成虫の蚊における排泄系の神経ペプチドおよび他の調節因子の活性の研究

要約

このプロトコルは、ラムゼイアッセイ、イオン選択微電極、走査型イオン選択電極技術(SIET)、およびインビトロ収縮アッセイの背後にある方法論を概説し、マルピーギ尿細管と後腸からなる成虫の蚊排泄系を研究するために適用され、イオンおよび流体分泌速度、収縮活性、および経上皮イオン輸送を集合的に測定する。

要約

昆虫生理学の研究、特にヒトおよび他の脊椎動物に疾患を引き起こす病原体のベクターであるこれらの種において、有害生物防除のための新規戦略を開発するための基礎を提供する。ここでは、蚊、Aedes aegyptiの排泄系における神経ペプチドおよび他のニューロン因子(すなわち、生物起源アミン)の機能的役割を決定するために日常的に利用されている一連の方法が記載されている。一次尿形成の原因となるマルピーギ尿細管(MT)は、蚊から取り除かれても何時間も機能し続けることができ、ホルモン治療後の体液分泌測定を可能にします。そのため、ラムゼイアッセイは、単離されたMTからの分泌速度を測定するのに有用な技術であり、イオン選択微小電極(ISME)は、分泌流体中のイオン濃度(すなわち、Na+およびK⁺)を測定するために連続的に使用することができる。このアッセイは、所与の時間にいくつかのMTの測定を可能にし、様々なホルモンおよび薬物の効果を決定する。走査型イオン選択電極技術は、ISMEを使用してイオン輸送器官の表面に隣接する非攪拌層におけるイオン活性を表す電圧を測定し、イオンの経上皮輸送をほぼリアルタイムで決定する。この方法は、上皮全体のイオン吸収または分泌に対するホルモンおよび他の調節因子の役割を理解するために使用することができる。後腸収縮アッセイはまた、筋活性神経ペプチドを特徴付けるための有用なツールであり、それは過剰な体液および老廃物を除去するこの器官の能力を増強または減少させる可能性がある。全体として、これらの方法は、成虫の蚊において排泄系がどのように調節されているかについての洞察を提供する。排泄器官の機能的協調は、排泄後および血液ミールを得るために適切な脊椎動物宿主を見つける前に、乾燥ストレスなどの課題を克服する上で重要であるため、これは重要である。

概要

昆虫の塩分と水位を維持することで、さまざまな摂食戦略を利用して、多くの生態学的および環境的ニッチで成功することができます¹。ほとんどの昆虫は、特定の環境に関連するさまざまな課題に耐えるために、狭い範囲内でヘモリンパの組成を調節するメカニズムを進化させてきました²。陸生昆虫はしばしば水を節約するという課題に直面し、排泄システムは水といくつかの必須塩の損失を防ぐために抗利尿を受け、したがって乾燥を避ける。対照的に、利尿は、昆虫が餌を与え、過剰な水と潜在的に塩で挑戦されるときに起こります^3,4。その専門的で非常に活性な排泄システムを通じて、昆虫は浸透圧調節の課題に対抗するように作用する調節機構を進化させました。成虫のヒトスジシマカでは、排泄系はマルピーギ尿細管(MT)と後腸で構成され、後者は前回腸と後直腸で構成されています⁵。MTは一次尿を生成する役割を担っており、通常はNaClおよび/またはKClが豊富です。一次尿は、尿細管の下流に移動し、後腸に入るにつれて、分泌および再吸収プロセスを通じて修正^{されます5}。最終的な排泄物は、摂食/環境条件に応じて、ヘモリンパに対して高浸透圧または低浸透圧であり、有毒で窒素性の廃棄物に富んでいます²。

MTは、多種多様な輸送および排泄機能を実行するため、上皮液および溶質輸送の多くの特徴を研究するのに理想的です^2,6。ホルモン調節²により、MTは血液から尿細管腔にイオンやその他の溶質を分泌することによって機能し⁷、浸透圧勾配を提供し、水がアクアポリン^8,9によって輸送され、一次尿が集合的に生成され、その後部胃に向かって移動します²。したがって、単離されたMTから分泌流体を収集することによって、流体およびイオンの経上皮輸送を連続的に監視することができる。分泌速度と尿組成を測定することで、経上皮イオンと体液輸送を担うメカニズムに関する洞察が得られます。体液分泌速度を研究するための一般的な方法は、195310年にラムゼイによって最初に導入されたラムゼイアッセイである。この方法では、尿細管の遠位(閉じた)端をホルモン(または他の試験化合物/薬物)で処理し、近位(開いた)端を水飽和パラフィン油のピンに巻き付け、一次尿を分泌し、ピンの先端に液滴として蓄積する。単離されたMTは、最適化されたin vitro条件下で長期間(最大24時間)生存し、機能することができるため、流体分泌測定に適切で効率的なモデルになります。昆虫は開いた循環器系を持っているので、MTは通常ヘモリンパに自由に浮遊しているので、MTは容易に解剖され、取り除かれ^ます6。さらに、^MTs11を欠いているアブラムシを除いて、特定の昆虫種のMTの数は4から数百(ヒトスジシマカでは5匹)とかなり異なり、1つの昆虫から複数の測定が可能です。

ヒトスジシマカの蚊のMTは、他の内翅目昆虫と同様に、単純な上皮を形成する2つの細胞型で構成されています^2,12;内腔への陽イオン(すなわち、Na+およびK⁺)の能動的輸送を促進する大きな主細胞、および経上皮のCl^-分泌を助ける薄い星状細胞¹³。MTは神経支配されておらず2、代わりに利尿作用因子と抗利尿因子の両方を含むいくつかのホルモンによって調節され、イオン輸送(主にNa⁺、K⁺、Cl^-)と浸透圧義務水²の制御を可能にします。多くの研究が、経上皮輸送における内分泌因子の役割を理解するために、ヒトスジシマカMTのホルモン調節を調べてきました14,15,16,17,18。代表的な結果に示されているように、本明細書のプロトコールは、利尿薬および抗利尿薬の両方の対照を含む、成体雌のA. aegypti蚊から単離されたMTに対する異なるホルモン因子の効果を実証する(図1)。ラムゼイアッセイは、抗利尿ホルモンAedaeCAPA-1が利尿ホルモン31(_DH31)によって刺激されたMTの体液分泌をどのように阻害するかを実証するために使用されます(図1)。

昆虫のサイズが小さいほど、流体サンプル中のイオン活性および濃度、またはMTや腸などの単離された組織の表面近くを測定するためのマイクロ法の開発が必要であった。イオン濃度の測定のために分泌された液体滴の収集を必要とするイオン¹⁹の放射性同位元素の使用を含む、様々な方法が実施されている²⁰。インビトロで刺激された ヒトスジシマカ の尿細管は、典型的には〜0.5nL/^min21を分泌するので、このような少量の取り扱いは困難をもたらし、潜在的に転写時にエラーを引き起こす可能性がある。その結果、イオン選択的微小電極(ISME)は、MTの分泌液滴中のイオン濃度をインビトロで測定するために広く使用されている。この方法では、適切なバックフィル溶液およびイオノフォアで満たされた参照電極およびISMEを、分泌された尿液滴内に配置して、イオン濃度^{を決定する22}。Doniniら²³から採用されたこの現在のプロトコルは、Na⁺選択的イオノフォアを使用して、成虫の ヒトスジシマカ の刺激MTから分泌された液滴中のイオン活性を測定する。イオン選択微小電極はイオン活性を測定するため、このデータは、校正溶液と実験サンプルが同じイオン活性係数²¹ を共有するという仮定に従ってイオン濃度として表すことができます(図1B、C)。

走査型イオン選択電極技術(SIET)は、ISMEを使用して、イオンを輸送している器官、組織、または細胞に隣接する未攪拌層のイオン濃度勾配を測定する。ISMEは電圧勾配を測定し、これを使用してイオン濃度勾配と、臓器、組織、または細胞全体のイオン流束の方向と大きさを計算することができます²⁰。この技術では、ISMEは、その3D位置がマイクロメータレベル²⁰に制御されるように、コンピュータ化されたマイクロステッピングモータによって制御される3軸マニピュレータに取り付けられる。電圧は、コンピュータソフトウェアにプログラムされ、制御されるサンプリングプロトコルを使用して、攪拌されていない層内の2点で測定されます。2 つの点は、通常、臓器、組織、または細胞の表面から 5 ~ 10 μm 以内の 1 つの点と、さらに 20 ~ 100 μm 離れた 20 ~ 100 μm の距離で区切られます。2点間の電圧の大きさの差を計算して電圧勾配24,25,26を得,次にこれを用いて濃度勾配を計算し,続いてフィックの法則^24,27を用いて正味磁束を計算する。この方法は、昆虫の腸およびMTの異なる領域にわたる特定のイオンの輸送を評価するために、または血液ミールまたは治療曝露後の特定の時点で評価するために有用である。例えば、SIETは、蚊の排泄系における吸収性および分泌性プロセスがホルモン²⁸、ならびに異なる摂食行動および飼育条件によってどのように調節されるかを理解するために使用することができる²⁵。SIETを利用したこれまでの研究では、幼虫や成虫の蚊の肛門乳頭や直腸に沿ったイオン輸送に関与している部位が明らかになりました^24,28。Paluzziら²⁶によって以前に記述された現在のプロトコルは、成人女性の直腸の直腸パッド上皮を横切るNa⁺フラックスを測定する(図2)。

蚊の排泄システムの最後の部分では、食物を混ぜて老廃物を分泌するのを助けるために、調整された筋肉の動きが必要です²⁶。中腸からの消化の非吸収性生成物は、MTによって分泌される一次尿とともに、幽門弁を通過し、後腸に送達される²。自発的な後腸収縮は幽門弁から始まり、蠕動波で起こり、上皮細胞の基底表面を囲む円形および縦方向の筋肉の協調収縮を介して回腸上に中継される²⁶。最後に、直腸内の筋肉は、肛門管を通って老廃物を推進し、排除するのに役立つ。昆虫の後腸運動性は筋原性であり、自発的な収縮を生じるために細胞外^Ca2+を必要とするが、これらの過程は神経細胞的に調節することもできる^26,29,30。神経系によるこの外因性調節は、動物が腸から老廃物を排出し、血リンパバランスを回復させなければならないため、摂食後に重要です³¹。その結果、筋刺激性または筋抑制性神経ペプチドを同定するためにインビトロバイオアッセイを行うことは、神経化学物質が後腸運動性にどのように影響するかを評価するのに有用である。Lajevardiと^Paluzzi28によって実施された現在のプロトコルは、ビデオ録画を使用して、神経ペプチドに応答した回腸運動性を調べている(図3)。同様に、力変換器またはインピーダンス変換器もまた、データ収集ソフトウェア^32,33を介して収縮の痕跡を観察するために使用^{され得る。}しかし、ビデオ技術を使用することで、臓器を視覚的に評価し、パラメータのサブセットを使用してさらに分析し、後腸の運動性に対するホルモンの役割を特定することができます。

これらの技術を使用すると、後腸の運動性とともに排泄系に沿った流体およびイオン輸送を調節および調整する因子を特徴付けるのに役立つ可能性がある。重要なことに、MTsによる利尿反応と後腸運動との間の機能的リンクが支持されており、_DH31および5HTなどの利尿ホルモンは、MTsによる体液分泌を刺激する能力によって特徴付けられ、蚊の後腸に沿って筋向性作用を示すことも見出されている21,34,35.この新知見は、迅速な老廃物除去を必要とする昆虫における食後利尿などの事象において、MTと後腸との間の厳格な調整の重要性を強調している。

本明細書では、蚊、 A. aegyptiにおける流体分泌速度を測定するためのラムゼイアッセイ技術の背後にある詳細なアプローチ、およびMTsの分泌流体中のNa⁺ 濃度を決定するためのイオン選択的微小電極の使用が記載されており、これを組み合わせると、経上皮イオン輸送速度が決定されることを可能にする。さらに、スキャニングイオン選択電極法と後腸収縮アッセイは、それぞれイオンフラックスと運動性を測定するために記載されており、後腸のホルモン調節を解明するのに役立ちます(図4)。

プロトコル

1. シリコーン張りの皿作り

注: この手順は、実験の前に行う必要があります。これらのディッシュは、解剖のためのアッセイディッシュ、および収縮アッセイ実験のために作製されるであろう。

1. 製造元の推奨事項に従って、シリコーンエラストマーキットを使用してシリコーンを準備します。2液からなる液体成分を10対1の割合で混合する。反転させて優しく徹底的に混ぜますが、気泡の形成を最小限に抑えるようにしてください。
2. シリコーンエラストマーを標準的な60mmの使い捨てポリスチレン培養皿に通常7〜9mmの深さまで注ぐ。必要なだけ多くの料理を準備します。シリコンを皿に注いだ直後に顕微鏡下で微細なピンを使用して気泡を取り除きます。ディッシュを室温(RT)の無塵チャンバーまたはキャビネットに少なくとも48時間、または50°Cのオーブンに約4時間置いて硬化(硬化)させます(図5A)。

2. ラムゼイアッセイ皿を作る

注:皿は実験ごとに再利用できるため、皿が損傷または破損している場合にのみ、この手順を繰り返してください。別の皿が解剖に使用されます。

1. メス(標準的な鋭利な予防措置付き)を使用して、シリコーンコーティングされたペトリ皿の1つにウェルを作成し、皿の上部から約5mmのシリコーンを十分に除去することによってアッセイ皿を調製する(これは〜20μLの入浴液滴に収まるはずである)。この前に、恒久的なマーカーを使用して皿の下の位置をマークし、井戸を作る場所を書き留めます。井戸は〜1cm離れており、細管の遠位端が収まるように直径は約〜4mmでなければなりません。各ウェルには1つの液体分泌尿細管が含まれるため、20ウェルを含むディッシュでは、実験ごとに最大20 MTを分析できます。
2. Minutien ピンを準備するには、0.1 mm のステンレス製ピンをテープの軸に垂直なラベリング テープに一列に並べて配置します。はさみを使用して、テープの長さに沿って切断し、ピンの等しい半分を作成します。各ウェルに半分のピンを使用します。
3. 鈍い一対の鉗子を使用して、各ハーフピンをシリコーンコーティングされたアッセイ皿に、各ウェルの横に挿入する。昆虫尿細管の長さに応じて、細管の遠位端が入浴生理食塩水に浸かり、近位端がピンを包むことができる距離にハーフピンを挿入します。このステップは、井戸を簡単に視覚化するために顕微鏡下で行うことができます。ピンは再利用できますが、ハーフピンが破損または紛失した場合は交換してください。(図5B)

3. ポリL-リジンコートSIETディッシュの作り方

注:このステップは、SIET測定中に臓器が皿の底に付着し、測定部位が各サンプルで同じままであることを保証するために重要です。これらの皿の調製は、実験の少なくとも2日前に行うべきである。各皿は、特定の治療を適用するときに一度だけ使用する必要があります。すべてのサンプルに従って、またはポリ-L-リジンコートが傷ついたり損傷したりした場合は廃棄してください。

1. すべてのサンプルについて、平らな面に35 mmのペトリ皿を置きます。各ディッシュの中央にある蓋とピペット70 μLのポリ-L-リジン(0.1 mg/mL)を取り外します。蓋を元に戻し、ポリ-L-リジンを邪魔されずに乾燥(〜48時間)させます。
2. 乾燥したら、乾燥したポリ-L-リジンコートを輪郭を描いた円で皿の底に印を付け、切除した臓器を解剖後に配置すべき場所をよりよく視覚化します。実験中の生理食塩水および処理液の量を最小限に抑えるために必要に応じて、ホットグルーガンを使用してポリ-L-リジンコーティングを囲み、電極が移動してバックグラウンド測定を行うのに十分なスペースを残します(接着された円の直径は約20〜25mmで十分です)。これらのコーティングされた皿は、RTで無期限に保管することができます(図5C)。

4. ラムゼイと収縮アッセイのディッシュを実験用に準備する

注:皿は再利用することができます(以前に使用された生理食塩水/処理物を除去するために適切な洗浄を提供する)ので、プレートが損傷または破損している場合にのみこのステップを繰り返します。別の皿が解剖に使用されます。この工程は実験当日に行われる。

1. 収縮アッセイ皿の場合、メス(標準的な鋭利な予防措置付き)を使用し、シリコーンコーティングされたペトリ皿の1つにウェルを作成してアッセイ皿を調製する。ウェルが三角形になるようにメスを傾けて、解剖した組織を縁に固定しやすくします。井戸は、最大250 μLを保持し、消化管全体に収まるのに十分な大きさにする必要があります(深く掘り下げすぎるのではなく、井戸を約0.5〜1 cmに広げてください)(図5D)。
2. ラムゼイプレートの場合は、ピペットを使用し、最大20 μLの溶液(18 μLの1X Aedes 生理食塩水:ステップ5.2で調製したシュナイダー培地、および2 μLのホルモン/薬物)のウェルを満たします。非刺激対照の場合、ウェルを20 μLの1X Aedes 生理食塩水:シュナイダー培地で満たします。すべてのウェルがいっぱいになったら、ウェルとミヌティエンピンが水没するまで、水和した鉱物油をアッセイ皿に注ぎます。20 μL のピペットチップを使用して、分泌された液滴を妨げる可能性のある気泡をはじいたり取り除いたりします。

5. ソリューションの準備

1. 2X Aedes aegypti 生理食塩水および10xグルコースを、 表1に記載されているように、Petzelおよび同僚から適合させて調製する³⁶。ストックソリューションは4°Cで保存する必要があります。 1X Aedes aegypti 生理食塩水(表1)の作業ストックを作り、4°Cで保存する。 実験当日は、使用前に作業在庫がRTに来るのを許してください。真菌または細菌の増殖の証拠がある場合は、新鮮なものを準備してください。
2. 入浴液滴を調製するために、 ヒトスジシマカ 生理食塩水(ステップ5.1から)をシュナイダー培地と1:1の比率で混合する。必要な量に応じて、小さなアリコートで準備してください。シュナイダーの培地を冷蔵庫に保管し、真菌や細菌の増殖の証拠がある場合は捨ててください。(このステップは実験当日に行う必要があります)。
3. SIETを用いたNa+フラックス測定のために、前述のように修飾^Ca2+フリーのヒトスジシマカ生理食塩水(表2)を調製する²⁶。

6. 蚊のMTと後腸の解剖

1. 成虫の蚊の解剖のために、小さなビーカーに蛹を集め、給餌のためにスクロース溶液を含む瓶に入れます。蚊の年齢を決定するには、孵化した蚊を隔離し、将来の解剖のために蚊の年齢と性別を記した別の瓶に入れます。
2. 解剖する蚊を_CO2 パッドに簡単に置き、反応しなくなるまで待ちます。細かい鉗子を使用して、蚊を脚または翼から拾い上げ、ステップ1で準備したシリコーンエラストマーコーティング解剖皿の上に置きます。蚊を片側(横側を上に)に置き、ミヌティエンピンで胸郭に突き刺して蚊を所定の位置に固定します。必要に応じて、解剖を容易にするために、蚊から翼と脚を取り除きます。
3. パスツールピペットを使用して、RTヒトスジシマカ生理食塩水を1滴加えて、蚊を生理食塩水に完全に浸します。解剖がすべて生理食塩水下にあることを確認してください(ヒトスジシマカの生理食塩水を作るための表1を参照)。
4. 解剖皿を実体顕微鏡下に置く。最後の腹部を細かい鉗子でつまみ、ゆっくりと蚊から引き離します。このステップは、顕微鏡下を同時に見ることによって促進される。MTと後腸に取り付けられた中腸は露出しているはずです(図6)。
5. Ramsayアッセイでは、中腸 - 後腸接合部から各細管を慎重に取り除き、臓器を損傷しないようにします。鋭利な微細な鉗子を使用して細管を個別に除去します - アッセイには損傷した細管を使用しないでください。(セットアップについては、ステップ 7 を参照してください。
6. SIETの場合、^Ca2+を含まない ヒトスジシマカ 生理食塩水で後腸を解剖する(ステップ5.3)。ポリ-L-リジン皿にも一定量の^Ca2+フリーの ヒトスジシマカ 生理食塩水が含まれていることを確認してください。キューティクルを直腸から慎重に取り除き、後腸(測定内容に応じて、他の付着した器官を取り除くことができます)をポリ-L-リジン皿に入れます。直腸パッド上皮に沿ってイオン輸送を測定する場合、少なくとも1つの直腸パッドの血リンパに対向する側を微小電極に接近可能に配置する(図7)。
   1. 鉗子を使って最も後端をつかみ、後腸を皿の底まで下げます(測定される構造を損なうことなく)。臓器がポリ-L-リジンコートに触れるとすぐに、それは付着します。この解剖されたサンプルは測定の準備ができています。(SIET のセットアップと測定については、ステップ 14 ~ 16 を参照してください。
7. 回腸収縮アッセイでは、郭清中に後腸が中腸に付着したままであることを確認します(図4D)。MTを慎重に取り外して、後腸の視界が妨げられないようにします。この器官は、ステップ4.1で説明したように調製された新しい皿に移される。(アッセイビデオを得るためのステップ17を参照されたい。

7. ラムゼイアッセイのセットアップ

1. 鉗子の先端を使用して、尿細管の近位(開いた)端を鉗子の上にドレープして慎重に持ち上げ(細管をつまままないでください)、アッセイ皿のウェルに移します。このステップは、微細なガラスプローブを使用して行うこともできます。
2. 細管が井戸に浸されたら、鉗子で細管の近位端を拾い上げ、入浴液滴から取り出し、端をピンに巻き付けます。チューブをピンに2回巻き付け、入浴液滴に残っている尿細管の長さを他のチューブと一致させます。この時点で、尿細管の遠位端は入浴液滴内にあり、近位端は入浴液滴から離れてピンに巻き付けられ、分泌された流体が開いた近位端からピンの先端に蓄積することを可能にする。
3. 尿細管がピンに巻き付けられた直後に、井戸(例えば、A、B、C)、時間(これは、流体が尿細管から分泌され始める開始時間となる)、および他の識別情報(例えば、ホルモン、遺伝子型など)を書き留める。
4. 各蚊には5つの細管があるため、残りの細管で手順7.1〜7.3を繰り返します。対照および実験的処置の場合、5つの尿細管を異なる処置内で分割する。アッセイ皿全体が充填されるまで、次の解剖を続ける。練習では、このテクニックは、細管を解剖し、それらを入浴生理食塩水に移し、ピンを包み込むのに通常2〜3分かかるため、各細管間の開始時間に2〜3分の差が生じるはずです。
   注:実験を開始する前に、選択した対物レンズの下にステージマイクロメータを使用して顕微鏡の眼マイクロメータを校正してください。分泌された液滴は、40倍〜50倍の総倍率で日常的に測定されます。
5. 割り当てられたインキュベーション時間の後、分泌された液滴を測定することができる。顕微鏡の眼マイクロメーターを用いて、分泌された液滴の直径を測定し、記録する。較正換算により測定した眼単位径に乗じて分泌液滴の直径(d)を算出する(表3)。分泌された液滴の体積は、V = ^πd3/6 の式を使用して計算します。
6. 分泌速度(nL ^min-1)を計算するには、流体分泌速度= V/分泌時間の式を使用し、ここでVはステップ7.5で計算された分泌液滴の体積であり、分泌時間は尿細管の潜伏期間を指す。

8. ISME のセットアップ

1. マイクロマニピュレータを実体顕微鏡の両側に配置して、ISMEステーションをセットアップします。銀線の塩素化は、塩化第二鉄の溶液に浸漬し、各銀線を各微小電極ホルダに通す(または、必要に応じてワイヤを同軸ケーブルにはんだ付けする)ことによって達成することができる。銀線が未塩化になるたびにこの手順を繰り返します。
2. 銀線をアンプに接続し、アンプをデータ集録システムに読み取ります。製造元の指示に従ってシステムをセットアップし、校正します。電気的干渉が増大する場合は、適切に接地されたファラデーケージを使用してください。

9. ISMEおよびSIET用の微小電極の準備

1. P-97 Flaming Brown ピペット プーラーを使用して、フィラメント化されていないホウケイ酸ガラス毛細血管 (外径 1.5 mm、内径 1.12 mm、長さ 100 mm) を先端 1 ~ 5 μm で約 5 ~ 6 本引っ張ります。これらはイオン選択性微小電極として用いられる。SIET微小電極の場合、得られる電極は、短いシャンクを特徴とする〜5μmの先端開口部を有するべきである。
2. フードにマイクロ電極をホットプレートの上に置きます(電極の先端を壊さないように慎重に設置します)。15cmのガラスシャーレの中にジクロロジメチルシランを加え、ホットプレート上の電極の上に反転させる。ジクロロジメチルシランを使用して、電極のすべての表面に疎水性コートを添加することによってイオン選択性電極をシラン化し、疎水性イオノフォア³⁷を保持することを可能にする。未使用のシラン処理された電極は数週間放置することができます。したがって、このステップは数週間ごとに、または新しく引き抜かれた電極に対して実行されます。
   注:ジクロロジメチルシラン(可燃性、腐食性、毒性)を取り扱うときは注意が必要です。安全な取り扱いについては、MSDSを参照してください。
   1. ホットプレートを350°Cに回し、所定の位置に75分間放置する。ジクロロジメチルシランの体積(μL)に対するマイクロ電極の数の1:2の比率を使用して、ガラスのペトリ皿上に添加する。したがって、10個の微小電極に対して、20μLのジクロロジメチルシランを加える。
3. 75分後、ホットプレートの電源を切ります。電極とホットプレートが冷却されたら、ガラスのシャーレを取り出し、電極(鉗子付き)を成形粘土の入った収納箱に移します。電極の先端が上を向いていることを確認し、損傷を防ぎます。
4. ISME用の参照電極を作るには、約4〜5本のフィラメントホウケイ酸ガラスキャピラリーチューブ(外径1mm、内径0.58mm、長さ100mm)を引っ張ります。これらの電極はシラン処理する必要はありません。同様の箱にラベルを貼って保管し、先端の損傷を避けます。
5. SIET参照電極は、標準的なガラス毛細血管(外径2mm、内径1.12mm、長さ102mm)から作られています。毛細血管は溶融した1M KCl + 3%寒天で満たされ、使用時まで1M KCl(完全に水没)を含む50mL遠沈管に保存する必要があります。気泡が形成され始めるまで、または寒天が壊れるまで、それらは繰り返し使用することができます。空域がある場合は、ガラスを廃棄し、新しいガラスを使用して回路が完全であることを確認します。

10. バックフィルシリンジの準備

注:この手順は、ISME用の電極をバックフィルするための先端の細かいシリンジを作成するために行われます。

1. 使い捨て針付きの1mLのスリップチップシリンジを使用してください。針を捨て、1mLマークになるまでシリンジを引き戻します。煙質の下で、ブンゼンバーナーをオンにし、シリンジのプラスチックチップが溶け始めるまで加熱します。古い鉗子のペアを使用して、溶けたシリンジの先端を慎重につまみ、先端を伸ばすために引き下ろします。
2. はさみを使用して、溶けた先端を所望の長さに切断し、直径を電極の内側に収まるように十分に小さくしておきます(図を参照)。シリンジが冷えた後、シリンジの圧力を水でテストして、閉塞がないことを確認します。必要なバックフィルソリューションごとに1つを作成し、それに応じてラベルを付けます(図8)。

11. ISMEおよびSIET用のイオン選択性および参照マイクロ電極の充填

注:微小電極は、それがまだ動作している限り、再利用することができます(各実験の前に較正)。ISMEの場合、このステップは、MTがラムゼイアッセイでインキュベートされている間に行うことができます。

1. Na⁺選択的微小電極を作成するには、ステップ10で作成した1mLシリンジを使用して、電極を100mM NaClで埋め戻します。バックフィル溶液が電極の先端まで充填されていることを確認します。気泡が現れたら、微小電極を軽くフリックするか、溶液を取り出して再充填します。これは、よりよく視覚化するために実体顕微鏡下で行う必要があります。
2. 実体顕微鏡下で、10 μLのピペットチップをNa⁺選択イオノフォア溶液に浸します。電極をピペットに垂直に並べ、手袋をはめた指を先端の底の上に置き、圧力を作り出し、イオノフォアの小さな滴を排出します。顕微鏡の高い対物レンズの下で見て、微小電極先端にイオノフォアの滴を注意深く触れ、先端を壊さないようにする。通常、マイクロ電極は、イオノフォア/バックフィル溶液の境界が平坦になるまで、150〜300μmの長さのイオノフォアカクテルカラムで前方に充填されます。
   警告: このイオノフォアは有毒です。安全な取り扱いについては MSDS を参照してください。
3. 小さなビーカーで、100mM NaClで半分いっぱいにし、ビーカーの上部にある内側にいくつかのモデリング粘土を置きます。Na⁺ イオノフォアを取り込んだ後、電極をビーカーの壁に傾けて先端を100mM NaCl以内に置き、使用準備が整うまでISMEをビーカーに入れたままにします。
4. ISME参照電極を作成するには、電極を500mM KClでバックフィルし、溶液が先端まで充填されるようにします(上記と同じプロトコルに従います)。KClをビーカーに保管してください。

12. ISME用の電極の校正

注:このステップは、分泌された流体の測定を行う直前(〜10〜15分前)に実行されます。較正は、傾きが一貫していることを確認するために、〜5〜6回の測定ごとに行う必要があります。

1. パラフィンオイルに沈んだときのイオノフォアの変位を避けるために、テトラヒドロフランに溶解した〜3.5%(w / v)ポリ塩化ビニルの溶液を使用して電極先端をコーティングする。
   警告: これは可燃性です。安全な取り扱いについては、MSDS を参照してください。
2. Na⁺ 電極を較正するには、インキュベートしたMTsとともにラムゼイ皿の端に、次のNaCl標準濃度の10μL液滴を置きます:200mM NaClおよび20mM + 180mM LiCl。標準液滴を〜2cm離して置き、上により高い濃度を置く。
3. 塩化銀線の上に参照電極とイオン選択電極の両方を挿入し、マイクロマニピュレータに取り付けられた電極ホルダーを使用してしっかりと固定します。マイクロマニピュレータを使用して両方の電極を200 mM NaCl液滴の方向に移動させ、電極先端が皿の底に触れないようにします。エレクトロメーターをオンにして録音を開始し、読み取り値を安定させます。
4. 読み取り値を記録し、次の規格(20 mM NaCl + 180 mM LiCl)に進みます。傾きを計算し、電極の読み取り値が安定しており、傾きが範囲内にある場合は、分泌された液滴測定に電極を使用するに進みます。読み取り値が不安定であったり、適切な記録や傾きを与えなかったり、平衡化に時間がかかる場合は、新しいイオン選択電極を準備するか、先端を横切って組織を走らせて参照電極の先端を壊します。Na⁺ の傾きは ~58 ~ 60 ^mV38 ですが、許容範囲は 50 ~ 60 mV です。

13. ISMEの記録と計算

1. 流体分泌速度の測定(ステップ7.7を参照)に続いて、マイクロマニピュレータを使用して、基準電極とイオン選択電極の両方を分泌液滴に注意深く移動させる。記録をオンにし、読み取り値を安定させて記録します。他の液滴についてもこの手順を繰り返します(約5~6回の測定ごとにキャリブレーション測定を繰り返します)。
2. カチオン濃度は、前述の式^22,38、[ion] = [C] x 10ΔV/mを用いて計算され、ここで、[C]はISMEの較正に使用された較正溶液のmmol ^L-1中の濃度であり、^ΔVは、分泌された流体液滴から記録された電圧と同一の較正溶液の電圧との間の電圧の変化であり、 mは2つの標準較正間の電圧差であり、これも傾きである。

14. SIET のセットアップ

メモ: SIET システムは以前に説明されています^27,39。バックグラウンドノイズを低減するために、光学顕微鏡とヘッドステージの周りにファラデーケージが設置されています。本稿で紹介する実験では、自動走査電極技術(ASET)ソフトウェア2.0で、イオン勾配が以下の微小電極の動きを完全に再確立するための4秒の待機期間、待機期間の後に電圧が0.5秒間記録され、100μmのエクスカーション距離、および記録ごとに3回の繰り返しを使用する。必要に応じて、ASET で特定の設定をユーザーが変更できます。

1. IPA-2イオン/ポラログラフィックアンプ、光学顕微鏡(ビデオカメラ付き)、およびこれらの実行中のASETおよびcellSensのそれぞれに接続されているコンピュータの電源を入れます。
2. ステップ9.1-9.3,9.5,10,および11.1-11.3で説明されている微小電極および参照電極を準備する。イオン選択微小電極は、100mM NaClバックフィルを有するNa⁺ イオノフォアを含み、参照電極(寒天ブリッジを有する)は常に3M KClで充填される。
3. 塩化銀(AgCl)ワイヤでできたホルダーにNa⁺選択マイクロ電極を置き、メスコネクタジャックに取り付けます。シリンジを使用して、参照電極ホルダーに新鮮な3M KClを充填します(実験日の前に作成し、RTで保存することができます)。
   メモ:実験に続いて、参照電極ホルダーを_ddH2Oで洗い流してください。
4. 3M KClに沈めたすべての参照電極を含むビーカーから1つの参照電極を取り出し、一方の端に1本の指を置き、寒天が脱落するのを防ぐためにガラスキャピラリーをこの指に向かって傾ける。片方の端をホルダーに慎重に置き、泡が形成されないようにします。気泡がある場合は、参照電極を取り外し、ホルダーにさらに3M KClを再充填して繰り返します。電極ホルダーをメスコネクタジャックに差し込みます。

15. SIET用の電極の校正

1. Na⁺ 測定には、150 mM NaCl および 15 mM NaCl + 135 mM LiCl 溶液を使用してください²⁴。2つの溶液間にはNa+濃度に10倍の差があり、生理食塩水中のNa⁺(20mM)レベルの範囲を網羅しているはずです(表2)。
2. 実験を行うときは、校正溶液をRTで50 mL遠沈管に保管し、アリコートをペトリ皿に保管します。このアリコートは一日の終わりに処分されます。原液に汚染の証拠がある場合は、処分して新鮮な溶液を作ります。
3. 校正するには、2つの校正溶液(ステップ15.1)を個々の35mmペトリ皿にアリコートし、これらを顕微鏡ステージに置きます。コンピュータモーションコントロールユニットで「無効」を選択してステッピングモータを制御する手動調整ノブを使用して、マイクロ電極チップがキャリブレーション溶液の内部に配置されていることを確認します。先端が折れる可能性があるため、先端を水没させすぎないでください。先端が折れた場合は、新しいイオン選択微小電極を用意し、再校正してください。
   1. アンプに接続されているコンピュータで、ASETソフトウェアを開きます。キャリブレーション設定を開きます。校正タイプに「ネルンスト勾配」を選択し、サンプルを 3 秒間設定して、校正溶液の濃度を入力します。たとえば、Na+測定の場合、溶液1に150mMと入力し、Na⁺選択マイクロ電極チップと参照電極をこの校正溶液内に配置します。アンプの電圧読み取り値は安定している必要があります。ソリューション1をクリックし、電圧(mV単位)が記録されるのを待ちます。次に、微小電極および参照電極を15mM NaCl+135mM LiCl溶液の内部に配置し、溶液2に15mMと入力し、溶液2をクリックして電圧測定値を得る。傾きは、これらの設定で計算されたこれら2つの電圧の差になります。キャリブレーション後、[OK]をクリックします。
   2. イオン濃度の10倍の変化に対するNa⁺選択的微小電極の傾きは、約59.0±1.624であるはずです。ネルンスト勾配がこの範囲から大きく外れている場合は、新しい微小電極を準備するか、新しい標準をアリコートします(汚染されている可能性があるため)。較正は、電圧安定性に応じて、2~3サンプルごとに必要になります。電圧が不安定になり、変動し始めた場合は、新しいイオン選択微小電極を用意してください。

16. SIET測定

メモ: コンピュータモーションコントロールユニットのモータースイッチは、ASET を介してコンピュータキーを使用して電極を操作する場合、または測定記録中(その時点でキーを [有効] に切り替える必要がある場合を除く)を除き、常に [無効] に切り替える必要があります。

1. 較正後、器官を解剖する(ステップ6.6参照)。解剖した試料の入ったポリL-リジン皿を顕微鏡ステージ上に置き、参照電極の先端を生理食塩水の内部に挿入する。イオン選択微小電極の先端を生理食塩水に沈め、先端を壊さないように注意する。
2. 手動調整ノブを使用して、光学顕微鏡の下を見ながら微小電極の位置を調整します。微小電極の垂直位置を調整して、その先端が器官または組織と同じ平面上にあるようにする。目的の位置になったら、モータースイッチを[ 有効]にします。この時点で、ステッピングモータはコンピュータソフトウェアを使用してのみ操作できます。
3. コンピュータの矢印キーを使用して、マイクロ電極を組織から3mm離れた位置に水平に移動し、バックグラウンド記録を測定します。 F2 キーを押してメモを挿入します。準備ができたら、録音を開始します ( F5 キーを押します)。バックグラウンド アクティビティの 5 つの測定値を取得します。各サンプルの平均バックグラウンド電圧アクティビティは、同じサンプルの組織に沿って測定された電圧勾配から差し引かれます。
4. 微小電極の先端を組織に近づけ、臓器を突き刺さないように注意してください。キーヒット感度を下げて、マイクロ電極チップを2 μm右に直接、組織に対して垂直に配置します。直腸パッドに沿った各部位で3つの記録を取得し、最もイオン活性の高い部位を特定する。最大の活性を示すサイト(「ホットスポット」サイト)でベースライン生理食塩水測定値を取得します。
5. モーターを無効に切り替え、適切な処置を皿に追加して、最終的な所望の用量を得る。適用後、新しいメモ(治療名と線量など)を作成し、モーターを [有効] に戻して 、F5を使用して電圧記録を行います。時間の経過に伴う変化を観察することが目標である場合は、引き続き特定の時間間隔で測定を行います。SIETを使用して、研究者の目的に応じて、特定のアプリケーションに対して複数のプロトコルを作成できます。
6. ASETソフトウェアが組織に沿った部位の電圧を記録し、組織から100μm離れたエクスカーション距離(図7)で電圧からこれを差し引くのを見てください。最初の記録は組織で撮影されるため、正の電圧差は、上皮(組織)の電圧が上皮から離れている(図7B)よりも高く、したがってカチオンが吸収されていることを示しています。負の電圧勾配は陽イオン分泌を示す。
7. 処理後(3mm離れた場所)にバックグラウンド記録を再度取得し、処理後のイオンフラックスを計算するときにこれらを使用します。「ベースライン」に1セットの背景記録を作成し、治療後に1セットを作成します。マイクロ電極がコンピュータキーで調整されていないとき、または電圧が記録されていないときはいつでも、モーターを無効に切り替えます。データをテキストファイルにエクスポートし、Excel を使用して開き、すべての計算を実行します。
8. 前述の式を使用してイオン流束を計算します^24,26。各処理の正味イオンフラックスは、ベースラインイオンフラックス測定値からの絶対変化として表すことができる。結果の有意性を検証するために、ビヒクルコントロール(すなわち、治療の代わりに生理食塩水のみを皿に加える)を使用することができる。ホルモン治療後のイオン輸送の変化は、この対照に応答した任意の変化に対して評価されるべきである。

17. 後腸収縮アッセイ

1. ステップ4.1で説明したディッシュ内のウェルの1つを、既知の容量の ヒトスジシマカ 生理食塩水で満たします(ステップ5.1)。解剖(ステップ6.7)に続いて、中腸に付着した解剖後腸を他の皿の井戸に注意深く移し、検査中の器官(回腸)をつまないように注意する。腸を井戸内の生理食塩水に浸し、ミヌティエンピンを中腸と直腸に入れます。そうすることによって、回腸は緊張下にあってはならないし、回腸前部の幽門弁を起点とする自発的な収縮が観察されるべきである。
2. ビデオカメラを実体顕微鏡に接続し、ビデオキャプチャソフトウェア(ルミネラのINFINITY CAPTUREなど)を使用してビデオを録画します。解剖した臓器を入れた皿を顕微鏡下に置き、2分間記録する。これが「ベースライン」条件になります。
3. ウェル内の体積を増加させたときの回腸運動性の変化を説明するために、既知の体積の1X Aedes 生理食塩水(ステップ5.1)をウェルに加える。申請後1分間待ってから、再度2分間録音します。これが「生理食塩水」の状態です。
4. 既知の量の処理を加える(ウェル内の所望の用量を得るために10倍のストック濃度から)。申請後1分間待ってから、再度2分間録音します。これが「治療」条件になります。
5. すべてのビデオを保存し、MP4に変換します。分析するには、2分間隔の収縮の数を数えます(幽門弁で開始し、回腸全体に広がる蠕動波として定義されます)。この数値を 2 分で割り、収縮率を求めます。収縮または緩和持続時間などの他のパラメータも評価することができる。生データの収集に続いて、各サンプルの「ベースライン」条件のデータに対して各パラメータを相対的に表現します。「生理食塩水」と「処理」の折り畳み変化をすべて「ベースライン」に対してプロットします。

結果

非刺激MTに対する_DH31の適用は、体液分泌速度の有意な増加をもたらし、ヒトスジシマカにおける利尿ホルモンとしての役割を確認した(図1A)。細管をAedaeCAPA-1で処理すると、_DH31刺激MTで分泌速度の低下が観察されます。図1Bは、分泌された液滴中のNa⁺濃度を測定するためにイオン選択電極を使用することを示し?...

ディスカッション

血液ミールを摂取するとき、ヘマトファガス昆虫はヘモリンパ中の過剰な溶質と水の課題に直面します²。これに対処するために、彼らはホルモン因子によって厳密に制御され、昆虫が食後の利尿を迅速に開始することを可能にする特殊な排泄システムを有する。Ramsayアッセイおよびイオン選択的微電極の使用により、単離された昆虫MTにおけるイオン濃度および輸送速度と?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringes	Fisher Scientific	14955456
35 mm Petri dishes	Corning Falcon (Fisher Scientific)	C351008
Borosillicate glass capillary filamented tubes (OD 1 mm, ID 0.58 mm, length 100 mm)	World Precision Instruments	1B100F-4	used for ISME reference electrodes
Borosillicate glass capillary filamented tubes (OD 2 mm, ID 1.12 mm, length 102 mm)	World Precision Instruments	1B200F-4	used for SIET reference electrodes
Borosillicate glass capillary unfilamented tubes (OD 1.5 mm, ID 1.12 mm, length 100 mm)	World Precision Instruments	TW150-4	used for ISME and SIET electrodes
CO2 pad	Diamed	GEN59-114
Dimethyltrimethylsilylamine solution	Sigma-Aldrich	41716
Faraday cage	Custom		Can be fabricated by local machine shop
Ferric chloride	Sigma-Aldrich	157740
Forceps (Dumont #5)	Fine Science Tools	91150-20
Glass Petri dish	Fisher Scientific	08-748A
Hydrated mineral oil	Fisher Scientific	8042-47-5	Specific brand is not important
INFINITY1-2CB video camera	Luminera	INFINITY1-2CB
Micromanipulators (left and right handed)	World Precision Instruments	MMJL and MMJR	Specific brand is not important so long as high quality manipulator
Mineral Oil, Light	Fisher Scientific	0121-4
Minutien pins (0.1 mm stainless steel)	Fine Science Tools	26002-10
Non-hardening modeling clay	Sargent Art		Specific brand is not important
Olympus light microscope (FOR SIET)	Olympus	customized system
Plastic Pasteur (transfer) pipette	Fisher Scientific	13-711-7M
Poly-L-lysine solution (0.1 mg/mL)	Sigma-Aldrich	A-005-M	84 kDa
Polyvinyl chloride (PVC)	Sigma-Aldrich	81395
Scalpel Blade	Fine Science Tools	10050-00
Scalpel Handle	Fine Science Tools	10053-09
Schneider's Drosophila medium	Sigma-Aldrich	S0146
SIET system	Applicable Electronics	customized system	Details available at: http://www.applicableelectronics.com/overview
Silver wire	World Precision Instruments	AGW1010
Sodium ionophore II cocktail A	Fluka	99357
Standard polystyrene Petri (culture) dishes	Fisherbrand	FB012921	Any size would work, but 60 mm dishes are good for both dissections and assay
Stereomicroscope with ocular micrometer	Nikon	SMZ800
Sutter P-97 Flaming Brown Pipette puller	Sutter Instruments	FGPN7
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Chemical Company	NC9285739
Tetrahydrofuran	Sigma-Aldrich	401757
VWR advanced hotplate stirrer - aluminum	VWR	9578	Specific brand is not important