水介质中纳米材料的紫外-可见光谱表征

摘要

本研究介绍了实验室间比较（ILC）的基准测试结果，该比较旨在测试为紫外可见光谱（UV-Vis）表征的金（Au）胶体分散体开发的标准操作程序（SOP），来自H2020 ACEnano项目的六个合作伙伴，用于样品制备，测量和分析结果。

摘要

纳米材料（NM）的物理化学表征通常是一个分析挑战，因为它们的尺寸小（纳米尺度中至少有一个维度，即1-100nm），动态性质和多样化的性质。同时，可靠和可重复的表征对于确保NM轴承产品制造中的安全性和质量至关重要。有几种方法可以监测和实现纳米级相关性质的可靠测量，其中一个例子是紫外可见光谱（UV-Vis）。这是一种成熟、简单且价格低廉的技术，可对 NM 大小、浓度和聚集状态进行非侵入性和快速的实时筛选评估。这些特性使UV-Vis成为评估经过验证的标准操作程序（SOP）的熟练度测试方案（PTS）的理想方法，旨在评估表征方法的性能和再现性。在本文中，通过实验室间比较（ILC）评估了来自H2020项目ACEnano的六个合作伙伴实验室的PTS。在不同机构采用紫外-可见分光光度（UV-Vis）表征不同尺寸（范围5~100 nm）的标准金（Au）胶体悬浮液，为NM尺寸表征开发一种可实施且稳健的方案。

引言

纳米材料（NM）因其在纳米级（1至100 nm）中的独特性质而变得流行，这些性质与本体材料的性质不同，这是由于尺寸相关或量子效应（例如，体积增加比表面积）以及不同的反应性，光学，热，电和磁性^1，2.NM在社会中的潜在应用多种多样，与医疗保健，食品工业，化妆品，油漆，涂料和电子等领域广泛相关^3，4，5。金纳米颗粒（AuNPs）广泛应用于纳米技术（例如，医疗保健，化妆品和电子应用），主要是因为它们的制造简单，尺寸依赖于光学特征，表面功能化潜力和物理化学性质，可适用于许多关键应用^6，7。

纳米金属的合成和表征的质量和再现性对于质量保证以及纳米基产品的安全制造极其重要，特别是由于纳米材料的反应性，特别是在复杂环境中，NM特性，如尺寸分布和形态，可能会经历快速变化^8,9.有许多方法可用于监测纳米级相关性质。例如，扫描/透射电子显微镜（SEM / TEM）是用于获取NM的高分辨率（低至亚纳米）光学和成分信息的技术;原子力显微镜（AFM）在垂直（z轴）维度上提供纳米级分辨率;X射线衍射（XRD）提供有关NM原子结构的信息;所有这些方法只能用于干燥样品（粉末）^10,11.适用于表征液体介质中NM的技术包括场流分馏（FFF），它允许根据其大小分离大分子，聚集体和颗粒;动态光散射;和纳米颗粒跟踪分析（NTA）和紫外可见分光光度法（UV-Vis），这两种方法广泛用于使用布朗运动确定颗粒的尺寸分布曲线，其允许通过简单的吸收测量来评估NM特征，如大小，聚集状态和折射率^11,12,13.虽然所有这些技术都允许NM表征，但它们的性能取决于仪器设置，仪器相关差异，样品制备的复杂方法以及用户的专业水平。此外，大多数技术不允许实时监测NM大小，样品完整性或分散或聚集颗粒之间的差异。⁶.紫外可见分光光度计是一种广泛使用的技术，可对 NM 大小、浓度和聚集状态进行非侵入性和快速的实时评估。此外，这是一个简单而廉价的过程，只需最少的样品制备，这使得该技术成为许多学科和市场的众多实验室广泛使用的基本工具。^6,12,14.UV-Vis的工作原理是测量波长在180至1100nm之间的电磁辐射通过液体样品的透射率。紫外和可见分光光谱范围涵盖紫外（170 nm 至 380 nm）、可见光（380 nm 至 780 nm）和近红外（780 nm 至 3300 nm）的波长范围。^4,14.测量通过样品池的光的波长;进入样品的光强度称为I₀，另一侧出现的光的强度被指定为 I₁¹⁴.比尔-朗伯定律反映了A（吸光度）与样品浓度C、样品消光系数ε和两种强度之间的关系。¹⁴.吸收测量可以在单个波长或扩展光谱范围内收集;测量的透光率通过遵循比尔-兰伯特定律方程转换为吸光度测量值。吸光度的标准方程为A = ɛlc，其中（A）是样品在给定波长下吸收的光量（ɛ）是摩尔衰减系数（吸光度/（g/dm）³）（l）是光通过溶液传播的距离（cm），（c）是每单位体积的浓度（g / dm³).吸光度计算为参考样品强度之间的比率（I₀）和未知样本（I），如以下等式所述¹⁴:

UV-Vis的简单性使其成为比较已建立的测量协议的PTS的理想技术^6，12，15。ILC或PTS的目的是验证使用^SOP15的方法的性能和再现性。反过来，这为其他用户快速表征纳米颗粒悬浮液提供了一种标准化方法。

为了评估本文所述方法的熟练程度、一致性和可靠性，六个实验室作为Horizon 2020 ACEnano项目（https://cordis.europa.eu/project/id/720952）的成员参加了ILC。ILC涉及不同粒径（5-100 nm）的标准Au胶体分散体的紫外-可见光表征。向所有相关实验室提供了SOP，以确保AuNP悬浮液的相同准备，评估和结果报告，以促进在NM物理化学表征，数据解释以及改进最佳实践协议以满足工业和监管需求⁸中开发可实施且稳健的分层方法。

研究方案

1. AuNP样品的交付:

1. 制备5 mL金胶体分散体的等分试样，大小为5，20，40，60和100nm，包括50μg/ mL的"未知尺寸"样品（有关所用纳米材料的更多具体细节，请参见 材料表 ）。
2. 将装有凝胶包的7 mL聚苯乙烯容器中的样品发送到每个参与实验室，以便在运输过程中保持合适的温度。立即将样品储存在4°C。
   注意:"未知尺寸"样品必须提供80nm的尺寸;分发材料的合作伙伴应知道此信息，但不会向其他合作伙伴披露。

2. 分光光度计的校准:

1. 打开紫外可见光谱仪至少20分钟，让灯升温。
   注:请参阅 材料表 ，了解所用分光光度计的型号和品牌。
2. 在软件中，从模式窗口中选择选项频谱扫描 ，该窗口显示操作模式。
3. 在仪器|中调整参数设置在进行测量之前，软件中的设置和参数:测量模式|频谱扫描，数据模式|ABS，起始波长为 680 nm，结束波长为 380 nm，扫描速度为 400 nm/min，采样间隔为 0.5，狭缝宽度为 1.5，光程长度为 10。
4. 设定参数后，用1 mL超纯水（UPW）（18.2 M·Ω·cm）填充两个比色皿（3 mL;聚苯乙烯）。将比色皿置于参比池支架（背面）和样品池支架（正面）中以覆盖光路（有关所用比色皿的特定品牌和型号，请参见 材料表 ）。
   注:确保比色皿正确定位和对齐，以消除噪声效应和其他与样品无关的环境效应。
5. 合上UV-Vis仪器盖，然后从命令栏中选择"空白"，继续 进行空白 校准。基线校正是通过运行参考来执行的，将两个装满1 mL UPW的比色皿放入样品架中。有关其他合作伙伴使用的替代协议，请参阅 补充信息 （SI）。

3. 样品的制备

1. 对于5，20，40，60，100nm和未知尺寸的每个AuNP，取500μL的子样品，并用500μLUPW制备稀释液。
2. 将稀释的悬浮液置于1 mL比色皿中;总稀释比应为1:1，终浓度为25μg/mL。
   注:稀释后的样品必须在紫外-可见光度测量前立即制备。

4. 纳米颗粒分散体的测量

1. 在进行空白校准并制备新鲜样品后，用AuNP分散样品替换样品池支架（正面）中的一个空白比色皿;另一个装满1 mL UPW的参比色皿必须保持原样。
   注:对不同样品使用新的一次性比色皿，以避免样品之间的交叉污染。使用石英比色皿时，在样品之间用UPW冲洗样品比色皿。
2. 从命令栏中选择" 测量/启动" 选项，对每个稀释的 AuNP 色散运行光谱扫描。应为每个 AuNP 样品（包括未知大小的样品）进行三次光谱扫描。
   注:进行测量时，确保空白比色皿保留在参考细胞支架中。

5. 报告结果

1. 通过选择 "文件"菜单 并单击" 导出报告（*.csv）文件"，将每个测量值的原始实验数据提取到电子表格兼容文件中。
2. 记下每个紫外可见分光度读数的最大吸收波长（_Absmax）和_λmax，并将它们记录在提供的模板中。
   注意:预先设计的模板已提供给 ACEnano 合作伙伴，通过在工作簿中设置适当的计算公式来自动计算波长的平均标准偏差。有关模板的更多详细信息和访问权限，请参阅 补充信息 （SI）。。
3. 在工作簿中，绘制一条校准曲线，其中包含 _λmax（y 轴）与已知纳米颗粒大小 （nm）（5、20、40、60 和 100 nm）的平均值。例如，在电子表格中，通过在命令栏中选择"数据|插入图形|散点图|添加趋势线|多项式曲线（幂 2）。
4. 包括校准曲线的多项式方程:选择 趋势线选项|从命令栏中在图表上显示公式 （图1）。
5. 最后，为了计算AuNP样本的未知大小，使用二次公式的推导，将多项式方程与校准曲线分离，以拟合未知_λmax的平均值（图1）。计算出的大小可以包含在模板中，以完成数据的完整摘要，以实现一致性，更快地解释和评估结果（参见SI）。

图1:校准曲线，用于计算未知样品的大小。 该图表示用于绘制校准的 AuNP 的波长 （_λmax） 和大小。该图仅显示来自一个合作伙伴的一条校准曲线。 请点击此处查看此图的放大版本。

结果

UV-Vis是纳米颗粒表征中最流行的技术之一，因为它允许用户获得对ABsmax和_λmax6^，12等NM性质的精确分析。本研究的结果代表了通过六个参与实验室之间的ILC对AuNP分散体的紫外可见分光度表征。

图 2:Lambda 和吸光度结果。 该图显示了每个实验室报告的不同AuNP大小的结果的图。 A） Lambda 最大结果。 B） 吸光度最大结果。由于样品污染，实验室5无法报告100nm的数据。 请点击此处查看此图的放大版本。

λmax波长的结果显示伙伴之间的重复性接近（图2A）。计算范围也是如此，用于评估值之间的差异，并且对于大多数AuNP尺寸，其显示范围在1.00和2.40（_λmax）之间的微小差异（表1）。使用每个实验室记录的平均值计算的每种AuNP尺寸的总体_λmax均值，对于大多数尺寸，同样显示低标准差。100 nm尺寸是唯一的豁免，因为它在伴侣之间显示出很高的变化范围（4.66 _λmax），与其他AuNP尺寸相比，导致更大的标准偏差（572±2.00nm）（表1）。值得一提的是，实验室5无法对100nm尺寸的颗粒进行任何测量，因为污染问题可能会损害结果的可重复性。

相比之下，与λmax结果相比，吸光度结果（_Absmax）表现出更分散的数据值范围（图2B）。尽管这些结果在实验室之间明显具有较高的变异性，但与_λmax结果相比，分析显示实验室之间的总体均值具有较低的标准偏差和意外的劣质变异范围（0.11-0.21 _Absmax）（表1）。

价值	AuNP （nm）
	5	20	40	60	100	未知
范围 λmax	1.45	1.00	3.00	2.00	4.66	2.40
范围 Aumax	0.12	0.11	0.13	0.13	0.12	0.21
平均λ最大值	517.7 ± 0.59	524.6 ± 0.45	527.8 ± 1.13	535.3 ± 0.74	572 ± 2.00	549.7 ± 0.85
平均奥马克斯	0.395 ± 0.048	0.497 ± 0.050	0.509 ± 0.057	0.689 ± 0.055	0.472 ± 0.051	0.661 ± 0.101

表1:Lambda和吸光度计算范围和平均值。显示了每个 AuNP 尺寸的范围以及总体均值和标准差。使用每个实验室报告的λ和吸光度平均值（六次测量）计算结果，除了100nm尺寸，其中仅使用5次测量来计算由于实验室5报告的样品污染而产生的值。

还计算了 Z 得分值，以记下各个值与总体平均值的距离。对 Z 评分的分析提供了有关 ILC 结果置信度的信息，因为通过以多个标准差显示数据点与均值的距离，分数与总体分布直接相关¹⁶。在结果中，大多数实验室显示_λmax的Z评分值为0.01-1.93，表明大多数结果接近均值并呈现正态分布曲线，因为Z评分大于绝对值2和-2被视为远离均值并且没有正态分布^的值16。实验室1报告的40nm尺寸记录了_Absmax的最高Z得分，值为1.93，_Absmax平均值为530±0，而总体平均值为527.82±1.13（图3A）。实验室3报告了_λmax的最大Z评分值为1.23，报告的5 nm AuNP尺寸的最大Z_值为0.454±0，而总平均值为0.395±0.04。紧随其后的是60 nm AuNP，Z得分为1.18，_λmax平均值为0.754 ± 0，而总体平均值为0.689±0.05。其余大小显示从 -0.04 到 -1.23 的 Z 得分值（图 3B）。

图 3:Lambda 和吸光度 Z 评分。 Z评分是使用每个实验室报告的结果与总体平均值计算的。 A） 计算出的 Lambda 最大 Z 分数。 B） 计算出吸光度最大 Z 评分。 请点击此处查看此图的放大版本。

未知样品的结果显示，大多数合作伙伴计算出的尺寸为76-80nm。实验室1-4和6的平均值记录为78.02±1.36 nm。实验室5报告了109nm的更大尺寸，将整体平均值和标准偏差扩大到83.18±12.70nm，表明该值是一个异常值（图4A）。所有实验室的Z评分计算为-0.25至-0.56之间;唯一的例外是实验室6报告的未知大小，与所有测量值相比，其显示最高的正Z评分（2.03），这可以被视为与平均值相差的值（图4B）。

图 4:未知的样本大小和 Z 得分。 A） 所提供未知样本的每个实验室的报告大小。 B） 根据 83.18 ± 12.70 nm 的总体平均值计算每个单独结果的 Z 得分。 请点击此处查看此图的放大版本。

补充信息（SI）:请点击此处下载此文件。

讨论

有几种方法可用于表征纳米级相关性质（例如，分析超速离心（AUC），扫描电子显微镜/透射电子显微镜（SEM / TEM）和动态光散射（DLS）^10，11）。然而，这些技术缺乏UV-Vis的简单性，无法在^NMs12，13的表征中获得主要结果。即使在装备不太精良的实验室中，紫外可见分光度计也是一种常见的仪器，使其成为表征^NMs6的无与伦比的工具。在表征NM时，重要的是要考虑要应用的技术的局限性，优点和缺点。在紫外可见分光光度计中，光束穿过样品室，产生吸收值;因此，外部振动、外部光线、污染物和用户性能可能会干扰测量和结果^4，12。同样，在绘制校准曲线以确定未知样品的大小时，记录构建校准所需的所有测量值非常重要，因为缺失的因素可能会导致测量值和用户之间的差异。

例如，由于光束强度，位置和仪器本身之间的依赖性，未知样品的整体_Absmax 均值的高变化可能与实验室之间的差异有关^17，18。此外，由于污染问题，来自实验室5的100nm尺寸的缺失数据也可能导致结果之间的高差异，因为缺失的数据可能影响了校准曲线和用于计算未知AuNP悬浮液大小的绘制多项式方程。当然，实验方案和实验室之间的可重复性可能很复杂，因为许多因素可能导致实验室活动缺乏一致性，导致研究人员偶尔无法复制其他实验室的发现，这可能导致科学进展缓慢，浪费时间、金钱和资源¹⁹。成功表征纳米物质的物理化学性质，特别是尺寸，需要所有参与的实验室采用易于执行的方法，这主要可以通过遵循系统和概念上的复制来解决，例如创建SOP，仪器培训以及避免使用错误识别或交叉污染的样品^15，19。

同样，胶体悬浮液的质量和稳定性也是需要考虑的重要因素，因为它们的物理化学性质的变化可能导致不同的结果。因此，为了确保它们在较长时间内的稳定性，纳米颗粒悬浮液应在4°C的黑暗中储存。 同样，在运输过程中，等分试样的样品应保持低温，因为长时间在室温下可能导致显着聚集²⁰。此外，为了克服NM表征中的失败，有必要在合作实验室之间提供对原始数据，协议和关键研究材料的访问，特别是在通过^ILC15评估熟练程度，一致性和可靠性时。使这些因素清晰易懂是任何实验室或设备成功实现NM表征的关键。忽略这些方面可能会导致缺乏可重复性、准确性以及误导性或错误的结果¹⁵。虽然紫外可见分光光谱已被证明是NM表征的黄金标准，但它可以在许多其他领域加以利用，因为它允许定量测定无机和有机化合物中溶液的扩展动态范围^6，21。

此外，UV-Vis可以很容易地与其他工具结合使用，以测量各种属性，从而提高任何分析的质量²²。基于这些特性，紫外可见光广泛用于许多领域，例如在生物制药领域，通过测量高浓度蛋白质溶液中的紫外可见光谱，在实时比较污染物与其产品相关杂质之间的相似性时的环境控制，在工业废水处理厂中作为废水颜色测定和可接受性等级法规的一部分^22，23.当然，随着技术的进步以及分光光度法中更先进的功能和经验的出现，使用该技术可以测量的应用和参数将进一步扩大²²。例如，在现场应用中，在线紫外可见分光光度计是实时监测各种类型液体中众多参数的宝贵工具，这是在线传感器系统中的一个特殊功能²²。

这里描述的ILC被设计为在参与H2020 ACEnano项目的六个参与实验室中为UV-Vis开发的SOP的测试。对结果的分析表明，ILC提供了有价值的信息，使每个参与者实验室对NM表征的内部方法具有技术信心。在已建立的模板中收集的数据证实了结果的一致性和更快的解释，并为估计未知AuNP样品的大小提供了模型，当校准曲线中包括足够的点时，该模型还显示了结果之间的可重复性。此外，结果验证了UV-Vis对NM表征的有效性以及创建最佳实践方案的重要性。这种方法进一步为已实施的程序提供了一个机会，通过基于与认证监管机构和研究管理机构相关的方法选择和数据解释的可重复的NM表征协议，为立法框架的发展做出贡献。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorption Ultra-Micro-cuvette, 200 µL	Hellma	105.201-QS
Cary 5000 spectrophotometer (Spectrophotometer C)	Agilent	Cary 5000
Gold nanoparticles 5 nm	BBI solutions	EM.GC5
Gold nanoparticles 20 nm	BBI solutions	EM.GC20
Gold nanoparticles 40 nm	BBI solutions	EM.GC40
Gold nanoparticles 60 nm	BBI solutions	EM.GC60
Gold nanoparticles 80 nm	BBI solutions	EM.GC80
Gold nanoparticles 100 nm	BBI solutions	EM.GC100
Agilent / HP 8453 (Spectrophotometer E)
Jenway 6800 spectrophotometer (Spectrophotometer A)	Jenway	UV6800
Polystyrene cuvette, 1.5 mL, micro 10 mm pathlength	Sigma	759015
Polystyrene cuvette, 3 mL (10 mm x 10 mm x 45 mm)	Sarstedt Inc	67.742
Semi-micro quartz cuvette, 1mL (1 mm x 10 mm x 45 mm)	Agilent	6610001
Ultrapure water (UPW) (18.2 MΩcm).	/	/
UV-1800 spectrophotometer (Spectrophotometer B)	Shimadzu	UV1800
Varian Cary 50 spectrophotometer (Spectrophotometer D)	Agilent	Cary 50