Estudando a Atividade de Neuropeptídeos e Outros Reguladores do Sistema Excretório no Mosquito Adulto

Resumo

Este protocolo descreve metodologias por trás do ensaio ramsay, microeletrodos seletivos de íons, técnica de eletrodo seletivo de digitalização (SIET) e ensaios de contração in vitro, aplicados para estudar o sistema excretório de mosquitos adultos, composto pelos túbulos e traseiros malpighianos, para medir coletivamente as taxas de íons e secreção de fluidos, atividade contratil e transporte transepitelial.

Resumo

Estudos de fisiologia de insetos, particularmente nas espécies que são vetores de patógenos causando doenças em humanos e outros vertebrados, fornecem a base para desenvolver novas estratégias para o controle de pragas. Aqui, uma série de métodos são descritos que são rotineiramente utilizados para determinar os papéis funcionais de neuropeptídeos e outros fatores neuronais (ou seja, aminas biogênicas) no sistema excretório do mosquito, Aedes aegypti. Os túbulos malpighianos (TM), responsáveis pela formação primária da urina, podem continuar funcionando por horas quando removidos do mosquito, permitindo medidas de secreção de fluidos após tratamentos hormonais. Como tal, o ensaio ramsay é uma técnica útil para medir as taxas de secreção de MTs isolados. Microeletrodos seletivos de íons (ISME) podem ser usados sequencialmente para medir concentrações de íons (ou seja, Na⁺ e K⁺) no fluido secretado. Este ensaio permite a medição de vários MTs em um determinado momento, determinando os efeitos de vários hormônios e drogas. A Técnica de Eletrodo seletivo de digitalização usa ISME para medir a tensão representativa da atividade iônica na camada não írpara adjacente à superfície dos órgãos de transporte de íons para determinar o transporte transepiteno de íons em tempo real. Este método pode ser usado para entender o papel dos hormônios e outros reguladores sobre absorção de íons ou secreção através da epitélio. Os ensaios de contração de porca também são uma ferramenta útil para caracterizar neuropeptídeos mioativos, que podem aumentar ou reduzir a capacidade deste órgão de remover o excesso de fluido e resíduos. Coletivamente, esses métodos fornecem uma visão de como o sistema excretório é regulado em mosquitos adultos. Isso é importante porque a coordenação funcional dos órgãos excretórios é crucial para superar desafios como o estresse de dessecação após o término e antes de encontrar um hospedeiro vertebrado adequado para obter uma farinha de sangue.

Introdução

A manutenção dos níveis de sal e água nos insetos permite que eles tenham sucesso em muitos nichos ecológicos e ambientais, utilizando uma variedade de estratégias de ^{alimentação1}. A maioria dos insetos desenvolveu mecanismos para regular a composição de seu hemoglifo dentro de limites estreitos, a fim de suportar os diferentes desafios associados ao seu ambiente ^particular2. Os insetos terrestres são frequentemente confrontados com o desafio de conservar a água e o sistema excretório sofre anti-diurese para evitar a perda de água e alguns sais essenciais, evitando, portanto, a dessecação. Em contraste, a diurese ocorre quando o inseto se alimenta e é desafiado com excesso de água e potencialmente ^sais3,4. Por meio de seu sistema excretório especializado e altamente ativo, os insetos desenvolveram mecanismos regulatórios que atuam para combater seus desafios osmoregulatórios. Em mosquitos Aedes aegypti adultos, o sistema excretório é composto pelos túbulos malpighianos (TM) e hindgut, este último é composto pelo íleo anterior e reto ^posterior5. Os MTs são responsáveis pela geração de urina primária, geralmente rica em NaCl e/ou KCl. A urina primária é então modificada através de processos secretos e reabsortivos à medida que viaja rio abaixo do túbulo e entra no ^hindgut5. A excreta final pode ser hiper ou hipoosmótica para o hemolítico, dependendo das condições alimentares/ambientais, e é enriquecida em resíduos tóxicos e ^{nitrogenados2}.

Os MTs são ideais para estudar muitas características do fluido epitelial e do transporte de soluto, pois realizam uma grande variedade de funções de transporte e ^{excreção2,6}. Através da regulação ^hormonal2, os TM funcionam segregando íons e outros solutos do sangue para o lúmen ^léculo7, fornecendo um gradiente osmótico permitindo que a água seja transportada por aquaporinas8,9, que cria coletivamente a urina primária, antes de viajar em direção ao traseiro reabsorguente2. Assim, coletando o fluido secretado de MTs isolados, pode-se monitorar continuamente o transporte transepitelial de fluidos e íons. A medição da taxa de secreção e a composição da urina fornecem uma visão sobre os mecanismos responsáveis pelo íon transepiteliol e transporte de fluidos. Um método popular para estudar taxas de secreção de fluidos é o ensaio ramsay, que foi introduzido pela primeira vez por Ramsay em ¹⁹⁵³¹⁰. Neste método, a extremidade distal (fechada) do túbulo é tratada com um hormônio (ou outro composto/droga de teste), enquanto a extremidade proximal (aberta) é enrolada em torno de um pino em óleo de parafina saturada de água, que secreta a urina primária, acumulando-se como uma gota na ponta do pino. Os MTs isolados são capazes de sobreviver e funcionar por longos períodos (até 24 h) em condições in vitro otimizadas, o que os torna modelos adequados e eficientes para a medição da secreção de fluidos. Os insetos têm sistemas circulatórios abertos, assim os MTs são facilmente dissecados e removidos, pois geralmente flutuam livremente no hemolymph6. Além disso, com exceção dos pulgões — que não possuem ^MTs11 — o número de TM em uma determinada espécie de inseto pode variar consideravelmente de quatro a centenas (cinco em mosquitos Aedes) permitindo múltiplas medições de um inseto.

Os MTs em mosquitos Aedes, em comum com outros insetos endopterygote, são compostos por dois tipos de células que formam um simples epitélio2,12; grandes células principais, que facilitam o transporte ativo de cálas (ou seja, Na⁺ e K⁺) para o lúmen, e células estelares finas, que auxiliam na secreção transepiteliol ^{cl-secreção13}. Os MTs não são inervados2, e em vez disso são regulados por vários hormônios, incluindo fatores diuréticos e anti-diuréticos, permitindo o controle do transporte de íons (principalmente Na⁺, K⁺, e Cl^-) e água osmoticamente ^{obrigatória2}. Inúmeros estudos têm examinado a regulação hormonal dos Aedes MTs para entender o papel dos fatores endócrinos no transporte transepitelio14,15,16,17,18. Como mostrado nos resultados representativos, os protocolos aqui demonstram os efeitos de diferentes fatores hormonais em MTs isolados de mosquitos adultos A. aegypti, incluindo controle diurético e anti-diurético (Figura 1). O ensaio de Ramsay é usado para demonstrar como um hormônio anti-diurético, AedaeCAPA-1, inibe a secreção fluida de TM estimulado pelo hormônio diurético _{31 (DH31}) (Figura 1).

O tamanho menor dos insetos tem exigido o desenvolvimento de micro métodos para medir a atividade iônica e concentrações em amostras de fluidos, ou perto da superfície de tecidos isolados, como os MTs e intestino. Métodos variados foram implementados, incluindo o uso de radioisótopos de ^íons19, o que requer a coleta das gotas de fluido secretadas para medição de concentrações de ^íons20. Túbulos Aedes estimulados in vitro normalmente secretam ~0,5 nL/^min21, assim o manuseio de volumes tão pequenos pode representar um desafio e potencialmente introduzir erro após a transferência. Como resultado, microeletrodos seletivos de íons (ISMEs) têm sido amplamente utilizados para medir concentrações de íons em gotículas secretas de MTs in vitro. Neste método, um eletrodo de referência e ISME, preenchidos com a solução de enchimento e ionfora apropriadas, são posicionados na gotícula de urina secretada para determinar as concentrações de ^íon22. Adaptado de Donini e ^colegas23, este protocolo atual utiliza um ionophore Na⁺-seletivo para medir a atividade de íons em gotículas secretas de MTs estimulados em mosquitos Aedes adultos. Uma vez que os microeletrores seletivos medem a atividade de íons, esses dados podem ser expressos como concentrações de íons, seguindo a suposição de que as soluções de calibração e amostras experimentais compartilham o mesmo coeficiente de atividade de ^íon21 (Figura 1B,C).

A Técnica de Eletrodo Seletivo de Digitalização (SIET) também faz uso de ISMEs para medir gradientes de concentração de íons na camada não tumercada adjacente a órgãos, tecidos ou células que estão transportando íons. Os ISMEs medem gradientes de tensão que podem ser usados para calcular os gradientes de concentração de íons e direção e magnitude do fluxo de íons através do órgão, tecido ou ^célula20. Nesta técnica, o ISME é montado em um manipulador de três eixos controlado por motores micro-passo computadorizados para que sua posição 3D seja controlada até o nível de ^{micrômetro20}. As tensões são medidas em dois pontos dentro da camada não-rarizado usando um protocolo de amostragem programado e controlado por software de computador. Os dois pontos são tipicamente separados por uma distância de 20-100 μm com um ponto dentro de 5-10 μm da superfície do órgão, tecido ou célula e o segundo ponto a mais 20-100 μm de distância. A diferença de magnitude das tensões entre os dois pontos é calculada para obter um gradiente de tensão24,25,26, que é então usado para calcular o gradiente de concentração e, posteriormente, o fluxo líquido utilizando a Lei ^{de Fick24,27}. Este método é útil para avaliar o transporte de íons específicos em diferentes regiões do intestino e MTs de insetos, ou em momentos específicos após uma exposição de farinha de sangue ou tratamento. Por exemplo, o SIET pode ser usado para entender como processos absortivos e secretores no sistema excretório do mosquito são regulados por ^hormônios28, bem como diferentes comportamentos alimentares e condições de ^criação25. Trabalhos anteriores utilizando o SIET revelaram locais envolvidos no transporte de íons ao longo das papilas anais e reto de mosquitos larvais e ^adultos24,28. O protocolo atual, descrito anteriormente por Paluzzi e seus ^colegas26, mede o fluxo na⁺ através da epitélio retal pad do reto feminino adulto (Figura 2).

O segmento final do sistema excretório do mosquito requer movimento muscular coordenado para ajudar a misturar alimentos e segregar o ^{desperdício26}. Produtos não absorvíveis de digestão a partir do midgut, juntamente com a urina primária secretada pelos TM, são passados através da válvula pilênca e entregues ao ^hindgut2. Contrações espontâneas de hindguta começam na válvula pilórica e ocorrem em ondas peristálticas, que são transmitidas sobre o íleo através da contração coordenada de músculos circulares e longitudinais ao redor da superfície basal das células epiteliais26. Finalmente, os músculos dentro do reto ajudam a impulsionar e eliminar o desperdício através do canal anal. Embora a motilidade do inseto hindgut seja miogênica, exigindo ^Ca2+ extracelular para produzir contrações espontâneas, esses processos também podem ser regulados neuronalmente26,29,30. Essa regulação exógena pelo sistema nervoso é importante após a alimentação, pois o animal deve expulsar resíduos do intestino e restaurar o equilíbrio hemólquio31. Como resultado, a realização de bioensações in vitro para identificar neuropeptídeos miostimulatórios ou mioinhibitórios é útil para avaliar como os neuroquímicos influenciam a motilidade hindgut. O protocolo atual, realizado por Lajevardi e ^Paluzzi28, utiliza gravações de vídeo para examinar a motilidade ileal em resposta a neuropeptídeos (Figura 3). Da mesma forma, um transdutor de força ou conversor de impedância também pode ser usado para observar traços de contrações através de um software de aquisição de ^dados32,33. No entanto, o uso da tecnologia de vídeo nos permite avaliar visualmente o órgão e analisar melhor usando um subconjunto de parâmetros para identificar o papel dos hormônios na motilidade hindgut.

O uso dessas técnicas pode ajudar a caracterizar fatores que regulam e coordenam o transporte de fluidos e íons ao longo do sistema excretório, juntamente com a motilidade hindgut. É importante ressaltar que é suportada uma ligação funcional entre a resposta diurética pelos TM e a motilidade hindgut, pois hormônios diuréticos, como _DH31 e 5HT, caracterizados por sua capacidade de estimular a secreção de fluidos pelos TM, também foram encontrados para exibir ações miotrópicas ao longo do mosquito hindgut21,34,35 . Esses achados destacam a importância de uma coordenação rigorosa entre os TM e o hindgut durante eventos como diurese pós-prandial em insetos que requerem eliminação rápida de resíduos.

Aqui, são descritas a abordagem detalhada por trás da técnica de ensaio de Ramsay para medir a taxa de secreção de fluidos no mosquito A. aegypti e o uso de microeletrodos seletivos para determinar as concentrações na⁺ dentro do fluido secreto dos MTs, que quando combinado permite que as taxas de transporte de íons transepitelais sejam determinadas. Além disso, a Técnica de Eletrodo seletivo de digitalização e ensaios de contração de contração de porcas são descritos para medir o fluxo de íons e a motilidade, respectivamente, o que ajuda a elucidar a regulação hormonal do hindgut (Figura 4).

Protocolo

1. Fazendo pratos forrados de silicone

NOTA: Esta etapa deve ser feita antes dos experimentos. Esses pratos serão feitos para preparar o prato de ensaio para dissecções, e para experimentos de ensaio de contração.

1. Prepare o silicone usando um kit de elastômero de silicone seguindo as recomendações do fabricante. Misture os componentes líquidos de duas partes a uma razão de 10 a 1. Misture suavemente e completamente invertendo, mas certifique-se de minimizar a formação de bolhas.
2. Despeje o elastômero de silicone em pratos padrão de cultura de poliestireno descartável de 60 mm a uma profundidade normalmente entre 7-9 mm. Prepare quantos pratos necessários. Remova quaisquer bolhas de ar usando um pino fino sob um microscópio logo após derramar silicone em pratos. Coloque os pratos em uma câmara ou armário sem poeira à temperatura ambiente (RT) por pelo menos 48 h ou no forno a 50 °C por cerca de 4h para curar (endurecer) (Figura 5A).

2. Fazendo o prato de ensaio Ramsay

NOTA: O prato pode ser reutilizado de experimento para experimento, assim, repita esta etapa somente se o prato estiver danificado ou quebrar. Um prato separado é usado para dissecções.

1. Usando um bisturi (com precauções de afiadas padrão), crie poços em uma das placas de Petri revestidas de silicone para preparar a placa de ensaio, removendo o suficiente do silicone, cerca de ~5 mm, do topo da placa (isso deve caber ~20 μL de gotícula de banho). Antes disso, use um marcador permanente para marcar as posições sob o prato para observar onde fazer os poços. Os poços devem ter ~1 cm de distância, com um diâmetro de cerca de ~4 mm para permitir que a extremidade distal do túbulo se encaixe. Cada poço conterá um túbulo segregador de fluidos, assim um prato contendo 20 poços permitirá que até 20 MTs sejam analisados por experimento.
2. Para preparar os pinos Minutien, coloque os pinos de aço inoxidável de 0,1 mm em uma fileira em um pedaço de fita de rotulagem, perpendicular ao eixo da fita. Usando uma tesoura, corte ao longo do comprimento da fita, criando metades iguais dos pinos. Use meio pino para cada poço.
3. Usando um par de fórceps sem cortes, insira cada meio pino no prato de ensaio revestido de silicone, ao lado de cada poço. Dependendo do comprimento do túbulo do inseto, insira o meio pino a uma distância que permitirá que a extremidade distal do túbulo mergulhe no soro fisiológico e na extremidade proximal para enrolar ao redor do pino. Esta etapa pode ser feita sob um microscópio para visualizar poços facilmente. Os pinos podem ser reutilizados, no entanto, substituir o meio pino se danificado ou perdido. (Figura 5B)

3. Fazendo o prato SIET revestido de poli-L-lysine

NOTA: Esta etapa é importante para que o órgão adere à parte inferior do prato durante as medições do SIET, garantindo que o local de medição permaneça o mesmo para cada amostra. A preparação desses pratos deve ser feita pelo menos 2 dias antes dos experimentos. Cada prato só deve ser usado uma vez ao aplicar um tratamento específico. Descarte após cada amostra ou se o revestimento de poli-L-lysine estiver riscado ou danificado.

1. Para cada amostra, coloque uma placa de Petri de 35 mm em uma superfície nivelada. Remova as tampas e a pipeta 70 μL de poli-L-lysine (0,1 mg/mL) no centro de cada prato. Coloque as tampas de volta e deixe a poli-L-lysina seca (~48 h) intacta.
2. Uma vez seco, marque o fundo do prato com um círculo delineando a camada seca de poli-L-lysine para melhor visualizar onde o órgão excisado deve ser colocado após dissecções. Se necessário para minimizar os volumes de soluções salinas e de tratamento em experimentos, use uma pistola de cola quente para cercar o revestimento poli-L-lysine, deixando espaço suficiente para o eletrodo se mover e fazer medições de fundo (~20-25 mm de diâmetro do círculo colado é suficiente). Estes pratos revestidos podem ser armazenados indefinidamente na RT (Figura 5C).

4. Preparando os pratos de ensaio ramsay e contração para experimentos

NOTA: O prato pode ser reutilizado (desde que a lavagem adequada para remover o soro fisiológico/tratamentos usados anteriormente), portanto, só repita esta etapa se a placa estiver danificada ou quebrar. Um prato separado é usado para dissecções. Esta etapa é realizada no dia do experimento.

1. Para a placa de ensaio de contração, use um bisturi (com precauções de afiadas padrão), crie poços em uma das placas de Petri revestidas de silicone para preparar o prato de ensaio. Angueta o bisturi de uma forma que os poços se tornem em forma de triângulo para facilitar a fixação do tecido dissecado nas bordas. Os poços devem ser grandes o suficiente para aguentar até 250 μL e se encaixar em todo o canal alimentar (em vez de cavar muito fundo, tornar o poço mais largo para cerca de 0,5-1 cm) (Figura 5D).
2. Para placa de Ramsay, use uma pipeta e encha poços de até 20 μL de solução (18 μL de 1X Aedes soro fisiológico : o meio de Schneider preparado na etapa 5.2, e 2 μL de hormônio/droga). Para controles não estimulados, encha os poços com 20 μL de 1X Aedes salina:médio de Schneider. Uma vez que todos os poços estejam cheios, despeje óleo mineral hidratado no prato de ensaio até que os poços e pinos minutien estejam submersos. Use uma ponta de pipeta de 20 μL para estourar ou remover bolhas de ar que possam interferir com as gotículas secretas.

5. Preparar soluções

1. Prepare 2X Salina Aedes aegypti e glicose 10x, conforme descrito na Tabela 1, adaptado de Petzel e ^colegas36. As soluções de estoque devem ser armazenadas a 4 °C. Faça estoques de 1X salina Aedes aegypti (Tabela 1) e armazene a 4 °C. No dia do experimento, permita que as ações de trabalho cheguem ao RT antes do uso. Prepare-se fresco se houver alguma evidência de crescimento fúngico ou bacteriano.
2. Para preparar a gota de banho, misture o soro fisiológico Aedes (a partir da etapa 5.1) com o médio de Schneider, em uma proporção de 1:1. Prepare-se em pequenas alíquotas, dependendo do quanto é necessário. Mantenha o meio de Schneider na geladeira, descarte se houver alguma evidência de crescimento fúngico ou bacteriano. (Esta etapa deve ser feita no dia do experimento).
3. Para medições de fluxo Na⁺ usando o SIET, prepare um soro fisiológico Aedes modificado de ^Ca2+free (Tabela 2), como descrito ^{anteriormente26}.

6. MTs de mosquitos e dissecções de hindgut

1. Para dissecções de mosquitos adultos, colete pupa em um pequeno béquer e coloque em um frasco contendo uma solução de sacarose para alimentação. Para determinar a idade do mosquito, isole mosquitos eclodidos e coloque em um frasco diferente observando a idade e o sexo dos mosquitos para futuras dissecções.
2. Coloque brevemente os mosquitos para serem dissecados em uma almofada de _CO2 e espere até não responder. Usando fórceps finos, pegue o mosquito de sua perna ou asa e coloque em um prato de dissecação revestido de silicone, preparado na etapa 1. Coloque o mosquito de um lado (lateral para cima), e com um pino Minutien, empalideça no tórax para fixar o mosquito no lugar. Opcionalmente, remova asas e pernas dos mosquitos para facilitar a dissecção.
3. Usando uma pipeta Pasteur, adicione uma gota de soro fisiológico RT Aedes para imergir totalmente o mosquito em soro fisiológico. Certifique-se de que a dissecção está toda sob soro fisiológico (ver Tabela 1 para fazer salina do Aedes ).
4. Coloque o prato de dissecação sob um microscópio estereoscópico. Aperte o último segmento abdominal com fórceps finos e lentamente afaste-se do mosquito. Esta etapa é facilitada olhando simultaneamente sob o microscópio. O midgut, anexado com os MTs e o hindgut, deve ser exposto (Figura 6).
5. Para o ensaio ramsay, remova cuidadosamente cada túbulo da junção midgut-hindgut, certificando-se de não danificar os órgãos. Use fórceps finos afiados para remover os túbulos individualmente – não use túbulos danificados para o ensaio. (Veja o passo 7 para a configuração.)
6. Para o SIET, disseca o hindgut em salina Aedes livre de ^{Ca2 +}(passo 5.3). Certifique-se de que o prato de poli-L-lysine também tenha um volume fixo de soro fisiológico Aedes sem ^Ca2+. Remova cuidadosamente a cutícula do reto e coloque o hindgut (pode remover qualquer outro órgão anexado, dependendo do que está sendo medido) no prato de poli-L-lysine. Se medir o transporte de íon ao longo da epitélio da almofada retal, posicione o lado hemisfânfio de pelo menos uma almofada retal para ser acessível à microeletrídrica (Figura 7).
   1. Usando fórceps para pegar a extremidade mais posterior, leve o traseiro para baixo para o fundo do prato (sem danificar nenhuma estrutura que será medida). Assim que o órgão tocar o casaco de poli-L-lysine, ele vai aderir. Esta amostra dissecada está pronta para medições. (Consulte as etapas 14-16 para configuração e medições do SIET.)
7. Para o ensaio de contração de íleo, certifique-se de que o traseiro permaneça preso ao midgut durante a dissecção (Figura 4D). Remova cuidadosamente os MTs para ter uma visão sem obstáculos do hindgut. Este órgão será transferido para um novo prato preparado como descrito na etapa 4.1. (Veja o passo 17 para obter vídeos de ensaio.)

7. Configuração do ensaio Ramsay

1. Usando a ponta dos fórceps, levante cuidadosamente a extremidade proximal (aberta) do túbulo, arrastando-a sobre os fórceps (não aperte o túbulo) e transfira para um poço do prato de ensaio. Esta etapa também pode ser feita usando sondas de vidro fino.
2. Uma vez que o túbulo esteja imerso no poço, pegue a extremidade proximal do túbulo com as fórceps, remova-a da gota de banho e enrole a extremidade em torno do pino. Enrole o túbulo ao redor do pino duas vezes – e mantenha o comprimento do túbulo restante na gotícula de banho consistente com os outros túbulos. Neste ponto, a extremidade distal do túbulo deve estar na gota de banho, enquanto a extremidade proximal enrolada ao redor do pino longe da gota de banho permitindo que o fluido secretado se acumule na ponta do pino a partir da extremidade proximal aberta.
3. Imediatamente após o túbulo ser enrolado ao redor do pino, anote os poços (por exemplo, A, B, C), o tempo (que será o horário de início de quando o fluido começará a ser secretado do túbulo), e qualquer outra informação de identificação (por exemplo, hormônio, genótipo, etc.).
4. Cada mosquito tem cinco túbulos, repetindo passos 7,1-7,3 com o resto dos túbulos. Para tratamentos de controle e experimentais, divida os cinco túbulos dentro dos diferentes tratamentos. Continue com a próxima dissecação, até que todo o prato de ensaio esteja preenchido. Com a prática, essa técnica deve levar tipicamente de 2 a 3 minutos para dissecar os túbulos, transferi-los para o soro fisiológico de banho e enrolar ao redor do pino, criando assim uma diferença de 2 a 3 minutos no tempo de partida entre cada túbulo.
   NOTA: Antes de iniciar o experimento, calibrar o micrômetro ocular do microscópio com um micrômetro de estágio sob o objetivo selecionado. Gotículas secretas são rotineiramente medidas sob uma ampliação total de 40x-50x.
5. Após o tempo de incubação alocado, a gota secreta pode ser medida. Usando o micrômetro ocular do microscópio, meça e registe o diâmetro da gotícula secretada. Calcule o diâmetro (d) da gotícula secretada multiplicando o diâmetro da unidade ocular medido pela conversão de calibração (Tabela 3). Calcule o volume da gotícula secretada usando a equação, V = ^πd3/6.
6. Para calcular a taxa de secreção (nL ^min-1), use a equação, taxa de secreção de fluido = tempo de secreção v/secreção, onde V é o volume da gotícula secretada calculada na etapa 7.5, e o tempo de secreção refere-se ao período de incubação da banheira.

8. Configuração ISME

1. Coloque micromanípulos em ambos os lados do estereóscópio para configurar a estação ISME. A cloreto dos fios de prata pode ser alcançada imergindo em uma solução de cloreto férrico e rosqueiar cada fio de prata em cada um dos suportes de microeletroder (ou soldar os fios nos cabos coaxiais, se necessário). Repita este passo sempre que os fios de prata ficarem sem cloreto.
2. Conecte os fios de prata a um amplificador, que será lido a um sistema de aquisição de dados. Configure e calibrar o sistema de acordo com as instruções do fabricante. Em caso de aumento da interferência elétrica, use uma gaiola faraday adequadamente aterrada.

9. Preparando as microeletrês para ISME e SIET

1. Usando um puxador de pipeta marrom em chamas P-97, puxe ~5-6 capilares de vidro borossilicato não filtrados (diâmetro externo 1,5 mm, diâmetro interno 1,12 mm, comprimento 100 mm) com uma ponta de 1-5 μm. Estes serão usados como microeletrodo seletivos de íons. Para microeletrodos SIET, o eletrodo resultante deve ter uma abertura de ponta de ~5 μm, caracterizada por uma haste curta.
2. Em um capô, coloque os microeletrodos em uma placa de aquecimento (estabelecendo cuidadosamente para não quebrar as pontas dos eletrodos). Adicione dichlorodimethylsilano dentro de uma placa de vidro de 15 cm e inverta sobre os eletrodos na placa quente. Use dichlorodimethylsilane para silanizar os eletrodos seletivos de íons adicionando uma camada hidrofóbica a todas as superfícies do eletrodo, permitindo que ele retenha o ionofóbico ionofóbico37. Eletrodos silanizados nãousuados podem ser deixados por algumas semanas; portanto, esta etapa é realizada a cada poucas semanas, ou para eletrodos recém-puxados.
   NOTA: Tenha cuidado ao manusear dichlorodimethylsilano – inflamável, corrosivo e tóxico, consulte MSDS para um manuseio seguro.
   1. Gire a placa de 350 °C e deixe no lugar por 75 min. Use uma proporção de 1:2 de número de microeletrodos para volume (μL) de dichlorodimethylsilano para adicionar à placa de vidro Petri. Assim, para 10 microeletrodos, adicione 20 μL de dichlorodimilane.
3. Depois de 75 min, desligue a placa quente. Depois que os eletrodos e a placa quente esfriarem, remova a placa de vidro Petri e transfira os eletrodos (com fórceps) para uma caixa de armazenamento com argila de moldagem. Certifique-se de que a ponta do eletrodo está apontando para cima para evitar qualquer dano.
4. Para fazer os eletrodos de referência para ISME, puxe ~4-5 tubos capilares de vidro borosssilicato filamentado (diâmetro externo 1 mm, diâmetro interno 0,58 mm, comprimento 100 mm). Estes eletrodos não têm que ser silanizados. Etiquetar e armazenar em uma caixa semelhante, evitando qualquer dano à ponta.
5. Os eletrodos de referência SIET são feitos de capilares de vidro padrão (diâmetro externo 2 mm, diâmetro interno 1,12 mm, comprimento 102 mm). Os capilares são preenchidos com 1 M KCl derretido + 3% de ágar e devem ser armazenados em um tubo de centrífuga de 50 mL contendo 1 M KCl (totalmente submerso) até o uso. Eles podem ser usados repetidamente até que as bolhas comecem a se formar ou se o ágar quebrar. Se houver algum espaço de ar, descarte o vidro e use um novo para garantir que o circuito esteja completo.

10. Preparando as seringas de enchimento traseiro

NOTA: Este passo é feito para criar seringas finas para eletrodos de enchimento para ISME.

1. Use uma seringa de ponta de deslizamento de 1 mL com uma agulha descartável. Descarte a agulha e puxe a seringa para trás até a marca de 1 mL. Sob a fumehood, ligue o queimador Bunsen e aqueça a ponta plástica da seringa até que comece a derreter. Usando um par velho de fórceps, belisque cuidadosamente a ponta da seringa derretida e puxe para baixo para esticar a ponta.
2. Com a tesoura, corte a ponta derretida até o comprimento desejado, deixando o diâmetro pequeno o suficiente para caber dentro dos eletrodos (Veja diagrama). Depois que a seringa esfriar, teste a pressão da seringa com água para garantir que não haja bloqueio. Crie um para cada solução de enchimento necessária e rotule em conformidade (Figura 8).

11. Preenchendo o Ion-Selective and Reference Microelectrode para ISME e SIET

NOTA: O microeletrodo pode ser reutilizado desde que ainda esteja funcionando (calibrar antes de cada experimento). Para o ISME, este passo pode ser feito enquanto os MTs são incubados no ensaio ramsay.

1. Para fazer uma microeletrídua na⁺-seletiva, use a seringa de 1 mL criada na etapa 10 para fazer o eletrodo de enchimento com 100 mM NaCl. Certifique-se de que a solução de enchimento de enco tudo se encha até a ponta do eletrodo. Se aparecerem bolhas de ar, gire suavemente o microeletrodo ou remova a solução e reencha. Isso deve ser feito sob um microscópio estereoscópico para visualizar melhor.
2. Sob um microscópio estereoscópico, mergulhe uma ponta de pipeta de 10 μL na solução ionofófora na⁺-seletiva. Alinhando o eletrodo perpendicular à pipeta, coloque um dedo enluvado sobre a parte inferior da ponta para criar pressão e expulse uma pequena gota de ionóforo. Visualização sob alto objetivo de um microscópio, toque cuidadosamente a gota de ionophore para a ponta do microelerode, evitando quebrar a ponta. Normalmente, os microeletrodos são encaminhados com uma coluna de coquetel de ionóforo de comprimento entre 150-300 μm, até que a borda da solução ionófora/enchimento seja plana.
   ATENÇÃO: Este ionóforo é tóxico, consulte MSDS para um manuseio seguro.
3. Em um pequeno béquer, encha no meio do caminho com 100 mM NaCl, e coloque um pouco de argila modeladora no interior no topo do béquer. Depois que o na⁺ ionophore tiver sido tomado, coloque o eletrodo na parede do béquer, deixando a ponta sentar dentro do NaCl de 100 mM, e manter o ISME no béquer até que esteja pronto para usar.
4. Para fazer o eletrodo de referência ISME, encha um eletrodo com 500 mM KCl garantindo que a solução seja preenchida até a ponta (siga o mesmo protocolo que acima). Guarde o KCL em um béquer.

12. Calibrar eletrodos para ISME

NOTA: Esta etapa é realizada logo antes de tomar medidas do fluido secretado (~10-15 min antes). As calibrações devem ser feitas a cada ~5-6 medidas para garantir que a inclinação seja consistente.

1. Cubra as pontas do eletrodo usando uma solução de ~3,5% (w/v) cloreto de polivinil dissolvido em tetrahidrofurano, para evitar o deslocamento do ionóforo quando submerso em óleo de parafina.
   ATENÇÃO: Isto é inflamável, consulte MSDS para um manuseio seguro.
2. Para calibrar o eletrodo Na⁺ , coloque gotículas de 10 μL das seguintes concentrações padrão NaCl na borda do prato Ramsay com os MTs incubados: 200 mM NaCl e 20 mM + 180 mM LiCl. Coloque as gotículas padrão ~ 2 cm de distância, com maior concentração em cima.
3. Insira eletrodo de referência e eletrodo seletivo de íon sobre os fios de prata com cloreto e fixe-os com segurança usando suportes de eletrodos que estão ligados a micromanipuladores. Navegue pelos dois eletrodos em direção à gotícula NaCl de 200 mM usando os micromanipuladores, garantindo que as pontas do eletrodo não toquem na parte inferior do prato. Ligue o eletrometro para iniciar a gravação e deixe a leitura estabilizar.
4. Registo a leitura e continue para o próximo padrão (20 mM NaCl + 180 mM LiCl). Calcule a inclinação, e se a leitura do eletrodo estiver estável e a inclinação estiver dentro do alcance, proceda ao uso do eletrodo para as medições secretas de gotículas. Se a leitura estiver instável, não dando uma gravação ou inclinação adequada, ou demorando um pouco para equilibrar, prepare um novo eletrodo seletivo de íons ou quebre a ponta do eletrodo de referência, passando um tecido pela ponta. A inclinação para Na⁺ deve ser ~58-60 ^mV38, embora uma faixa aceitável seja de 50-60 mV.

13. Gravações e cálculos do ISME

1. Após as medições da taxa de secreção de fluidos (ver passo 7.7), mova cuidadosamente tanto o eletrodo de referência quanto o eletrodo seletivo de íons para a gotícula secretada usando os micromanípulos. Ligue a gravação e permita que a leitura estabilize e regisse o valor. Repita esta etapa para as outras gotículas (repita as medidas de calibração a cada ~5-6 medidas).
2. As concentrações de cátion são calculadas utilizando-se a equação descrita ^{anteriormente22,38}, [íon] = [C] x ^10ΔV/m, onde [C] é a concentração em mmol ^L-1 da solução de calibração usada para calibrar o ISME, ΔV é a mudança de tensão entre a tensão registrada a partir da gotícula de fluido secretado e a tensão da mesma solução de calibração, e m é a diferença de tensão entre as duas calibrações padrão, que também é a inclinação.

14. Configuração do SIET

NOTA: O sistema SIET foi descrito ^{anteriormente27,39}. Para reduzir o ruído de fundo, uma gaiola faraday é instalada ao redor do microscópio de luz e do headstage. Os experimentos apresentados neste artigo utilizam as seguintes configurações do software ASET (Automated Scanning Electrode Technique) 2.0: um período de espera de 4 segundos para permitir que os gradientes de íons se restabeleçam totalmente após os movimentos de microeletrodos, com a voltagem sendo registrada para 0,5 s após o período de espera, uma distância de excursão de 100 μm e três repetições para cada gravação. Certas configurações podem ser modificadas pelo usuário no ASET, conforme necessário.

1. Ligue o Amplificador IPA-2 Ion/Polarographic, o microscópio de luz (com uma câmera de vídeo anexada) e o computador(s) conectado a cada um desses ASET e cellSens em execução.
2. Prepare microeletrodos e eletrodos de referência descritos nas etapas 9.1-9.3, 9.5, 10 e 11.1-11.3. A microeletrísmo ion-seletiva conterá na⁺ ionóforo com enchimento de 100 mM NaCl e o eletrodo de referência (com as pontes de ágar) será sempre preenchido com 3 M KCl.
3. Coloque a microeleroda na⁺-seletiva no suporte consistindo de um fio de cloreto de prata (AgCl) e conecte-o na tomada do conector feminino. Usando uma seringa, encha o suporte de eletrodo de referência com 3 M KCl fresco (pode ser feito antes do dia do experimento e armazenado no RT).
   NOTA: Após os experimentos, lave o suporte de eletrodo de referência com _ddH2O.
4. Remova um eletrodo de referência do béquer contendo todos os eletrodos de referência submersos em 3 M KCl, colocando um dedo em uma extremidade e inclinando o capilar de vidro em direção a este dedo para evitar que o ágar caia. Coloque cuidadosamente uma extremidade no suporte, garantindo que não se forme bolhas. Se houver uma bolha, remova o eletrodo de referência, rechee o suporte com mais 3 M KCl e repita. Coloque o suporte de eletrodo na tomada do conector feminino.

15. Calibrar eletrodos para SIET

1. Para medições Na⁺ , use uma solução NaCl de 150 mM e 15 mM NaCl + 135 mM ^LiCl24. Deve haver uma diferença de 10 vezes nas concentrações na⁺ entre as duas soluções, abrangendo a faixa de níveis de Na⁺ (20 mM) no soro fisiológico (Tabela 2).
2. Armazene soluções de calibração em RT em um tubo de centrífugas de 50 mL e alíquota em uma placa de Petri ao conduzir o experimento. Esta alíquota é descartada no final do dia. Se houver alguma evidência de contaminação nas soluções de estoque, descarte e faça novas soluções.
3. Para calibrar, aliquot as duas soluções de calibração (passo 15.1) em pratos petri individuais de 35 mm, e coloque-as no estágio do microscópio. Usando os botões de ajuste manual que controlam os motores do estepe com "desativar" selecionados na unidade de controle de movimento do computador, certifique-se de que a ponta do microeletrodes seja colocada dentro da solução de calibração. Não submergir a ponta muito longe, pois ela pode quebrar. Se a ponta quebrar, prepare uma nova microeletríscula seletiva de íons e recalibrar.
   1. No computador conectado ao amplificador, abra o software ASET. Abra as configurações de calibração. Selecione Nernst Slope para o tipo de calibração, defina a amostra por 3 segundos e digite as concentrações das soluções de calibração. Por exemplo, para medições Na⁺ , digite 150 mM na solução 1, coloque a ponta de microeletroderda na⁺-seletiva e eletrodo de referência dentro desta solução de calibração. A leitura de tensão no amplificador deve ser estável. Clique na Solução 1, aguarde que a tensão (em mV) seja gravada. Em seguida, coloque o microeletrodo e o eletrodo de referência dentro da solução De 15 mM NaCl + 135 mM LiCl, insira 15 mM na solução 2 e clique na Solução 2 para obter a leitura de tensão. A inclinação será a diferença entre essas duas tensões, calculadas nessas configurações. Após a calibração, clique em OK.
   2. As encostas para microeletrodos na⁺seletivas para uma mudança de dez vezes na concentração de íons devem ficar em torno de 59,0 ± 1.624. Se a inclinação Nernst se desviar muito dessa faixa, prepare um novo microeletromes, ou aliquot novos padrões (como eles podem estar contaminados). A calibração é necessária antes de cada 2-3 amostras, dependendo da estabilidade da tensão. Se a tensão se tornar instável e começar a flutuar, prepare uma nova microeletrídroa ion-seletiva.

16. Medidas do SIET

NOTA: O interruptor do motor na unidade de controle de movimento do computador deve ser sempre alterado para desativar, exceto ao manipular o eletrodo usando teclas de computador através do ASET, ou durante gravações de medição (momento em que a chave deve ser comutada para Habilitar).

1. Após a calibração, disseca o órgão (ver passo 6.6). Coloque o prato de poli-L-lysine com a amostra dissecada no estágio do microscópio e insira a ponta do eletrodo de referência dentro do soro fisiológico. Submergir a ponta do íon seletivo microelerode no soro fisiológico tomando cuidado para não quebrar a ponta.
2. Use os botões de ajuste manual para ajustar a posição de microeletrídro enquanto olha sob o microscópio de luz. Ajuste a posição vertical do microeletrou de tal forma que sua ponta esteja no mesmo plano que o órgão ou tecido. Uma vez na posição desejada, gire o interruptor do motor para Habilitar. Neste ponto, os motores stepper só podem ser operados usando o software do computador.
3. Usando as teclas de seta do computador, mova o microeletrodo horizontalmente para uma posição de 3 mm de distância do tecido para medir gravações de fundo. Insira notas pressionando F2. Quando estiver pronto, comece a gravar (pressionando F5). Obtenha cinco medições de atividade de fundo. A atividade média de tensão de fundo para cada amostra será subtraída dos gradientes de tensão medidos ao longo do tecido para a mesma amostra.
4. Mova a ponta de microeletrodo para perto do tecido, tomando cuidado para não perfurar o órgão. Reduza a sensibilidade do keyhit para colocar a ponta de microelerode 2 μm diretamente para a direita, perpendicular ao tecido. Obtenha três gravações em cada local ao longo da almofada retal para identificar o local de maior atividade de íons. Obtenha medições salinas de base no local que exiba maior atividade (o local "hotspot").
5. Mude o motor para Desativar e adicione o tratamento adequado ao prato para obter a dose final desejada. Após a aplicação, crie uma nova nota (ou seja, nome do tratamento e dose), troque o motor de volta para Habilitar e faça gravações de tensão usando F5. Se o objetivo é observar as mudanças ao longo do tempo, continue a fazer medições em intervalos de tempo específicos. Vários protocolos podem ser criados para aplicações específicas usando o SIET, dependendo do objetivo do pesquisador.
6. Observe o software ASET registrar a tensão no local ao longo do tecido e subtrair isso da tensão a uma distância de excursão (Figura 7) de 100 μm de distância do tecido. Uma vez que o primeiro registro é feito no tecido, uma diferença positiva de tensão indica que a tensão é maior no epitélio (tecido) (Figura 7A) do que longe do epitélio (Figura 7B), e assim a cáção está sendo absorvida. Um gradiente de tensão negativa é indicativo de secreção de ceda.
7. Obtenha gravações de fundo novamente após o tratamento (3 mm de distância) e use-as no cálculo do fluxo de íons após o tratamento. Faça um conjunto de gravações de fundo em "linha de base" e um conjunto após o tratamento. Mude o motor para Desativar sempre que o microeletro não estiver sendo ajustado com as teclas do computador ou quando a tensão não estiver sendo registrada. Exporte os dados para um arquivo de texto e abra usando o Excel para realizar todos os cálculos.
8. Calcular fluxo de íons usando equações descritas ^{anteriormente24,26}. O fluxo de íons líquidos para cada tratamento pode ser expresso como uma mudança absoluta das medidas de fluxo de íons de base. Para verificar a significância dos resultados, um controle de veículo (ou seja, adicionando soro fisiológico sozinho no prato em vez de um tratamento) pode ser usado. Alterações no transporte de íons após o tratamento hormonal devem ser avaliadas em relação a quaisquer alterações em resposta a este controle.

17. Ensaios de contração de porção hindgut

1. Encha um dos poços do prato descrito na etapa 4.1 com um volume conhecido de soro fisiológico do Aedes (passo 5.1). Após a dissecação (etapa 6.7), transfira cuidadosamente o hindgut dissecado ligado ao midgut para o poço no outro prato, certificando-se de não beliscar o órgão que está sendo examinado (íleo). Submergir o intestino no soro fisiológico dentro do poço, e coloque pinos minutien no meio do degrau e no reto. Ao fazê-lo, o íleo não deve estar sob tensão, e contrações espontâneas, originárias da válvula pilórica no íleo anterior, devem ser observadas.
2. Conecte uma câmera de vídeo a um microscópio estereoscópico e grave vídeos usando um software de captura de vídeo (por exemplo, o INFINITY CAPTURE da Luminera). Coloque o prato contendo o órgão dissecado sob o microscópio e grave por 2 min. Esta será a condição "Linha de Base".
3. Adicione um volume conhecido de 1X Aedes salina (passo 5.1) ao poço para explicar quaisquer alterações na motilidade ileal após o aumento do volume dentro do poço. Aguarde 1 min após a aplicação, depois grave novamente por 2 minutos. Esta é a condição "salina".
4. Adicione um volume conhecido de tratamento (a partir de uma concentração de estoque de 10x para obter a dose desejada no poço). Aguarde 1 min após a aplicação, depois grave novamente por 2 minutos. Esta será a condição de "tratamento".
5. Salve todos os vídeos e converta-os em MP4. Para analisar, conte o número de contrações nos intervalos de 2 minutos (definido como uma onda peristáltica iniciando na válvula pilórica e estendendo-se por todo o íleo). Divida este número em 2 minutos para obter a taxa de contração. Outros parâmetros também podem ser avaliados, como contração ou duração de relaxamento. Após a coleta de dados brutos, expresse cada parâmetro relativo aos dados para condições de "linha de base" para cada amostra. Plote a troca de dobra para o "soro fisiológico" e "tratamento" tudo relativo à "linha de base".

Resultados

A aplicação de _DH31 contra MTs não estimulados resulta em um aumento significativo na taxa de secreção de fluidos, confirmando seu papel como hormônio diurético em mosquitos Aedes (Figura 1A). Quando os túbulos são tratados com AedaeCAPA-1, observa-se uma redução na taxa de secreção em MTs estimulados por _DH31. A Figura 1B demonstra o uso de eletrodos seletivos de íons para medir as concentrações na⁺

Discussão

Ao ingerir uma refeição de sangue, os insetos hematófagos enfrentam o desafio do excesso de solutos e água em seu hemolymph2. Para lidar com isso, eles possuem um sistema excretório especializado, que é fortemente controlado por fatores hormonais, permitindo que os insetos iniciem rapidamente a diurese pós-prandial. O ensaio ramsay e o uso de microeletrodos seletivos de íons permite a medição das taxas de secreção de fluidos, juntamente com concentrações de íons e taxas de transport...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringes	Fisher Scientific	14955456
35 mm Petri dishes	Corning Falcon (Fisher Scientific)	C351008
Borosillicate glass capillary filamented tubes (OD 1 mm, ID 0.58 mm, length 100 mm)	World Precision Instruments	1B100F-4	used for ISME reference electrodes
Borosillicate glass capillary filamented tubes (OD 2 mm, ID 1.12 mm, length 102 mm)	World Precision Instruments	1B200F-4	used for SIET reference electrodes
Borosillicate glass capillary unfilamented tubes (OD 1.5 mm, ID 1.12 mm, length 100 mm)	World Precision Instruments	TW150-4	used for ISME and SIET electrodes
CO2 pad	Diamed	GEN59-114
Dimethyltrimethylsilylamine solution	Sigma-Aldrich	41716
Faraday cage	Custom		Can be fabricated by local machine shop
Ferric chloride	Sigma-Aldrich	157740
Forceps (Dumont #5)	Fine Science Tools	91150-20
Glass Petri dish	Fisher Scientific	08-748A
Hydrated mineral oil	Fisher Scientific	8042-47-5	Specific brand is not important
INFINITY1-2CB video camera	Luminera	INFINITY1-2CB
Micromanipulators (left and right handed)	World Precision Instruments	MMJL and MMJR	Specific brand is not important so long as high quality manipulator
Mineral Oil, Light	Fisher Scientific	0121-4
Minutien pins (0.1 mm stainless steel)	Fine Science Tools	26002-10
Non-hardening modeling clay	Sargent Art		Specific brand is not important
Olympus light microscope (FOR SIET)	Olympus	customized system
Plastic Pasteur (transfer) pipette	Fisher Scientific	13-711-7M
Poly-L-lysine solution (0.1 mg/mL)	Sigma-Aldrich	A-005-M	84 kDa
Polyvinyl chloride (PVC)	Sigma-Aldrich	81395
Scalpel Blade	Fine Science Tools	10050-00
Scalpel Handle	Fine Science Tools	10053-09
Schneider's Drosophila medium	Sigma-Aldrich	S0146
SIET system	Applicable Electronics	customized system	Details available at: http://www.applicableelectronics.com/overview
Silver wire	World Precision Instruments	AGW1010
Sodium ionophore II cocktail A	Fluka	99357
Standard polystyrene Petri (culture) dishes	Fisherbrand	FB012921	Any size would work, but 60 mm dishes are good for both dissections and assay
Stereomicroscope with ocular micrometer	Nikon	SMZ800
Sutter P-97 Flaming Brown Pipette puller	Sutter Instruments	FGPN7
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Chemical Company	NC9285739
Tetrahydrofuran	Sigma-Aldrich	401757
VWR advanced hotplate stirrer - aluminum	VWR	9578	Specific brand is not important