研究成年蚊子排泄系统神经肽和其他调节剂的活性

摘要

该协议概述了Ramsay测定，离子选择性微电极，扫描离子选择性电极技术（SIET）和体外收缩测定背后的方法，应用于研究由Malpighian小管和后肠组成的成年蚊子排泄系统，以共同测量离子和液体分泌速率，收缩活性和经上皮离子运输。

摘要

对昆虫生理学的研究，特别是那些作为人类和其他脊椎动物疾病的病原体载体的物种的研究，为制定新的害虫控制策略奠定了基础。在这里，描述了一系列方法，这些方法通常用于确定神经肽和其他神经元因素（即生物胺）对蚊子埃及 伊蚊排泄系统的功能作用。马尔皮吉安小管（MT）负责原发性尿液的形成，当从蚊子身上取出时，可以继续运作数小时，从而可以在激素治疗后进行液体分泌测量。因此，Ramsay测定是测量分离MT的分泌速率的有用技术，离子选择性微电极（ISME）可以依次用于测量分泌液中的离子浓度（即Na ⁺ 和K ⁺）。该测定允许在给定时间测量多个MT，确定各种激素和药物的作用。扫描离子选择性电极技术使用ISME来测量离子传输器官表面附近未颤动层中离子活性的代表电压，以近乎实时地确定离子的经上皮传输。该方法可用于了解激素和其他调节剂对上皮离子吸收或分泌的作用。后肠收缩测定也是表征肌活性神经肽的有用工具，其可能增强或降低该器官去除多余液体和废物的能力。总的来说，这些方法提供了对成年蚊子如何调节排泄系统的见解。这很重要，因为排泄器官的功能协调对于克服诸如闭合后和找到合适的脊椎动物宿主以获得血粉之前的干燥应激等挑战至关重要。

引言

维持昆虫的盐和水位使它们能够利用各种喂养策略在许多生态和环境生态位中取得成功¹。大多数昆虫已经进化出在狭窄范围内调节其血迹组成机制，以承受与其特定环境相关的不同挑战²。陆生昆虫经常面临节水的挑战，排泄系统经过抗利尿，以防止水和一些必需盐的流失，因此，避免干燥。相反，当昆虫进食并受到过量水和潜在盐的挑战时，就会发生利尿^3，4。通过其专业和高度活跃的排泄系统，昆虫已经进化出调节机制，以应对它们的渗透调节挑战。在成年 埃及伊 蚊中，排泄系统由马尔皮吉亚小管（MTs）和后肠组成，后者由回肠前部和直肠后^部组成5。MT负责产生原发性尿液，通常富含NaCl和/或KCl。然后，当原尿在小管下游进入后肠时，通过分泌和再吸收过程进行修饰⁵。根据喂养/环境条件，最终排泄物可能与血淋巴过度或低渗，并且富含有毒和含氮废物²。

MTs是研究上皮液和溶质转运的许多特征的理想选择，因为它们具有多种转运和排泄功能^2，6。通过激素调节²，MTs通过将血液中的离子和其他溶质分泌到肾小管腔⁷中起作用，提供渗透梯度，允许水通道蛋白8，9运输水通道蛋白^8，9，共同产生原乳，然后行进到重吸收后肠²。因此，通过从分离的MT中收集分泌的液体，可以连续监测液体和离子的经上皮运输。测量分泌速率和尿液组成可深入了解负责经上皮离子和液体运输的机制。研究液体分泌速率的一种流行方法是拉姆齐测定法，该测定法由拉姆齐于195310年首次引入。在这种方法中，小管的远端（闭合）端用激素（或其他测试化合物/药物）处理，而近端（开放）端缠绕在水饱和石蜡油中的针上，其分泌原发尿液，积聚在针尖上作为液滴。分离的MT能够在优化的体外条件下长时间（长达24小时）存活和运行，这使其成为流体分泌测量的合适和有效的模型。昆虫具有开放的循环系统，因此MT很容易被解剖和移除，因为它们通常自由漂浮在血淋巴^中6。此外，除了缺乏^MTs11的蚜虫外，给定昆虫物种中的MT数量可能从四个到数百个（伊蚊中有五个）不等，允许对一种昆虫进行多次测量。

伊蚊中的MT与其他内翅目昆虫一样，由两种细胞类型组成，形成简单的上皮^2，12;大主细胞，促进阳离子（即Na ⁺和K ⁺）主动转运到腔内，以及薄的星状细胞，有助于经上皮Cl^-分泌¹³。MT不受支配²，而是受多种激素（包括利尿剂和抗利尿因子）的调节，允许控制离子运输（主要是Na ⁺，K ⁺和Cl^-）和渗透压性水²。许多研究已经检查了伊蚊MT的荷尔蒙调节，以了解内分泌因素对经上皮运输的作用^14，15，^16，17，18。如代表性结果所示，本文的方案证明了不同激素因素对成年雌性埃及伊蚊分离的MT的影响，包括利尿剂和抗利尿剂控制（图1）。Ramsay测定用于证明抗利尿激素AedaeCAPA-1如何抑制利尿激素31_（DH31）刺激的MT的液体分泌（图1）。

昆虫的较小尺寸需要开发微观方法来测量流体样品中的离子活性和浓度，或靠近分离组织（如MT和肠道）表面的离子活性和浓度。已经实施了不同的方法，包括使用离子的放射性同位素¹⁹，这需要收集分泌的液滴来测量离子浓度²⁰。体外受刺激的 伊蚊 小管通常分泌约0.5 nL/^min21，因此处理如此小的体积可能会带来挑战，并可能在转移时引入错误。因此，离子选择性微电极（IME）已被广泛用于测量体外MT分泌液滴中的离子浓度。在该方法中，将充满适当回填溶液和离子载体的参比电极和ISME定位到分泌的尿液滴中以确定离子浓度²²。改编自Donini及其同事²³，该当前方案使用Na ⁺选择性离子载体来测量成年 伊蚊 中受刺激MT的分泌液滴中的离子活性。由于离子选择性微电极测量离子活性，因此该数据可以表示为离子浓度，假设校准溶液和实验样品具有相同的离子活性系数²¹ （图1B，C）。

扫描离子选择性电极技术（SIET）还利用ISME来测量与运输离子的器官，组织或细胞相邻的未搅动层中的离子浓度梯度。IME测量电压梯度，然后可用于计算离子浓度梯度以及器官，组织或细胞中离子通量的方向和幅度²⁰。在这种技术中，ISME被安装在由计算机化的微步进电机控制的三轴机械手上，以便将其3D位置控制到千分尺级²⁰。使用计算机软件编程和控制的采样协议在未颤动层内的两个点测量电压。这两个点通常相隔20-100μm，其中一个点在器官，组织或细胞表面的5-10μm范围内，第二个点距离20-100μm。计算两点之间电压幅度的差异以获得电压梯度^24，25，26，然后使用菲克定律^24，27计算浓度梯度和随后的净通量。该方法可用于评估特定离子在昆虫肠道和MT的不同区域的转运，或在血粉或治疗暴露后的特定时间点。例如，SIET可用于了解蚊子排泄系统中的吸收和分泌过程如何受到激素²⁸ 以及不同的进食行为和饲养条件^的调节25。先前利用SIET的工作揭示了沿着幼虫和成年蚊子的肛门乳头和直肠的离子运输的位点^24，28。Paluzzi及其同事之前描述的当前方案²⁶测量成年女性直肠上睑的Na ⁺ 通量（图2）。

蚊子排泄系统的最后一段需要协调的肌肉运动，以帮助混合食物和分泌废物²⁶。来自中肠的不可吸收的消化产物以及MT分泌的原发性尿液通过幽门并输送到后肠²。自发性后肠收缩始于幽门瓣，以蠕动波的形式发生，蠕动波通过上皮细胞基底表面周围的圆形和纵向肌肉的协调收缩传递回肠²⁶。最后，直肠内的肌肉有助于推动和消除通过肛管的废物。虽然昆虫后肠的运动是肌源性的，需要细胞外^{Ca2 +} 产生自发收缩，但这些过程也可以在神经元上调节^26，29，30。神经系统的这种外源性调节在喂食后很重要，因为动物必须从肠道排出废物并恢复血库平衡³¹。因此，进行体外生物测定以鉴定肌刺激性或肌抑制性神经肽有助于评估神经化学物质如何影响后肠运动。由Lajevardi和^Paluzzi28执行的当前方案使用视频记录来检查对神经肽的反应的回肠运动（图3）。类似地，力传感器或阻抗转换器也可用于通过数据采集软件^32，33观察收缩的痕迹。然而，使用视频技术使我们能够直观地评估器官，并使用参数子集进一步分析，以确定激素对后肠运动的作用。

使用这些技术可以帮助表征调节和协调沿排泄系统的流体和离子运输以及后肠运动的因素。重要的是，MTs的利尿剂反应与后肠运动之间的功能联系得到了支持，因为利尿激素，如_DH31 和5HT，其特征在于它们刺激MT分泌液体的能力，也被发现沿着蚊子hindgut表现出肌力作用^21，34，35.这些发现强调了在需要快速消除废物的昆虫餐后利尿等事件中，MT和后肠之间严格协调的重要性。

本文描述了Ramsay测定技术背后的详细方法，以测量蚊子埃及 伊蚊中的液体分泌速率，以及使用离子选择性微电极来确定MT分泌液中的Na ⁺ 浓度，当它们结合时允许确定经上皮离子转运速率。此外，还描述了扫描离子选择性电极技术和后肠收缩测定，以分别测量离子通量和运动性，这有助于阐明后肠的荷尔蒙调节（图4）。

研究方案

1. 制作硅胶衬里的盘子

注意:此步骤应在实验之前完成。这些培养皿将用于准备用于解剖和收缩测定实验的测定皿。

1. 按照制造商的建议，使用有机硅弹性体套件制备有机硅。以10:1的比例混合两组份液体组分。通过倒置轻柔彻底地混合，但一定要尽量减少气泡的形成。
2. 将有机硅弹性体倒入标准的60 mm一次性聚苯乙烯培养皿中，深度通常在7-9 mm之间。根据需要准备尽可能多的菜肴。将硅胶倒入培养皿后不久，在显微镜下使用细针去除任何气泡。将培养皿置于室温（RT）下的无尘室或柜中至少48小时，或在50°C的烘箱中约4小时以固化（硬化）（图5A）。

2. 制作拉姆齐测定盘

注意:培养皿可以在实验之间重复使用，因此，仅当培养皿损坏或破裂时，才重复此步骤。使用单独的盘子进行解剖。

1. 使用手术刀（使用标准利器预防措施），在其中一个硅胶涂层的培养皿中创建孔以准备测定皿，方法是从培养皿顶部除去足够的硅胶，约5毫米（这应该适合〜20μL沐浴液滴）。在此之前，使用永久性标记标记盘下的位置，以注意在哪里制作孔。孔应相距约1厘米，直径约4毫米，以使小管的远端适合。每个孔将包含一个流体分泌小管，因此包含20孔的培养皿将允许每个实验分析多达20 MTs。
2. 要准备细节针脚，请将0.1 mm不锈钢针脚排成一排，放在一块垂直于胶带轴的标签胶带上。使用剪刀沿着胶带的长度切割，形成相等的两半针脚。为每个孔使用半个引脚。
3. 使用一对钝镊子，将每个半针插入硅胶涂层的测定皿中，在每个孔旁边。根据昆虫小管的长度，将半销插入一定距离，使小管的远端浸入沐浴盐水中，近端缠绕在销子周围。这一步可以在显微镜下完成，以便轻松可视化孔。这些引脚可以重复使用，但是，如果损坏或丢失，请更换半引脚。（图5B）

3. 制作聚-L-赖氨酸包衣SIET碟

注意:在SIET测量期间，此步骤对于器官粘附在培养皿底部非常重要，可确保每个样品的测量部位保持不变。这些菜肴的准备工作应在实验前至少2天进行。在应用特定处理时，每道菜只能使用一次。在每次样品后处理，或者如果聚-L-赖氨酸涂层被刮掉或损坏。

1. 对于每个样品，将35毫米培养皿放在水平表面上。取下盖子，在每个培养皿的中心移取70μL聚-L-赖氨酸（0.1mg / mL）。将盖子放回，让聚-L-赖氨酸干燥（约48小时）不受干扰。
2. 干燥后，用圆圈标记培养皿底部，勾勒出干燥的聚-L-赖氨酸涂层，以更好地可视化解剖后切除器官应放置的位置。如果需要在实验中最大限度地减少盐水和处理溶液的体积，请使用热胶枪包围聚-L-赖氨酸涂层，留出足够的空间供电极移动并进行背景测量（胶合圆的直径〜20-25毫米就足够了）。这些涂层皿可以在室温下无限期储存（图5C）。

4. 为实验准备拉姆齐和收缩测定皿

注意:该盘子可以重复使用（提供适当的洗涤以去除以前使用的盐水/处理），因此只有在板损坏或破裂时才重复此步骤。使用单独的盘子进行解剖。此步骤在实验当天执行。

1. 对于收缩测定皿，使用手术刀（使用标准尖锐预防措施），在其中一个硅胶涂层的培养皿中创建孔以准备测定皿。将手术刀倾斜，使孔变成三角形，以便于将解剖的组织固定在边缘上。孔应足够大，可以容纳高达250μL并适合整个消化道（而不是挖得太深，使孔宽至约0.5-1厘米）（图5D）。
2. 对于拉姆齐板，使用移液器并填充高达20μL溶液的孔（18μL在步骤5.2中制备的1X Aedes 盐水:Schneider的培养基和2μL激素/药物）。对于未受刺激的对照，用20μL的1X 伊蚊 盐水填充孔:施耐德培养基。一旦所有孔都填满，将水合矿物油倒入测定皿中，直到孔和细针被淹没。使用20μL移液器吸头弹出或去除可能干扰分泌液滴的气泡。

5. 准备解决方案

1. 制备2X 埃及伊蚊 盐水和10x葡萄糖，如 表1所述，改编自Petzel及其同事³⁶。储备溶液应储存在4°C。 制作1X 埃及伊蚊 盐水的工作储备（表1），并储存在4°C。 在实验日，让工作库存在使用前进入RT。如果有任何真菌或细菌生长的证据，请新鲜准备。
2. 要准备沐浴液滴，将 伊蚊 盐水（从步骤5.1开始）与施耐德培养基以1:1的比例混合。根据需要多少，以小等分试样准备。将施耐德培养基放在冰箱中，如果有任何真菌或细菌生长的证据，请丢弃。（此步骤应在实验当天完成）。
3. 对于使用SIET的Na ⁺通量测量，如前所述，制备改良的无^{Ca2 +}无伊蚊盐水（表2^）。

6. 蚊虫和后肠解剖

1. 对于成年蚊子解剖，将蛹收集在一个小烧杯中，并放入装有蔗糖溶液的罐子中喂食。为了确定蚊子的年龄，隔离孵化的蚊子，并放在不同的罐子里，记下蚊子的年龄和性别，以便将来解剖。
2. 将蚊子短暂地放在_CO2 垫上解剖，然后等待直到没有反应。使用细镊子，从蚊子的腿或翅膀上捡起蚊子，然后放在步骤1中制备的有机硅弹性体涂层解剖皿上。将蚊子放在一侧（侧面朝上），并用细针刺入胸部以将蚊子固定到位。或者，将翅膀和腿从蚊子身上取下，以便于解剖。
3. 使用巴斯德移液器，加入一滴RT伊蚊盐水，使蚊子完全浸入生理盐水中。确保解剖全部在生理盐水下（用于制作伊蚊盐水，请参见表1）。
4. 将解剖皿置于立体显微镜下。用细镊子捏住最后一个腹段，慢慢远离蚊子。通过同时在显微镜下观察来促进这一步。与MT和后肠相连的中肠应暴露在外（图6）。
5. 对于拉姆齐测定，小心地从中肠 - 后肠连接处取出每个小管，确保不会损害器官。使用锋利的细镊子单独去除小管 - 不要使用损坏的小管进行测定。（有关设置，请参阅步骤 7。
6. 对于SIET，在不含^{Ca2 +}的 伊蚊 盐水中解剖后肠（步骤5.3）。确保聚-L-赖氨酸培养皿也具有固定体积的无^{Ca2 +}伊 蚊 盐水。小心地从直肠中取出角质层，并将后肠（可以去除任何其他附着的器官，取决于正在测量的内容）放入聚-L-赖氨酸培养皿中。如果测量沿直肠垫上皮的离子传输，请将至少一个直肠垫的面向血淋巴的一侧定位为微电极可触及（图7）。
   1. 使用镊子抓住最后端，将后肠向下带到培养皿的底部（不损坏任何将被测量的结构）。一旦器官接触到聚-L-赖氨酸外套，它就会粘附。这个解剖的样品已经准备好进行测量。（有关SIET设置和测量的信息，请参见步骤14–16。
7. 对于回肠收缩测定，确保后肠在解剖过程中仍然附着在中肠上（图4D）。小心地移除MT，以便不受阻碍地看到后肠。该器官将被转移到步骤4.1中所述制备的新培养皿中。（参见步骤17获取测定视频。

7. 设置拉姆齐检测

1. 使用镊子的尖端，通过将小管的近端（开放）覆盖在镊子上（不要捏小管）来小心地将其抬起，然后转移到测定皿的孔中。此步骤也可以使用精细玻璃探头完成。
2. 一旦小管浸入孔中，用镊子捡起小管的近端，将其从沐浴液滴中取出，并将末端缠绕在销子上。将小管缠绕在销子上两次 - 并保持留在沐浴液滴中的小管长度与其他小管一致。此时，小管的远端应该在沐浴液滴中，而近端缠绕在远离沐浴液滴的销上，允许分泌的液体从开放的近端积聚在销的尖端。
3. 在小管缠绕在销钉上后，立即记下孔（例如，A，B，C），时间（这将是液体开始从小管分泌的时间）以及任何其他识别信息（例如，激素，基因型等）。
4. 每只蚊子有五个小管，因此对其余的小管重复步骤7.1-7.3。对于对照和实验治疗，在不同的治疗中拆分五个小管。继续进行下一次解剖，直到整个测定皿被填满。通过练习，这种技术通常需要2-3分钟来解剖小管，将它们转移到沐浴盐水中，并缠绕在针周围，从而在每个小管之间的开始时间产生2-3分钟的差异。
   注意:在开始实验之前，请在所选物镜下用载物台千分尺校准显微镜的眼微计。分泌的液滴通常在40x-50x总放大倍率下测量。
5. 在分配的孵育时间之后，可以测量分泌的液滴。使用显微镜的眼微计，测量并记录分泌液滴的直径。通过将校准转换测量的眼部单位直径相乘来计算分泌液滴的直径（d）（表3）。使用等式计算分泌液滴的体积，V = ^πd3/6。
6. 要计算分泌速率（nL ^min-1），请使用等式，液体分泌速率=V/分泌时间，其中V是步骤7.5中计算的分泌液滴的体积，分泌时间是指小管的潜伏期。

8. ISME 设置

1. 将显微操作器放置在立体显微镜的两侧以设置ISME站。通过将氯化铁溶液浸入氯化铁溶液中并将每根银线穿入每个微电极支架（或在必要时将电线焊接到同轴电缆上）来实现银线的氯化。每当银线变得未氯化时，重复此步骤。
2. 将银线连接到放大器，放大器将读取到数据采集系统。根据制造商的说明设置和校准系统。如果电气干扰增加，请使用正确接地的法拉第保持架。

9. 为ISME和SIET制备微电极

1. 使用P-97 Flaming Brown移液器拉拔器，拉动~5-6个未包化的硼硅酸盐玻璃毛细管（外径1.5 mm，内径1.12 mm，长度100 mm），尖端为1-5μm。这些将用作离子选择性微电极。对于SIET微电极，所得电极应具有~5μm的尖端开口，其特征在于短柄。
2. 在通风橱中，将微电极放在电炉上（小心放下，以免破坏电极的尖端）。在15厘米的玻璃培养皿中加入二氯二甲基硅烷，并在电炉上的电极上倒置。使用二氯二甲基硅烷通过在电极的所有表面上添加疏水涂层来硅烷化离子选择性电极，使其保留疏水离子载体³⁷。未使用的硅烷化电极可以放置几周;因此，该步骤每隔几周执行一次，或用于新拉动的电极。
   注:处理二氯二甲基硅烷时要小心 – 易燃、腐蚀性和有毒，有关安全处理，请参见 MSDS。
   1. 将电炉转至350°C，并留在原位75分钟。使用微电极数量与二氯二甲基硅烷体积（μL）的1:2比例添加到玻璃培养皿中。因此，对于10个微电极，加入20μL二氯二甲基硅烷。
3. 75分钟后，关闭热板。电极和热板冷却后，取出玻璃培养皿，并将电极（带镊子）转移到装有成型粘土的储物盒中。确保电极尖端朝上，以防止任何损坏。
4. 要制造用于ISME的参比电极，请拉动~4-5个长丝硼硅酸盐玻璃毛细管（外径1 mm，内径0.58 mm，长度100 mm）。这些电极不必进行硅烷化。贴标签并存放在类似的盒子中，避免对吸头造成任何损坏。
5. SIET 参比电极由标准玻璃毛细管（外径 2 mm、内径 1.12 mm、长度 102 mm）制成。毛细管中充满熔融的1 M KCl + 3%琼脂，应储存在含有1 M KCl（完全浸没）的50 mL离心管中，直到使用。它们可以反复使用，直到气泡开始形成或琼脂破裂。如果有任何空气空间，请处理好玻璃并使用新的空气空间，以确保电路完整。

10. 准备回填注射器

注意:完成此步骤是为了创建细头注射器以回填ISME的电极。

1. 使用 1 mL 滑头注射器和一次性针头。丢弃针头并将注射器拉回1 mL标记。在通风口下，打开本生燃烧器，加热注射器的塑料尖端，直到它开始融化。使用一对旧的镊子，小心地捏住融化的注射器尖端，然后向下拉以拉伸尖端。
2. 使用剪刀将熔化的尖端切割成所需的长度，使直径足够小以适合电极内部（见图）。注射器冷却后，用水测试注射器的压力，以确保没有堵塞。为每个所需的回填解决方案创建一个，并相应地进行标记（图 8）。

11. 填充ISME和SIET的离子选择性和参比微电极

注意:微电极只要仍在工作，就可以重复使用（每次实验前校准）。对于ISME，该步骤可以在MT在Ramsay测定中孵育时完成。

1. 要制造Na ⁺选择性微电极，请使用步骤10中创建的1 mL注射器用100 mM NaCl回填电极。确保回填液充满，直到电极尖端。如果出现气泡，请轻轻轻拂微电极或取出溶液并重新填充。这应该在立体显微镜下完成，以便更好地可视化。
2. 在立体显微镜下，将10μL移液器吸头浸入Na ⁺选择性离子载体溶液中。将电极垂直于移液器排列，将戴着手套的手指放在吸头底部以产生压力并排出一小滴离子载体。在显微镜的高物镜下观察，小心地将离子载体的液滴触摸到微电极尖端，避免断裂尖端。通常，微电极向前填充离子载体鸡尾酒柱长度在150-300μm之间，直到离子载体/回填溶液边界平坦。
   注意:该离子载体有毒，请参阅MSDS以确保安全处理。
3. 在一个小烧杯中，用100 mM NaCl填充一半，然后将一些建模粘土放在烧杯顶部的内部。在Na ⁺ 离子载体被吸收后，将电极尖端向下放在烧杯壁上，让尖端位于100 mM NaCl内，并将ISME保持在烧杯中，直到它准备好使用。
4. 要制作ISME参比电极，请用500 mM KCl回填电极，确保溶液填充到尖端（遵循与上述相同的协议）。将 KCl 存放在烧杯中。

12. ISME的校准电极

注意:此步骤在测量分泌液之前（约10-15分钟前）执行。应每~5-6次测量进行一次校准，以确保斜率一致。

1. 使用溶解在四氢呋喃中的约3.5%（w / v）聚氯乙烯溶液涂覆电极尖端，以避免离子载体在浸没在石蜡油中时发生位移。
   注意:这是易燃的，请参阅MSDS以确保安全处理。
2. 要校准Na ⁺ 电极，将10μL以下NaCl标准浓度的液滴放入Ramsay培养皿的边缘，并孵育MTs:200mM NaCl和20mM + 180mM LiCl。将标准液滴分开〜2厘米，顶部浓度较高。
3. 将参比电极和离子选择性电极插入氯化银线上，并使用连接到显微操作器的电极支架将其牢固地固定。使用显微操纵器将两个电极朝向200 mM NaCl液滴，确保电极尖端不会接触培养皿的底部。打开静电计开始记录，并使读数稳定下来。
4. 记录读数并继续下一个标准（20 mM NaCl + 180 mM LiCl）。计算斜率，如果电极读数稳定且斜率在范围内，则继续使用电极进行分泌的液滴测量。如果读数不稳定，没有给出适当的记录或斜率，或者需要一段时间才能平衡，请准备一个新的离子选择性电极，或者通过将组织穿过尖端来破坏参比电极的尖端。Na⁺ 的斜率应为~58–60 ^mV38，但可接受的范围为50–60 mV。

13. ISME记录和计算

1. 在测量流体分泌速率（见步骤7.7）之后，使用显微操作器小心地将参比电极和离子选择性电极移动到分泌的液滴中。打开录制，并允许读数稳定并记录值。对其他液滴重复此步骤（每约5-6次测量重复校准测量）。
2. 阳离子浓度使用前面描述的方程^{计算22，38}，[离子] = [C] x ^{10ΔV / m}，其中[C]是用于校准ISME的校准溶液的以mmol ^L-1 为单位的浓度，ΔV是从分泌的液滴记录的电压与同一校准溶液的电压之间的电压变化， 而m是两个标准校准之间的电压差，这也是斜率。

14. SIET 设置

注:SIET系统在前面已有描述^27，39。为了减少背景噪音，在光学显微镜和头台周围安装了法拉第笼。本文中的实验使用自动扫描电极技术（ASET）软件2.0上的以下设置:4秒的等待期，以允许离子梯度完全重新建立以下微电极运动，在等待期后记录0.5秒的电压，偏移距离为100μm，每次记录重复三次。用户可以根据需要在 ASET 中修改某些设置。

1. 打开 IPA-2 离子/偏振放大器、光学显微镜（带有连接的摄像机）以及连接到每个运行 ASET 和 cellSens 的计算机。
2. 准备步骤9.1-9.3，9.5，10和11.1-11.3中描述的微电极和参比电极。离子选择性微电极将含有具有100 mM NaCl回填的Na ⁺ 离子载体，并且参比电极（带有琼脂桥）将始终充满3 M KCl。
3. 将 Na⁺ 选择性微电极放在由氯化银 （AgCl） 导线组成的支架上，并将其连接到母连接器插孔中。使用注射器，用新鲜的3 M KCl填充参比电极支架（可以在实验日之前制作并储存在室温下）。
   注:实验后，用_ddH2O冲洗掉参比电极支架。
4. 从装有浸没在3 M KCl中的所有参比电极的烧杯中取出一个参比电极，将一根手指放在一端，并将玻璃毛细管向该手指倾斜以防止琼脂脱落。小心地将一端放入支架中，确保不会形成气泡。如果有气泡，请取出参比电极，用更多的3 M KCl重新填充支架并重复。将电极支架放入母连接器插孔中。

15. SIET校准电极

1. 对于 Na⁺ 测量，请使用 150 mM NaCl 和 15 mM NaCl + 135 mM LiCl 溶液²⁴。两种溶液之间的Na ⁺ 浓度应存在10倍的差异，包括盐水中Na ⁺ （20mM）水平的范围（表2）。
2. 进行实验时，将校准溶液在室温下储存在50 mL离心管中，并在培养皿中等分试样。该等分试样在一天结束时处理。如果有任何证据表明储备溶液中存在污染，请处理并制作新的溶液。
3. 要进行校准，将两种校准溶液（步骤15.1）等分到单独的35mm培养皿中，并将其置于显微镜载物台上。使用手动调节旋钮控制计算机运动控制单元上选择"禁用"的步进电机，确保微电极尖端放置在校准溶液内。不要将尖端浸入太远，因为它可能会破裂。如果尖端断裂，准备新的离子选择性微电极并重新校准。
   1. 在连接到放大器的计算机上，打开 ASET 软件。打开校准设置。选择 能斯特斜率 作为校准类型，将样品设置为3秒，然后输入校准溶液的浓度。例如，对于Na ⁺ 测量，在溶液1中输入150 mM，将Na ⁺选择性微电极尖端和参比电极置于该校准溶液中。放大器上的电压读数应稳定。单击 解决方案1，等待记录电压（以mV为单位）。接下来，将微电极和参比电极置于15 mM NaCl + 135 mM LiCl溶液内，在溶液2中输入15 mM，然后单击 溶液2 以获得电压读数。斜率将是在这些设置中计算的这两个电压之间的差值。校准后，单击 "确定"。
   2. 对于离子浓度变化十倍，Na⁺选择性微电极的斜率应在59.0±1.624左右。如果能斯特斜率大大偏离此范围，请准备新的微电极，或等分新标准品（因为它们可能被污染）。每2-3个样品之前需要校准，具体取决于电压稳定性。如果电压变得不稳定并开始波动，则制备新的离子选择性微电极。

16. SIET 测量

注:计算机运动控制单元上的电机开关应始终切换为"禁用"，除非通过 ASET 使用计算机键操作电极时，或在测量记录期间（此时应将键切换为"启用"）。

1. 校准后，解剖器官（见步骤6.6）。将与解剖样品一起的聚-L-赖氨酸培养皿放在显微镜载物台上，并将参比电极的尖端插入盐水内。将离子选择性微电极的尖端浸没在盐水中，注意不要破坏尖端。
2. 使用手动调节旋钮调整微电极位置，同时在光学显微镜下观察。调整微电极的垂直位置，使其尖端与器官或组织位于同一平面上。到达所需位置后，将电机开关转至 启用。此时，步进电机只能使用计算机软件进行操作。
3. 使用计算机箭头键，将微电极水平移动到距离组织3毫米的位置，以测量背景记录。按 F2 插入注释。准备就绪后，开始录制（按 F5）。获得背景活动的五个测量值。每个样品的平均背景电压活性将从同一样品沿组织测量的电压梯度中减去。
4. 将微电极尖端移回靠近组织的位置，注意不要刺穿器官。降低键击灵敏度，将微电极尖端直接向右放置2μm，垂直于组织。在直肠垫的每个部位获得三个记录，以确定离子活性最大的部位。在显示最大活动的站点（"热点"站点）处获取基线盐水测量值。
5. 将电机切换到禁用，并将适当的处理添加到培养皿中以获得最终所需的剂量。在应用之后，创建一个新的注释（即治疗名称和剂量），将电机切换回 启用 并使用 F5进行电压记录。如果目标是观察随时间的变化，请继续以特定的时间间隔进行测量。可以使用SIET为特定应用创建多个协议，具体取决于研究人员的目标。
6. 观察ASET软件记录沿组织部位的电压，并从距离组织100μm的偏移距离（图7）的电压中减去该电压。由于第一次记录是在组织上进行的，因此正电压差表明上皮（组织）的电压高于远离上皮的电压（图7B），因此阳离子被吸收。负电压梯度表示阳离子分泌。
7. 处理后（3 mm远）再次获取背景记录，并在计算处理后的离子通量时使用这些记录。在"基线"中制作一组背景记录，并在治疗后进行一组背景记录。将电机切换为禁用，只要微电极未使用计算机键进行调整，或者未记录电压。将数据导出到文本文件中，并使用 Excel 打开以执行所有计算。
8. 使用前面描述的方程计算离子通量^24，26。每种处理的净离子通量可以表示为与基线离子通量测量值的绝对变化。为了验证结果的重要性，可以使用载体对照（即，将生理盐水单独添加到培养皿中而不是处理中）。应根据对该对照的反应进行任何变化来评估激素治疗后离子转运的变化。

17. 后肠收缩试验

1. 在步骤4.1中描述的培养皿中用已知体积的 伊蚊 盐水填充其中一个孔（步骤5.1）。解剖后（步骤6.7），小心地将附着在中肠上的解剖后肠转移到另一个培养皿中的孔中，确保不要捏住被检查的器官（回肠）。将肠道浸入井内的盐水中，并将Minutien针放入中肠和直肠中。通过这样做，回肠不应处于紧张状态，并且应观察到起源于回肠前部幽门的自发性收缩。
2. 将摄像机连接到立体显微镜，并使用视频捕获软件（例如Luminera的INFINITY CAPTURE）录制视频。将含有解剖器官的培养皿置于显微镜下并记录2分钟。这将是"基线"条件。
3. 向孔中加入已知体积为1X 的伊蚊 盐水（步骤5.1），以考虑在孔内体积增加时回肠运动的任何变化。在应用后等待1分钟，然后再次记录2分钟。这是"盐水"条件。
4. 加入已知体积的处理（从10x储备浓度到在孔中获得所需剂量）。在应用后等待1分钟，然后再次记录2分钟。这将是"治疗"条件。
5. 保存所有视频并将其转换为MP4。要进行分析，请计算 2 分钟间隔内的收缩次数（定义为在幽门瓣开始并延伸到整个回肠的蠕动波）。将此数字除以 2 分钟得到收缩速率。还可以评估其他参数，例如收缩或松弛持续时间。收集原始数据后，相对于每个样品的"基线"条件的数据表示每个参数。绘制"盐水"和"治疗"的折叠变化，所有这些都与"基线"有关。

结果

_DH31对未刺激的MT的应用导致液体分泌速率显着增加，证实了其作为伊蚊利尿激素的作用（图1A）。当用AedaeCAPA-1处理小管时，在_DH31刺激的MT中观察到分泌速率降低。图1B显示了使用离子选择性电极来测量分泌液滴中的Na ⁺浓度。在MT上处理_DH31对分泌液滴中的Na ⁺浓度没有影响;然而，随着AedaeCAPA-1?...

讨论

当摄入血粉时，食道昆虫面临着血液中溶解物和水过多的挑战²。为了应对这种情况，他们有一个专门的排泄系统，该系统受到荷尔蒙因素的严格控制，使昆虫能够迅速启动餐后利尿。Ramsay测定和离子选择性微电极的使用允许测量分离昆虫MT中的液体分泌速率以及离子浓度和转运速率。这些方法中的关键步骤包括确保正确解剖昆虫MT。必须小心地从昆虫中单独去除每个小管，因为?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringes	Fisher Scientific	14955456
35 mm Petri dishes	Corning Falcon (Fisher Scientific)	C351008
Borosillicate glass capillary filamented tubes (OD 1 mm, ID 0.58 mm, length 100 mm)	World Precision Instruments	1B100F-4	used for ISME reference electrodes
Borosillicate glass capillary filamented tubes (OD 2 mm, ID 1.12 mm, length 102 mm)	World Precision Instruments	1B200F-4	used for SIET reference electrodes
Borosillicate glass capillary unfilamented tubes (OD 1.5 mm, ID 1.12 mm, length 100 mm)	World Precision Instruments	TW150-4	used for ISME and SIET electrodes
CO2 pad	Diamed	GEN59-114
Dimethyltrimethylsilylamine solution	Sigma-Aldrich	41716
Faraday cage	Custom		Can be fabricated by local machine shop
Ferric chloride	Sigma-Aldrich	157740
Forceps (Dumont #5)	Fine Science Tools	91150-20
Glass Petri dish	Fisher Scientific	08-748A
Hydrated mineral oil	Fisher Scientific	8042-47-5	Specific brand is not important
INFINITY1-2CB video camera	Luminera	INFINITY1-2CB
Micromanipulators (left and right handed)	World Precision Instruments	MMJL and MMJR	Specific brand is not important so long as high quality manipulator
Mineral Oil, Light	Fisher Scientific	0121-4
Minutien pins (0.1 mm stainless steel)	Fine Science Tools	26002-10
Non-hardening modeling clay	Sargent Art		Specific brand is not important
Olympus light microscope (FOR SIET)	Olympus	customized system
Plastic Pasteur (transfer) pipette	Fisher Scientific	13-711-7M
Poly-L-lysine solution (0.1 mg/mL)	Sigma-Aldrich	A-005-M	84 kDa
Polyvinyl chloride (PVC)	Sigma-Aldrich	81395
Scalpel Blade	Fine Science Tools	10050-00
Scalpel Handle	Fine Science Tools	10053-09
Schneider's Drosophila medium	Sigma-Aldrich	S0146
SIET system	Applicable Electronics	customized system	Details available at: http://www.applicableelectronics.com/overview
Silver wire	World Precision Instruments	AGW1010
Sodium ionophore II cocktail A	Fluka	99357
Standard polystyrene Petri (culture) dishes	Fisherbrand	FB012921	Any size would work, but 60 mm dishes are good for both dissections and assay
Stereomicroscope with ocular micrometer	Nikon	SMZ800
Sutter P-97 Flaming Brown Pipette puller	Sutter Instruments	FGPN7
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Chemical Company	NC9285739
Tetrahydrofuran	Sigma-Aldrich	401757
VWR advanced hotplate stirrer - aluminum	VWR	9578	Specific brand is not important