
Small animal trimmer	Shanghai Feike Electric Co., Ltd.	FC5910	Hair removal
Sterile surgical blades(12#)	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd.	35T0707	Muscle incision
Veet hair removal cream	RECKITT BENCKISER (India) Ltd	NA	Hair removal
Venus shears	Mingren medical equipment	Length:12.5cm	Clip the muscle and spinous process