Un modelo de ratón de inestabilidad lumbar de la columna vertebral

Resumen

Desarrollamos un modelo de ratón de degeneración de disco intervertebral lumbar mediante la resección de procesos espinosos L₃-L₅ junto con ligamentos supra-e interespinosos y desprendimiento de músculos paraspinosos.

Resumen

La degeneración intervertebral del disco (IDD) es un cambio patológico común que conduce al dolor lumbar. Se desean modelos animales apropiados para entender los procesos patológicos y evaluar nuevos fármacos. Aquí, introdujimos un modelo de ratón de inestabilidad lumbar (LSI) inducido quirúrgicamente que desarrolla IDD a partir de 1 semana después de la operación. En detalle, el ratón bajo anestesia fue operado por incisión de la piel de espalda baja, exposición a procesos espinosos L₃-L_5, desprendimiento de músculos paraspinos, resección de procesos y ligamentos, y cierre de la piel. L₄–L₅ IVDs fueron elegidos para la observación. El modelo LSI desarrolla IDD lumbar por porosidad e hipertrofia en placas finales en una etapa temprana, disminución en el volumen de disco intervertebral, contracción en el núcleo pulposo en una etapa intermedia, y pérdida ósea en vértebras lumbares (L₅₎en una etapa posterior. El modelo de ratón LSI tiene las ventajas de una fuerte operatividad, sin necesidad de equipos especiales, reproducibilidad, barato y período relativamente corto de desarrollo de IDD. Sin embargo, la operación de LSI sigue siendo un trauma que causa inflamación dentro de la primera semana después de la operación. Por lo tanto, este modelo animal es adecuado para el estudio de IDD lumbar.

Introducción

La degeneración intervertebral del disco (IDD) se observa comúnmente en el envejecimiento e incluso en los jóvenes causados por muchos factores^1. La cirugía para pacientes que sufren de IDD, causando dolor lumbar y movimiento deteriorado, generalmente se realiza en una etapa posterior o en casos graves y tiene riesgos potenciales como no unión o infección^2. El tratamiento no operativo ideal requiere una comprensión integral del mecanismo IDD. El modelo animal IDD sirve como una herramienta crucial para los estudios del mecanismo IDD y la evaluación del tratamiento con IDD.

Los animales más grandes han sido elegidos para modelos IDD como primates, ovejas, cabras, perros y conejos debido a su similitud con la estructura anatómica humana en gran medida y la fuerte operatividad en términos de tamaño de discos intervertebrales (IVDs)^3,4,5,6,7,8. Sin embargo, estos modelos animales consumen mucho tiempo y consumen un costo de^9. La IVD del ratón es una mala representación de la IVD humana basada en mediciones geométricas de la relación de aspecto, relación de área de núcleo pulposo a disco y altura normalizada^10. A pesar de la diferencia de tamaño, el segmento IVD lumbar del ratón exhibe propiedades mecánicas similares a la IVD humana como compresión y rigidez de torsión¹¹. Además, el modelo IDD del ratón tiene la ventaja del desarrollo de IDD de bajo costo, relativamente corto, y más opciones para animales y anticuerpos genéticamente modificados utilizados en otros estudios mecanicistas^12,13,14,15.

Los modelos de IDD inducidos experimentalmente varían de los inductores y las aplicaciones. Por ejemplo, la degeneración de la matriz extracelular (ECM) inducida por colágenona es adecuada para la investigación de regeneración ecm¹⁶. El fenotipo modificado genéticamente es adecuado para estudiar la función génica en el proceso IDD y en terapias genéticas^17. Los modelos de incisión fibrosa y humo annulus imitan el trauma y la IDD inducida por no inflamación^12,18.

La inestabilidad espinal (SI) conduce a una columna vertebral inestable que no está en un estado óptimo de equilibrio. Puede ser causado por el movimiento anormal de un segmento de movimiento lumbar debido a la debilidad del tejido de apoyo circundante, como ligamentos y músculos. También se ve comúnmente después de la operación de fusión espinal^19. Si se considera como la causa principal del IDD. Por lo tanto, nuestro objetivo es desarrollar un modelo de ratones SI (centrado en la columna lumbar) que imita el proceso humano de IDD^20,21.

En el protocolo, introdujimos el procedimiento de establecer el modelo de ratón de inestabilidad espinal lumbar (LSI) mediante la resección del tercio lumbar (L₃₎a los procesos espinosos lumbares quintos (L₅₎junto con los ligamentos supraespinosos e interspinos (Figura 1A,B). El modelo animal desarrolla IDD tan pronto como 1 semana después de la cirugía como lo demuestra la hipertrofia y la porosidad en las placas finales (EPs). El volumen de IVD comienza a disminuir 2 semanas después de la cirugía a través de 16 semanas junto con un aumento de la puntuación de IVD, lo que indica el grado de IDD. Creemos que el procedimiento detallado y visualizado es útil para que los investigadores establezcan el modelo de ratón LSI en su laboratorio y se apliquen a la investigación de IDD según sea necesario.

Protocolo

Las investigaciones descritas se ajustan a las Directrices para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud y fueron aprobadas por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Medicina Tradicional China de Shanghái. Todas las manipulaciones quirúrgicas se realizaron bajo anestesia profunda y los animales no experimentaron dolor en ninguna etapa durante el procedimiento.

1. Preparación previa a la operación

1. Esterilización de instrumentos: Esterilizar a vapor los instrumentos quirúrgicos en un autoclave (121 °C durante 15 min) antes de la cirugía. Empaque los instrumentos en un recipiente metálico y mantenlos hasta que se utilicen en la cirugía.
2. Configuración de la plataforma de cirugía: Asigne un área de banco de al menos 60 cm x 60 cm para la operación. Limpie la superficie de la zona con un 75% de alcohol y cubra con una toalla médica desechable. Coloque un paquete de instrumentos quirúrgicos estériles, reactivos, artículos quirúrgicos en una toalla médica desechable dentro de la parte superior 1/3 del área. Deje el 2/3 restante de área limpia para el funcionamiento quirúrgico. Agregue un hotpad debajo de la almohadilla quirúrgica para obtener apoyo térmico.
3. Preparación de animales
   1. Coloque al animal (ratones C57BL/6J, macho, de 8 semanas) en la cámara de inducción. Encienda el vaporizador a un nivel de inducción del 4% para isofluranos y 4 L/min para oxígeno. Después de que el animal esté completamente anestesiado, mantenga el anestésico con el cono nasal y el parto anestésico a un nivel de 1,5% para isoflurano y 0,4 L/min para oxígeno durante la cirugía. Monitoree al animal para la respiración.
   2. Aplicar ungüento ocular de clortraciclina hidrocloruro para prevenir la sequedad corneal durante la cirugía.
   3. Afeite el área quirúrgica en la superficie dorsal desde la región torácica inferior hasta la parte superior de la región sacra utilizando una pequeña recortadora de animales. Retire el pelaje afeitado con toallitas de tejido.
   4. Aplicar crema depilatoria en el área afeitada y dejarla allí no más de 3 minutos. Retire la crema con gasa y enjuague con 2 ml de solución salina estéril al 0,9%.
   5. Coloque una almohadilla cilíndrica quirúrgica hecha a medida(Figura 2A)debajo del abdomen del ratón para levantar la columna lumbar y facilitar la operación quirúrgica.

2. Exposición del tercio lumbar a los procesos espinosos del quinto lumbar (L₃–L₅₎

1. Utilice el dedo índice para tocar los procesos espinosos subcutáneos de las vértebras lumbares, que son más externas, y comparar con las vértebras torácicas y las vértebras sacrales para identificar la región lumbar.
2. Enjuague la piel con un 75% de alcohol. Realice una incisión cutánea de 3-4 cm en la mitad de la línea sobre la región maderera desde la región torácica media hasta la cadera utilizando una hoja de bisturí para exponer la fascia.
3. Identifique la columna lumbar mediante la morfología de la fascia posterior insertada en las puntas de los procesos espinosos. En detalle, el tercer lumbar (L₃₎a la primera fachada sacra (S₁₎son distintos de otras fasciae por sus formas "V". La última punta "V" se conecta a la primera fascia sacra (S₁₎y la primera punta "V" corresponde al proceso espinoso L₃ (Figura 2B).
4. Hacer las incisiones musculares paraspinas posteriores a lo largo de los procesos espinosos de L₃ a L₅ en ambos lados lateralmente con una hoja del bisturí (Figura 2C). Controle la profundidad de incisión hacia las facetas para reducir la hemorragia.
5. Separe las capas musculares usando dos fórceps oftálmicos para exponer los procesos espinosos de L₃ a L₅ y los ligamentos supraespinosos.

3. Resección de L₃–L₅ procesos espinosos junto con los ligamentos

1. Separe los procesos espinosos individuales cortando los ligamentos interespinosos usando cizallos Venus(Figura 2D).
2. Resecciona los procesos espinosos L₃-L₅ junto con los ligamentos interespinosos con cizalla Venus (Figura 2E).
3. Sutura la incisión de la piel con trenzada de seda estéril (tamaño de sutura 5.0) sin reasociar los músculos paravertebrales.
4. Aplique ungüento ocular de clortraciclina clortraciclina en el sitio quirúrgico.
5. Administrar Buprenorphine-SR (25 uL por gramo de peso del ratón) inmediatamente después de la cirugía LSI para la analgesia.
6. Coloque a los animales en una cámara caliente y monitoree durante la recuperación de la anestesia. Monitoree la ingesta de alimentos y agua antes de devolver a los animales a la jaula de origen.
7. Monitoree al animal una vez al día durante los primeros 3 días después de la operación. El animal debe ser capaz de tener un apetito normal y debe sanar sin signos de pus, hemorragia o hinchazón. Pueden tener un deterioro menor en la locomoción.
8. Llevar a cabo operaciones falsas sólo por el desprendimiento de los músculos paravertebrales posteriores de las vértebras L₃–L_5.

Resultados

El modelo de ratón LSI se aplica en los estudios de mecanismo IDD, tratamiento IDD, degeneración endplate (EP) como esclerosis, e invation sensorial en EP^20,21,22,23. El ratón LSI desarrolla cambios degenerativos de IDD y EP, identificados, por disminución del volumen y la altura de la IVD, aumento del volumen ep y aumento de las puntuaciones de IVD y EP.

La colu...

Discusión

Desarrollamos el modelo de ratón de inestabilidad lumbar de la columna vertebral basado en el modelo de ratón de espondilosis cervical en el que se separaron los músculos paravertebrales posteriores de las vértebras y los procesos espinosos junto con los ligamentos supraespinosos e interespinosos se reseccionaron^25. Realizamos una operación similar en la columna lumbar, que tiene procesos espinosos más prominentes. El modelo de ratón LSI desarrolló un IDD similar en la columna lumbar.

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chlortetracycline Hydrochloride Eye Ointment	Shanghai General Pharmaceutical Co., Ltd.	H31021931	Prevent eye dry, Prevent wound infection
C57BL/6J male mice	Tian-jiang Pharmaceuticals Company (Jiangsu, CN)	SCXK2018-0004	Animal model
Disposable medical towel	Henan Huayu Medical Devices Co., Ltd.	20160090	Platform for surgical operation
Inhalant anesthesia equipment	MIDMARK	Matrx 3000	Anesthesia
Isoflurane	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd.	1903715	Anesthesia
Lidocaine hydrochloride	Shandong Hualu Pharmaceutical Co., Ltd.	H37022839	Pain relief
Medical suture needle	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd.	20S0401J	Suture skin
Ophthalmic forceps	Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd. Surgical Instruments Factory	JD1050	Clip the skin
Ophthalmic scissors(10cm)	Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd. Surgical Instruments Factory	Y00030	Skin incision
silk braided	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd.	11V0820	Suture skin
Small animal trimmer	Shanghai Feike Electric Co., Ltd.	FC5910	Hair removal
Sterile surgical blades(12#)	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd.	35T0707	Muscle incision
Veet hair removal cream	RECKITT BENCKISER (India) Ltd	NA	Hair removal
Venus shears	Mingren medical equipment	Length:12.5cm	Clip the muscle and spinous process