Method Article
מחקר זה מציג את תוצאות בחינת המידה להשוואה בין-לאומית (ILC) שנועדה לבדוק את הליך ההפעלה הסטנדרטי (SOP) שפותח עבור פיזור קולואידים מזהב (Au) המאופיינים בספקטרוסקופיה אולטרה סגולה (UV-Vis), בין שישה שותפים מפרויקט ACEnano H2020 להכנת מדגם, מדידה וניתוח של התוצאות.
האפיון הפיזיקוכימי של ננו-חומרים (NMs) הוא לעתים קרובות אתגר אנליטי, בשל גודלם הקטן (לפחות ממד אחד בקנה המידה הננומטרי, כלומר 1-100 ננומטר), טבע דינמי ומאפיינים מגוונים. יחד עם זאת, אפיון אמין וחוזר על עצמו הוא בעל חשיבות עליונה כדי להבטיח בטיחות ואיכות בייצור של מוצרים נושאי NM. ישנן מספר שיטות זמינות לניטור ולהשגת מדידה אמינה של תכונות הקשורות ננומטרי, דוגמה אחת מהם היא ספקטרוסקופיה אולטרה סגולה-גלויה (UV-Vis). זוהי טכניקה מבוססת, פשוטה וזולה המספקת הערכת סינון לא פולשנית ומהירה בזמן אמת של גודל NM, ריכוז ומצב צבירה. תכונות כאלה הופכות את UV-Vis למתודולוגיה אידיאלית להערכת תוכניות בדיקת הבקיאות (PTS) של הליך הפעלה סטנדרטי מאומת (SOP) שנועד להעריך את הביצועים והשחזור של שיטת אפיון. במאמר זה, PTS של שש מעבדות שותפות מפרויקט H2020 ACEnano הוערך באמצעות השוואה interlaboratory (ILC). מתלים קולואידיים סטנדרטיים מזהב (Au) בגדלים שונים (החל מ-5-100 ננומטר) התאפיינו ב-UV-Vis במוסדות השונים לפיתוח פרוטוקול מיושם וחזק לאפיון גודל NM.
ננו-חומרים (NMs) הפכו פופולריים בשל תכונותיהם הייחודיות בקנה מידה ננומטרי (1 עד 100 ננומטר), השונים מהמאפיינים של עמיתיהם בתפזורת, בין אם בשל אפקטים הקשורים לגודל או קוונטי (למשל, שטח פנים ספציפי מוגבר לפי נפח) יחד עם תכונות תגובתיות ברורות, אופטיות, תרמיות, חשמליות ומגנטיות1,2 . היישומים הפוטנציאליים של NMs בחברה מגוונים וקשורים באופן נרחב לתחומים כגון בריאות, תעשיית המזון, קוסמטיקה, צבעים, ציפויים ואלקטרוניקה3,4,5. חלקיקי זהב (AuNPs) מיושמים באופן נרחב בננוטכנולוגיה (למשל, בתחום הבריאות, הקוסמטיקה והיישומים האלקטרוניים), בעיקר בשל הייצור הפשוט שלהם, תכונות אופטיות תלויות גודל, פוטנציאל פונקציונליזציה פני השטח, תכונות פיזיותכימיות, אשר יכול להתאים עבור יישומים מרכזיים רבים6,7.
איכות ושחזור בסינתזה ואפיון של NMs חשובים ביותר להבטחת איכות, אך גם לייצור בטוח של מוצרים מבוססי ננו, במיוחד בשל התגובה של NMs, במיוחד בסביבות מורכבות, שבהן תכונות NM, כגון הפצת גודל ומורפולוגיה, עשויות לעבור שינויים מהירים8,9. שיטות רבות זמינות לניטור מאפיינים הקשורים ננומטרי. לדוגמה, מיקרוסקופיית אלקטרונים סריקה/שידור (SEM/TEM) הן טכניקות המשמשות להשגת מידע אופטי וקומפוזיציה ברזולוציה גבוהה (עד תת-ננומטר) של NMs; מיקרוסקופיה של כוח אטומי (AFM) מספקת רזולוציה ננומטרית בממד האנכי (ציר z); עקיפה של קרני רנטגן (XRD) מספקת מידע על המבנה האטומי של NMs; כל השיטות האלה ניתן להשתמש רק על דגימות יבשות (אבקות)10,11. טכניקות המתאימות לאפיון של NMs במדיה נוזלית כוללות פירוק זרימת שדה (FFF), המאפשר הפרדה של מולקולות גדולות, אגרגטים וחלקיקים בהתבסס על גודלם; פיזור אור דינמי (DLS); וניתוח מעקב אחר חלקיקים (NTA) – שתי שיטות הנמצאות בשימוש נרחב לקביעת פרופיל התפלגות הגודל של חלקיקים באמצעות תנועה בראונית – וספקטרופוטומטריה אולטרה סגולה (UV-Vis), המאפשרת הערכה של מאפייני NM כגון גודל, מצב צבירה ומדד שבירה על ידי מדידת ספיגה פשוטה11,12,13. למרות שכל הטכניקות הללו מאפשרות אפיון NM, הביצועים שלהם תלויים בהגדרת מכשירים, הבדלים הקשורים למכשירים, מתודולוגיה מורכבת להכנת מדגם ורמת המומחיות של המשתמש. יתר על כן, רוב הטכניקות אינן מאפשרות ניטור בזמן אמת של גודל NM, שלמות המדגם או הבחנה בין חלקיקים מפוזרים או מצטברים6. ספקטרוסקופיה UV-Vis היא טכניקה נפוצה המספקת הערכה לא פולשנית ומהירה בזמן אמת של גודל NM, ריכוז ומצב צבירה. בנוסף, זהו תהליך פשוט וזול עם הכנת מדגם מינימלית, מה שהופך טכניקה זו לכלי חיוני המשמש בהרחבה במעבדות רבות בתוך דיסציפלינות ושווקים רבים6,12,14. UV-Vis עובד על ידי מדידת ההעברה של קרינה אלקטרומגנטית של אורך גל בין 180 ל 1100 ננומטר באמצעות מדגם נוזלי. טווחי הספקטרום של UV ו- VIS מכסים את טווח אורך הגל עבור האולטרה סגול (170 ננומטר עד 380 ננומטר), גלוי (380 ננומטר עד 780 ננומטר) וכמעט אינפרא אדום (780 ננומטר עד 3300 ננומטר)4,14. אורך הגל של האור העובר דרך תא המדגם נמדד; עוצמת האור הנכנס לדגימה נקראת I0ועוצמת האור המתהווה בצד השני מוגדרת כאי.114. חוק באר-למברט משקף את הקשר בין A (ספיגה) כפונקציה של ריכוז מדגם C, מקדם הכחדת המדגם ε, ושתי האינטנסיביות14. מדידות ספיגה ניתן לאסוף אורך גל אחד או על פני טווח ספקטרלי מורחב; העברת האור הנמדדת הופכת למדידת ספיגה על ידי ביצוע משוואת החוק באר-למברט. המשוואה הסטנדרטית לספיגה היא A = ɛlc, כאשר (A) היא כמות האור הנקלטת על ידי המדגם עבור אורך גל נתון (ɛ) הוא מקדם ההנחיה הטוחנת (absorbance/(g/dm)3) (l) המרחק שהאור עובר דרך הפתרון (ס"מ), ו-(ג) הוא הריכוז ליחידת נפח (g/dm3). הספיגה מחושבת כיחס בין עוצמת דגימת הפניה (I0) והדוגמה הלא ידועה (I), כמתואר במשוואה הבאה14:
הפשטות של UV-Vis הופכת אותו לטכניקה אידיאלית להשוות PTS של פרוטוקול מדידה מבוסס6,12,15. המטרה של ILC או PTS היא לאמת את הביצועים ואת יכולת הרבייה של שיטה באמצעות SOP15. זה, בתורו, מספק גישה סטנדרטית לאפיון מהיר של השעיות ננו-חלקיקים עבור משתמשים אחרים.
כדי להעריך את המיומנות, העקביות והאמינות של השיטה המוצגת כאן, שש מעבדות השתתפו ב- ILC כחברים בפרויקט Horizon 2020 ACEnano (https://cordis.europa.eu/project/id/720952). ILC מעורב UV-Vis אפיון של פיזור קולואידים Au סטנדרטיים בגדלים חלקיקיים שונים (5-100 ננומטר). SOP סופק לכל המעבדות המעורבות כדי להבטיח הכנה זהה של השעיות, הערכה ודיווח של תוצאות AuNP כדי לתרום לפיתוח גישה שכבתית מיושמת וחזקה באפיון פיזיקוכימי של NM, פרשנות נתונים ושיפור פרוטוקולי שיטות עבודה מומלצות לצרכים תעשייתיים ורגולטוריים8.
1. משלוח של דגימות AuNP:
2. כיול הספקטרופוטומטר:
3. הכנת הדגימות
4. מדידת פיזור הננו-חלקיקים
5. תוצאות דיווח
איור 1: עקומת כיול כדי לחשב את גודל המדגם הלא ידוע. העלילה מייצגת את אורכי הגל (λmax) ואת גודל ה- AuNPs המשמשים להתוויית הכיול. העלילה מציגה עקומת כיול אחת בלבד מבן זוג אחד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
UV-Vis היא אחת הטכניקות הפופולריות ביותר עבור אפיון ננו-חלקיקים כפי שהוא מאפשר למשתמש לקבל ניתוח מדויק של תכונות של NMs כגון Absmax ו λmax6,12. תוצאות המחקר הנוכחי מייצגות את אפיון UV-Vis של פיזור AuNP באמצעות ILC בין שש מעבדות משתתפות.
איור 2: תוצאות למבדה וספיגה. הנתונים מראים את העלילות עבור התוצאות שדווחו על ידי כל מעבדה עבור גדלי AuNP שונים. א) תוצאות מקסימום למבדה. B) תוצאות מרביות של ספיגה. מעבדה 5 לא הצליחה לדווח על נתונים עבור 100 ננומטר עקב זיהום מדגם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
התוצאות של אורכי הגל של ה-λmax הראו יכולת חזרה הדוקה בקרב השותפים (איור 2A). זה היה גם המקרה עבור הטווח המחושב, אשר שימש להערכת ההבדל בין ערכים, ואשר הראה הבדלים קטנים הנעים בין 1.00 ל 2.40 (λmax) עבור רוב גדלי AuNP (טבלה 1). ממוצע λmax הכולל, המחושב באמצעות הממוצע המתועד עבור כל מעבדה עבור כל גודל AuNP, מוצג באופן דומה סטיות תקן נמוכות עבור רוב הגדלים. גודל 100 ננומטר היה הפטור היחיד, שכן הוא הציג טווח וריאציה גבוה (4.66 λmax) בין שותפים, מה שהוביל לסטיית תקן גדולה יותר (572 ± 2.00 ננומטר) בהשוואה לגדלי AuNP אחרים (טבלה 1). חשוב להזכיר כי מעבדה 5 לא הצליחה לבצע מדידות כלשהן עבור חלקיקי גודל 100 ננומטר, בשל בעיות זיהום שעלולות היו לסכן את החזרה על התוצאות.
לעומת זאת, תוצאות הספיגה (Absmax) הציגו מגוון מפוזר יותר של ערכי נתונים (איור 2B) בהשוואה לתוצאות λmax . למרות השונות הגבוהה יותר לכאורה של תוצאות אלה בין מעבדות, הניתוח המוצג באמצעים הכוללים עם סטיות תקן נמוכות יותר וטווחי וריאציה נחותים בלתי צפויים (0.11-0.21 Absmax) בין מעבדות בהשוואה לתוצאות λmax (טבלה 1).
ערך | AuNP (nm) | |||||
5 | 20 | 40 | 60 | 100 | ידוע | |
Range λmax | 1.45 | 1.00 | 3.00 | 2.00 | 4.66 | 2.40 |
טווח אומקס | 0.12 | 0.11 | 0.13 | 0.13 | 0.12 | 0.21 |
Mean λmax | 517.7 ± 0.59 | 524.6 ± 0.45 | 527.8 ± 1.13 | 535.3 ± 0.74 | 572 ± 2.00 | 549.7 ± 0.85 |
אומקס ממוצע | 0.395 ± 0.048 | 0.497 ± 0.050 | 0.509 ± 0.057 | 0.689 ± 0.055 | 0.472 ± 0.051 | 0.661 ± 0.101 |
טבלה 1: טווח ואמצעים מחושבים של למבדה וספיגה. הטווח וממוצע וסטיית התקן הכוללת עבור כל גודל AuNP מוצגים. התוצאות חושבו באמצעות הממוצע המדווח עבור lambda וספיגה עבור כל מעבדה (שש מדידות), למעט גודל 100 ננומטר שעבורו רק 5 מדידות שימשו לחישוב הערכים עקב זיהום מדגם שדווח על ידי מעבדה 5.
ערכי ניקוד Z חושבו גם כדי לציין את המרחק של ערכים בודדים מהממוצע הכולל. הניתוח של ציוני Z סיפק מידע על הביטחון של תוצאות ILC, שכן הציונים קשורים ישירות לחלוקת האוכלוסייה על ידי הצגת, במספר סטיות תקן, עד כמה רחוקה נקודת הנתונים מהממוצע16. בתוצאות, רוב המעבדות הראו ערכי ציון Z חיוביים של 0.01-1.93 עבור λmax, המציין כי רוב התוצאות היו קרובות לממוצע והציג עקומת התפלגות נורמלית, כמו Z-ציונים גדולים יותר מהערך המוחלט של 2 ו -2 נחשבים ערכים רחוקים מן הממוצע ואין להם התפלגות נורמלית16. ציון Z הגבוה ביותר עבור Absmax נרשם עבור גודל 40 ננומטר שדווח על ידי מעבדה 1, עם ערך של 1.93 וממוצע Absmax של 530 ± 0, לעומת הממוצע הכולל של 527.82 ± 1.13 (איור 3A). ערך ציון Z המרבי של 1.23 עבור λmax דווח על ידי מעבדה 3 יחד עם λmax מדווח של 0.454 ± 0 עבור 5 ננומטר AuNP גודל לעומת הממוצע הכולל של 0.395 ± 0.04. אחריה הגיע ציון Z של 60 ננומטר עם ציון Z של 1.18 וממוצע λmax של 0.754 ± 0 לעומת הממוצע הכללי של 0.689 ± 0.05. הגדלים הנותרים הציגו ערכי ניקוד Z מ- -0.04 ל- -1.23 (איור 3B).
איור 3: תוצאות Z של למבדה וספיגה. ציוני Z חושבו באמצעות התוצאות שדווחו על ידי כל מעבדה כנגד הממוצע הכולל. A) למבדה מחושבת מקסימום Z-ציונים. ב) ספיגה מחושבת של ציוני Z מרביים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
תוצאות המדגם הלא ידוע הראו כי רוב השותפים חישבו את הגודל להיות 76-80 ננומטר. ממוצע המעבדות 1-4 ו-6 נרשם כ-78.02 ± 1.36 ננומטר. מעבדה 5 דיווחה על גודל גדול יותר של 109 ננומטר, והרחיבה את הממוצע הכולל ואת סטיית התקן עד 83.18 ± 12.70 ננומטר, דבר המצביע על כך שערך זה היה חריג (איור 4A). ציוני Z חושבו להיות בין -0.25-0.56 עבור כל המעבדות; היוצא מן הכלל היחיד היה עבור הגודל הלא ידוע שדווח על ידי מעבדה 6, שהציגה את ציון Z החיובי הגבוה ביותר (2.03) בהשוואה לכל המדידות, שניתן לראות כערך מרוחק מהממוצע (איור 4B).
איור 4: גודל מדגם לא ידוע וציוני Z. A) גודל מדווח עבור כל מעבדה עבור המדגם הלא ידוע שסופק. ב) ציוני Z מחושבים עבור כל תוצאה בודדת לעומת הממוצע הכולל של 83.18 ± 12.70 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
מידע משלים (SI): אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קיימות מספר שיטות לאפיון מאפיינים ננומטריים הקשורים (לדוגמה, אולטרה-צנטריפוגה אנליטית (AUC), מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת/שידור אלקטרונים (SEM/TEM) ופיזור אור דינמי (DLS)10,11). עם זאת, טכניקות אלה חסרות את הפשטות של UV-Vis כדי להשיג תוצאות עיקריות באפיון של NMs12,13. UV-Vis הוא מכשיר נפוץ אפילו במעבדות לא כל כך מצוידות היטב, מה שהופך אותו כלי ללא מנוצח לאפיון של NMs6. בעת אפיון NMs, חשוב לשקול את המגבלות, החוזקות והחולשות של הטכניקות שיש ליישם. בספקטרומטר UV-Vis, קרן האור עוברת דרך תא המדגם וכתוצאה מכך ערכי ספיגה; כתוצאה מכך, תנודות חיצוניות, אור חיצוני, מזהמים וביצועי המשתמש עלולים להפריע למדידה ולתוצאות4,12. באופן דומה, בעת התוויית עקומת כיול כדי לקבוע את גודל המדגם הלא ידוע, חשוב לרשום את כל המדידות הדרושות לבניית הכיול, שכן גורמים חסרים עשויים לתרום לשינויים בין מדידות ומשתמשים.
לדוגמה, השונות הגבוהה בממוצע האבסמקס הכולל של המדגם הלא ידוע עשויה להיות קשורה להבדלים בין המעבדות בשל התלות בין עוצמת הקרן, המיקום והמכשיר עצמו17,18. יתר על כן, הנתונים החסרים עבור גודל 100 ננומטר ממעבדה 5, עקב בעיית זיהום, עשויים גם לתרום להבדלים הגבוהים בין התוצאות, שכן הנתונים החסרים עשויים להשפיע על עקומת הכיול ועל המשוואה הפולינומית המותתת המשמשת לחישוב גודל ההשעיה הלא ידועה של AuNP. אין ספק, רבייה בין פרוטוקולים ומעבדות יכולה להיות מסובכת, שכן גורמים רבים עשויים לתרום לחוסר עקביות בפעילויות המעבדה, וכתוצאה מכך חוקרים אינם מסוגלים מדי פעם לשחזר ממצאים ממעבדות אחרות, מה שעלול להוביל להתקדמות מדעית איטית יותר, זמן מבוזבז, כסף ומשאבים19. האפיון המוצלח של תכונות פיזיותכימיות של NMs, במיוחד בגודל, דורש שיטה קלה לביצוע על ידי כל המעבדות המשתתפות, אשר ניתן לטפל בעיקר על ידי ביצוע שכפול שיטתי ורעיוני, כגון יצירת SOP, אימון מכשירים, והימנעות משימוש בדגימות מזוהות או מזוהמות צולבות15,19.
באופן דומה, האיכות והיציבות של ההשעיה הקולואידית הם גם גורמים חשובים שיש לקחת בחשבון, שכן שינויים במאפיינים הפיזיקוכימיים שלהם עשויים להוביל לתוצאות שונות. לכן, כדי להבטיח את יציבותם לתקופות ארוכות יותר, מתלים ננו-חלקיקים צריך להיות מאוחסן בחושך ב 4 °C (70 °F). כמו כן, במהלך תהליך המשלוח, יש לשמור על הדגימות aliquoted קר, כמו תקופות ארוכות בטמפרטורת החדר עלול להוביל צבירה משמעותית20. בנוסף, כדי להתגבר על כשלים באפיון NM, יש צורך לספק גישה לנתונים המקוריים, לפרוטוקולים וחומרי מחקר מרכזיים בין מעבדות משתפות פעולה, במיוחד בעת הערכת המיומנות, העקביות והאמינות באמצעות ILC15. הפיכת גורמים אלה ברורים ונגישים היא המפתח להשגת אפיון NM מוצלח על ידי כל מעבדה או ציוד. התעלמות מהיבטים אלה עלולה לגרום לחוסר רבייה, דיוק ותוצאות מטעות או שגויות15. למרות ספקטרוסקופיה UV-Vis הוכח להיות תקן הזהב באפיון NM, זה יכול להיות מנוצל בתחומים רבים אחרים כפי שהוא מאפשר קביעה כמותית של מגוון דינמי מורחב של פתרונות הן תרכובות אנאורגניות ואורגניות6,21.
חוץ מזה, UV-Vis ניתן לשלב בקלות עם כלים אחרים כדי למדוד מגוון רחב של תכונות, ובכך לשפר את האיכות של כל ניתוח22. בהתבסס על תכונות אלה, UV-Vis נמצא בשימוש נרחב בתחומים רבים כגון בתחום הביופארמה על ידי מדידת ספקטרום UV-Vis בפתרונות חלבון בריכוז גבוה, בבקרה סביבתית בעת השוואת קווי דמיון בין מזהמים לבין זיהומים הקשורים למוצר שלהם בזמן אמת, במפעלים לטיפול בשפכים תעשייתיים כחלק תקנה לקביעת צבע שפכים ורמת מקובלות22, 23. אין ספק, ככל שהטכנולוגיה מתקדמת ותכונות וניסיון מתקדמים יותר הופכים לזמינים בספקטרופוטומטריה, תתרחש הרחבה נוספת של היישומים והפרמטרים שניתן למדוד באמצעות טכניקה זו. לדוגמה, ביישומי שדה, ספקטרומטריה UV-Vis מקוונת היא כלי רב ערך לניטור פרמטרים רבים בזמן אמת ובסוגים שונים של נוזלים, המהווה תכונה יוצאת דופן בקרב מערכות חיישנים מקוונות22.
ILC המתואר כאן תוכנן כמבחן של SOP שפותח עבור UV-Vis בין שש מעבדות משתתפות המעורבות בפרויקט H2020 ACEnano. ניתוח התוצאות הראה כי ILC מספק מידע בעל ערך כדי לאפשר ביטחון טכני בשיטה פנימית לאפיון NM על ידי כל מעבדת משתתפים. איסוף נתונים בתבנית מבוססת אישר עקביות ופרשנות מהירה יותר של התוצאות וסיפק מודל להערכת הגודל של מדגם AuNP לא ידוע, אשר גם הציג יכולת חזרה בין תוצאות כאשר נכללו מספיק נקודות בעקומת הכיול. יתר על כן, התוצאות אימתו את האפקטיביות של UV-Vis עבור אפיון NM, כמו גם את החשיבות של יצירת פרוטוקולים שיטות עבודה מומלצות. גישה זו מהווה עוד הזדמנות להליך המיושם לתרום לפיתוח מסגרת חקיקה באמצעות פרוטוקולי אפיון NM ניתנים לשחזור המבוססים על בחירת שיטות ופרשנות נתונים הרלוונטיים לרגולטורי הסמכה וגופי ניהול מחקר.
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים.
ACQ רוצה להודות למועצה הלאומית למדע וטכנולוגיה (CONACyT) במקסיקו על מימון לימודי הדוקטורט שלה. כל המחברים מכירים בתמיכה מתוכנית Horizon 2020 של האיחוד האירופי (H2020) במסגרת הסכם מענקים no 720952, פרויקט ACEnano (התקשר NMBP-26-2016).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Absorption Ultra-Micro-cuvette, 200 µL | Hellma | 105.201-QS | |
Cary 5000 spectrophotometer (Spectrophotometer C) | Agilent | Cary 5000 | |
Gold nanoparticles 5 nm | BBI solutions | EM.GC5 | |
Gold nanoparticles 20 nm | BBI solutions | EM.GC20 | |
Gold nanoparticles 40 nm | BBI solutions | EM.GC40 | |
Gold nanoparticles 60 nm | BBI solutions | EM.GC60 | |
Gold nanoparticles 80 nm | BBI solutions | EM.GC80 | |
Gold nanoparticles 100 nm | BBI solutions | EM.GC100 | |
Agilent / HP 8453 (Spectrophotometer E) | |||
Jenway 6800 spectrophotometer (Spectrophotometer A) | Jenway | UV6800 | |
Polystyrene cuvette, 1.5 mL, micro 10 mm pathlength | Sigma | 759015 | |
Polystyrene cuvette, 3 mL (10 mm x 10 mm x 45 mm) | Sarstedt Inc | 67.742 | |
Semi-micro quartz cuvette, 1mL (1 mm x 10 mm x 45 mm) | Agilent | 6610001 | |
Ultrapure water (UPW) (18.2 MΩcm). | / | / | |
UV-1800 spectrophotometer (Spectrophotometer B) | Shimadzu | UV1800 | |
Varian Cary 50 spectrophotometer (Spectrophotometer D) | Agilent | Cary 50 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved