Изучение активности нейропептидов и других регуляторов выделительной системы у взрослого комара

Резюме

В этом протоколе излагаются методологии, лежащие в основе анализа Рамсея, ионселективных микроэлектродов, сканирующей ионселективной электродной техники (SIET) и анализов сокращения in vitro, применяемых для изучения выделительной системы взрослых комаров, состоящей из мальпигиевых канальцев и задней кишки, для коллективного измерения скорости секреции ионов и жидкости, сократительной активности и транспорта трансэпителиальных ионов.

Аннотация

Исследования физиологии насекомых, особенно у тех видов, которые являются переносчиками патогенов, вызывающих заболевания у людей и других позвоночных, обеспечивают основу для разработки новых стратегий борьбы с вредителями. Здесь описан ряд методов, которые обычно используются для определения функциональной роли нейропептидов и других нейронных факторов (т. Е. Биогенных аминов) на выделительной системе комара Aedes aegypti. Мальпигиевы канальцы (МТ), ответственные за первичное образование мочи, могут продолжать функционировать в течение нескольких часов при удалении от комара, что позволяет измерять секрецию жидкости после гормональной обработки. Таким образом, анализ Рамзи является полезным методом для измерения скорости секреции из изолированных MTs. Ионселективные микроэлектроды (ISME) могут последовательно использоваться для измерения концентраций ионов (т. Е. Na⁺ и K⁺) в секретируемой жидкости. Этот анализ позволяет измерять несколько МТ в данный момент времени, определяя эффекты различных гормонов и лекарств. Метод сканирующих ионселективных электродов использует ISME для измерения напряжения, представляющего ионную активность в неперетечном слое, прилегающем к поверхности органов, транспортирующих ионы, для определения трансэпителиального переноса ионов в режиме, близком к реальному времени. Этот метод может быть использован для понимания роли гормонов и других регуляторов в поглощении или секреции ионов через эпителий. Анализы сокращения задних конечностей также являются полезным инструментом для характеристики миоактивных нейропептидов, которые могут усиливать или уменьшать способность этого органа удалять лишнюю жидкость и отходы. В совокупности эти методы дают представление о том, как выделительная система регулируется у взрослых комаров. Это важно, потому что функциональная координация выделительных органов имеет решающее значение для преодоления таких проблем, как стресс высыхания после эклозии и до поиска подходящего хозяина позвоночных для получения кровеносной муки.

Введение

Поддержание уровня соли и воды у насекомых позволяет им преуспеть во многих экологических и экологических нишах, используя различные стратегии ^{кормления1}. Большинство насекомых развили механизмы регулирования состава своей гемолимфы в узких пределах, чтобы противостоять различным проблемам, связанным с их конкретной ^{средой2}. Наземные насекомые часто сталкиваются с проблемой сохранения воды, и выделительная система подвергается антидиурезу, чтобы предотвратить потерю воды и некоторых важных солей, следовательно, избегая высыхания. Напротив, диурез возникает, когда насекомое питается и сталкивается с избытком воды и, возможно^{, солей3,4}. Благодаря своей специализированной и высокоактивной выделительной системе насекомые развили регуляторные механизмы, действующие для противодействия их проблемам осморегулирования. У взрослых комаров Aedes aegypti выделительная система состоит из мальпигиевых канальцев (MTs) и задней кишки, последняя из которых состоит из передней подвздошной кишки и задней прямой ^кишки5. МТ ответственны за генерацию первичной мочи, обычно богатой NaCl и / или KCl. Первичная моча затем модифицируется посредством секреторных и реабсорбционных процессов, когда она перемещается вниз по канальцу и попадает в заднюю ^кишку5. Конечные экскременты могут быть гипер- или гипоосмотическими по отношению к гемолимфе, в зависимости от условий кормления/окружающей среды, и обогащены токсичными и азотистыми ^{отходами2}.

МТ идеально подходят для изучения многих особенностей переноса эпителиальной жидкости и растворенного вещества, поскольку они выполняют большое разнообразие транспортных и выделительных ^{функций2,6}. Посредством гормональной регуляции2 МТ функционируют путем секреции ионов и других растворенных веществ из крови в просвет канальцев7, обеспечивая осмотический градиент, позволяющий воде транспортироваться аквапоринами8,9, которые в совокупности создают первичную мочу, прежде чем путешествовать к реабсорбционной задней кишке2. Таким образом, собирая секретируемую жидкость из изолированных МТ, можно непрерывно контролировать трансэпителиальный транспорт жидкости и ионов. Измерение скорости секреции и состава мочи дает представление о механизмах, ответственных за транспорт трансэпителиальных ионов и жидкости. Популярным методом изучения скорости секреции жидкости является анализ Рамзи, который был впервые представлен Рамзи в 195310 ^году. В этом методе дистальный (закрытый) конец канальца обрабатывают гормоном (или другим исследуемым соединением /препаратом), в то время как проксимальный (открытый) конец оборачивают вокруг штифта в насыщенном водой парафиновом масле, которое выделяет первичную мочу, накапливаясь в виде капли на кончике штифта. Изолированные МТ способны выживать и функционировать в течение длительных периодов времени (до 24 ч) в оптимизированных условиях in vitro, что делает их подходящими и эффективными моделями для измерения секреции жидкости. Насекомые имеют открытые кровеносные системы, поэтому МТ легко рассекаются и удаляются, поскольку они обычно свободно плавают в гемолимфе6. Кроме того, за исключением тли, в которой отсутствуют ^MTs11, количество МТ у данного вида насекомых может значительно варьироваться от четырех до сотен (пять у комаров Aedes), что позволяет проводить множественные измерения от одного насекомого.

МТ у комаров Aedes, как и другие эндоптериготные насекомые, состоят из двух типов клеток, образующих простой эпителий2,12; крупные основные клетки, которые облегчают активный транспорт катионов (т.е. Na⁺ и K⁺) в просвет, и тонкие звездчатые клетки, которые помогают в трансэпителиальной Cl-секреции13. МТ не иннервируются2, а вместо этого регулируются несколькими гормонами, включая как мочегонные, так и антидиуретические факторы, что позволяет контролировать транспорт ионов (в основном Na⁺, K⁺ и Cl^-) и осмотически обусловленную ^воду2. Многочисленные исследования изучали гормональную регуляцию Aedes MTs, чтобы понять роль эндокринных факторов на трансэпителиальный транспорт14,15,16,17,18. Как показано в репрезентативных результатах, протоколы в настоящем описании демонстрируют влияние различных гормональных факторов на изолированные МТ от взрослых самок комаров A. aegypti, включая как мочегонный, так и антидиуретический контроль (фиг.1). Анализ Рамзи используется для демонстрации того, как антидиуретический гормон, AedaeCAPA-1, ингибирует секрецию жидкости МТ, стимулируемую мочегонным гормоном 31 (_DH31) (рисунок 1).

Меньший размер насекомых потребовал разработки микрометодов для измерения ионной активности и концентраций в образцах жидкости или вблизи поверхности изолированных тканей, таких как МТ и кишечник. Были реализованы различные методы, в том числе использование радиоизотопов ^ионов19, что требует сбора выделяемых капель жидкости для измерения концентраций ^ионов20. Стимулированные канальцы Aedes in vitro обычно выделяют ~ 0,5 нл / ^мин21, поэтому обработка таких небольших объемов может представлять проблему и потенциально вносить ошибку при переносе. В результате ионселективные микроэлектроды (ISME) широко используются для измерения концентраций ионов в секретируемых каплях MTs in vitro. В этом способе опорный электрод и ISME, заполненные соответствующим раствором обратной засыпки и ионофором, помещают в выделяемую каплю мочи для определения концентрации ^ионов22. Адаптированный Донини и его ^{коллегами23}, этот текущий протокол использует Na⁺-селективный ионофор для измерения активности ионов в секретируемых каплях из стимулированных МТ у взрослых комаров Aedes. Поскольку ионселективные микроэлектроды измеряют ионную активность, эти данные могут быть выражены в виде концентраций ионов, исходя из предположения, что калибровочные растворы и экспериментальные образцы имеют одинаковый коэффициент активности ^ионов21 (рисунок 1B,C).

Метод сканирования ионселективных электродов (SIET) также использует ISME для измерения градиентов концентрации ионов в неперелившемся слое, прилегающем к органам, тканям или клеткам, которые транспортируют ионы. ISME измеряют градиенты напряжения, которые затем могут быть использованы для расчета градиентов концентрации ионов, а также направления и величины потока ионов через орган, ткань или ^{клетку20}. В этом методе ISME устанавливается на трехосевом манипуляторе, управляемом компьютеризированными микрошаговыми двигателями, так что его 3D-положение контролируется до уровня ^{микрометра20}. Напряжения измеряются в двух точках в пределах незатемленного слоя с использованием протокола выборки, запрограммированного и управляемого компьютерным программным обеспечением. Эти две точки обычно разделяются расстоянием 20-100 мкм с одной точкой в пределах 5-10 мкм от поверхности органа, ткани или клетки, а вторая точка находится на расстоянии 20-100 мкм. Разница в величине напряжений между двумя точками рассчитывается для получения градиента ^{напряжения24,25,26}, который затем используется для расчета градиента концентрации и впоследствии чистого потока с использованием закона Фика ^24,27. Этот метод полезен для оценки транспорта специфических ионов через различные области кишечника насекомых и МТ или в определенные моменты времени после воздействия кровяной муки или обработки. Например, SIET может быть использован для понимания того, как абсорбционные и секреторные процессы в выделительной системе комаров регулируются ^{гормонами28}, а также различные пищевые поведения и условия ^{выращивания25}. Предыдущая работа с использованием SIET выявила участки, участвующие в переносе ионов вдоль анальных сосочков и прямой кишки личинок и взрослых ^{комаров24,28}. Текущий протокол, описанный ранее Палуцци и его ^{коллегами26}, измеряет поток Na⁺ через эпителий прямой кишки прямой кишки прямой кишки взрослой женщины (рисунок 2).

Последний сегмент выделительной системы комаров требует скоординированного мышечного движения, чтобы помочь смешивать пищу и выделять ^{отходы26}. Нерассасывающиеся продукты пищеварения из средней кишки вместе с первичной мочой, выделяемой МТ, пропускаются через пилорический клапан и доставляются в заднюю кишку2. Спонтанные сокращения задней кишки начинаются у пилорического клапана и происходят в перистальтических волнах, которые передаются по подвздошной кишке через скоординированное сокращение круговых и продольных мышц, окружающих базальную поверхность эпителиальных ^{клеток26}. Наконец, мышцы в прямой кишке помогают продвигать и устранять отходы через анальный канал. Хотя подвижность задней кишки насекомых миогенна, требуя внеклеточного ^Ca2+ для производства спонтанных сокращений, эти процессы также могут регулироваться нейронно26,29,30. Эта экзогенная регуляция нервной системой важна после кормления, так как животное должно вытеснить отходы из кишечника и восстановить гемолимфный ^{баланс31}. В результате выполнение биоанализов in vitro для выявления миостимулирующих или миоингибирующих нейропептидов полезно для оценки того, как нейрохимические вещества влияют на моторику задней кишки. Текущий протокол, выполняемый Lajevardi и ^Paluzzi28, использует видеозаписи для изучения моторики подвздошной кишки в ответ на нейропептиды (рисунок 3). Аналогичным образом, преобразователь силы или преобразователь импеданса могут также использоваться для наблюдения следов сокращений с помощью программного обеспечения для сбора ^{данных32,33}. Однако использование видеотехнологий позволяет визуально оценить орган и дополнительно проанализировать с помощью подмножества параметров выявить роль гормонов на моторику задней кишки.

Использование этих методов может помочь охарактеризовать факторы, которые регулируют и координируют транспорт жидкости и ионов вдоль выделительной системы наряду с подвижностью задней кишки. Важно отметить, что функциональная связь между мочегонным ответом МТ и подвижностью задней кишки поддерживается, поскольку диуретические гормоны, такие как _DH31 и 5HT, характеризующиеся их способностью стимулировать секрецию жидкости МТ, также проявляют миотропные действия вдоль задней кишки комара21,34,35 . Эти результаты подчеркивают важность строгой координации между МТ и задней кишкой во время таких событий, как постпрандиальный диурез у насекомых, требующих быстрой ликвидации отходов.

Здесь описан подробный подход, лежащий в основе метода анализа Рамсея для измерения скорости секреции жидкости у комара , A. aegypti, и использование ионселективных микроэлектродов для определения концентраций Na⁺ в секретируемой жидкости МТ, что в сочетании позволяет определить скорость переноса трансэпителиальных ионов. Кроме того, описаны метод сканирования ионселективных электродов и анализы сокращения задней кишки для измерения потока ионов и подвижности соответственно, что помогает прояснить гормональную регуляцию задней кишки (рисунок 4).

протокол

1. Изготовление блюд с силиконовой подкладкой

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг должен быть выполнен до начала экспериментов. Эти блюда будут сделаны для приготовления пробирного блюда для вскрытия и для экспериментов по анализу сокращения.

1. Подготовьте силикон с помощью комплекта силиконовых эластомеров в соответствии с рекомендациями производителя. Смешайте двухкомпонентные жидкие компоненты в соотношении 10 к 1. Перемешайте осторожно и тщательно, инвертируя, но обязательно сведите к минимуму образование пузырьков.
2. Вылейте силиконовый эластомер в стандартную 60-миллиметровую одноразовую посуду для культивирования полистирола на глубину обычно от 7 до 9 мм. Приготовьте столько блюд, сколько потребуется. Удалите любые пузырьки воздуха с помощью тонкой булавки под микроскопом вскоре после наливания силикона в посуду. Поместите посуду в беспыльную камеру или шкаф комнатной температуры (RT) на не менее 48 ч или в духовку при 50 °C примерно на 4 ч для отверждения (затвердевания) (рисунок 5A).

2. Приготовление пробирного блюда Рамзай

ПРИМЕЧАНИЕ: Блюдо можно повторно использовать от эксперимента к эксперименту, таким образом, повторяйте этот шаг только в том случае, если блюдо повреждено или ломается. Для вскрытия используется отдельное блюдо.

1. Используя скальпель (со стандартными мерами предосторожности), создайте лунки в одной из покрытых силиконом чашек Петри для приготовления пробирной чашки, удалив достаточное количество силикона, около ~ 5 мм, с верхней части чашки (это должно соответствовать ~ 20 мкл капельки для купания). Перед этим используйте постоянный маркер, чтобы отметить позиции под блюдом, чтобы отметить, где сделать колодцы. Колодцы должны находиться на расстоянии ~ 1 см друг от друга, диаметром около ~ 4 мм, чтобы обеспечить дистальный конец канальца. Каждая скважина будет содержать один канальец, секретирующий жидкость, поэтому чашка, содержащая 20 скважин, позволит анализировать до 20 МТ за эксперимент.
2. Чтобы подготовить штифты Minutien, поместите штифты из нержавеющей стали диаметром 0,1 мм в ряд на кусок этикетировочной ленты, перпендикулярный оси ленты. С помощью ножниц обрежьте по длине ленту, создав равные половинки булавок. Используйте половину штифта для каждой лунки.
3. Используя тупую пару щипцов, вставьте каждую половину штифта в пробирную посуду с силиконовым покрытием рядом с каждым колодцем. В зависимости от длины канальца насекомого вставьте полуштырь на расстояние, которое позволит дистальному концу канальца погрузиться в физиологический раствор для купания, а проксимальный конец обернуть вокруг штифта. Этот шаг может быть выполнен под микроскопом, чтобы легко визуализировать скважины. Штифты могут быть использованы повторно, однако замените полуштырь в случае повреждения или потери. (Рисунок 5B)

3. Приготовление блюда SIET с поли-L-лизином

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг важен для того, чтобы орган прилип к дну чашки во время измерений SIET, гарантируя, что место измерения остается неизменным для каждого образца. Приготовление этих блюд должно быть сделано не менее чем за 2 дня до экспериментов. Каждое блюдо следует использовать только один раз при нанесении определенного лечения. Утилизируйте после каждого образца или если поли-L-лизиновое покрытие поцарапано или повреждено.

1. Для каждого образца поместите чашку Петри толщиной 35 мм на ровную поверхность. Снимите крышки и пипетку 70 мкл поли-L-лизина (0,1 мг/мл) в центре каждого блюда. Снова наденьте крышки и дайте поли-L-лизину высохнуть (~48 ч) без помех.
2. После высыхания пометьте дно блюда кругом, обозначающим высушенное поли-L-лизиновое покрытие, чтобы лучше визуализировать, куда следует поместить иссеченный орган после рассечения. При необходимости минимизации объемов физиологического раствора и лечебных растворов в экспериментах используйте горячий клеевой пистолет для окружения поли-L-лизинового покрытия, оставляя достаточно места для перемещения электрода и проведения фоновых измерений (~20–25 мм диаметра клееного круга достаточно). Эти покрытые оболочкой блюда могут храниться в RT неопределенное время (рисунок 5C).

4. Подготовка блюд ramsay и сокращения для экспериментов

ПРИМЕЧАНИЕ: Посуда может быть повторно использована (при условии соответствующей стирки для удаления ранее использованного физиологического раствора / обработки), таким образом, повторяйте этот шаг только в том случае, если пластина повреждена или ломается. Для вскрытия используется отдельное блюдо. Этот шаг выполняется в день эксперимента.

1. Для взятия теста на сокращение используйте скальпель (со стандартными мерами предосторожности), создайте лунки в одной из покрытых силиконом чашек Петри для приготовления пробирной посуды. Наклон скальпеля таким образом, чтобы колодцы стали треугольными, чтобы облегчить закрепление рассеченной ткани по краям. Колодцы должны быть достаточно большими, чтобы вместить до 250 мкл и вместить весь пищеварительный канал (вместо того, чтобы копать слишком глубоко, сделайте колодец шире примерно до 0,5-1 см) (рисунок 5D).
2. Для тарелки Рамзи используйте пипетку и заполните лунки до 20 мкл раствора (18 мкл 1X физиологического раствора Aedes : среда Шнайдера, приготовленная на стадии 5.2, и 2 мкл гормона/препарата). Для нестимулированного контроля заполняйте скважины 20 мкл 1X Aedes saline: среда Шнайдера. После того, как все скважины заполнены, налейте гидратированное минеральное масло в пробирную посуду до тех пор, пока колодцы и штифты Minutien не будут погружены. Используйте наконечник пипетки объемом 20 мкл, чтобы лопнуть или удалить пузырьки воздуха, которые могут мешать выделяемым каплям.

5. Подготовка решений

1. Готовят 2X Aedes aegypti физиологического раствора и 10x глюкозу, как описано в Таблице 1, адаптированной из Петцеля и его ^{коллег36}. Складские растворы следует хранить при температуре 4 °C. Сделайте рабочие запасы 1X Aedes aegypti saline (таблица 1) и храните при температуре 4 °C. В день эксперимента позвольте рабочим запасам поступить на RT перед использованием. Готовьте свежим, если есть какие-либо признаки грибкового или бактериального роста.
2. Чтобы приготовить каплю для купания, смешайте физиологический раствор Aedes (из шага 5.1) со средой Шнайдера в соотношении 1:1. Готовят небольшими аликвотами, в зависимости от того, сколько нужно. Храните среду Шнайдера в холодильнике, выбрасывайте, если есть какие-либо признаки грибкового или бактериального роста. (Этот шаг должен быть сделан в день эксперимента).
3. Для измерений потока Na⁺ с использованием SIET приготовьте модифицированный физиологический раствор Aedes без ^Ca2+ (таблица 2), как описано ^ранее26.

6. Москитные МТ и рассечения задней кишки

1. Для вскрытия взрослых комаров соберите куколку в небольшой стаканчик и поместите в банку, содержащую раствор сахарозы для кормления. Чтобы определить возраст комаров, изолируйте вылупившихся комаров и поместите в другую банку с указанием возраста и пола комаров для будущих вскрытий.
2. Кратко поместите комаров для рассечения на площадку _CO2 и подождите, пока они не перестанут реагировать. Используя тонкие щипцы, поднимите комара с его ноги или крыла и положите на силиконовую форму для рассечения, покрытую эластомером, приготовленную на этапе 1. Поместите комара на одну сторону (боковую сторону вверх) и с помощью булавки Minutien вонзите в грудную клетку, чтобы закрепить комара на месте. При желании удалите крылья и ноги с комаров для более легкого рассечения.
3. Используя пипетку Пастера, добавьте каплю физиологического раствора RT Aedes , чтобы полностью погрузить комара в физиологический раствор. Убедитесь, что рассечение полностью находится под физиологическим раствором (см. Таблицу 1 для приготовления физиологического раствора Aedes ).
4. Поместите рассекающую посуду под стереоскопический микроскоп. Ущипните последний брюшной сегмент мелкими щипцами и медленно оттяните от комара. Этот шаг облегчается одновременным взглядом под микроскоп. Среднюю кишку, прикрепленную к МТ и задней кишке, следует обнажить (рисунок 6).
5. Для анализа Рамзи осторожно удалите каждый каналец из соединения средней и задней кишки, убедившись, что органы не повреждены. Используйте острые тонкие щипцы для удаления канальцев по отдельности – не используйте поврежденные канальцы для анализа. (См. шаг 7 для настройки.)
6. Для SIET рассекните заднюю кишку в ^ca2+ свободном физрастве Aedes (шаг 5.3). Убедитесь, что блюдо из поли-L-лизина также имеет фиксированный объем физиологического раствора Aedes без ^Ca2+. Осторожно удалите кутикулу из прямой кишки и поместите заднюю кишку (может удалить любые другие прикрепленные органы, в зависимости от того, что измеряется) в поли-L-лизиновую посуду. При измерении переноса ионов вдоль эпителия ректальной прокладки расположите сторону гемолимфы, обращенную по меньшей мере, к одной ректальной прокладке, чтобы она была доступна микроэлектроду (рисунок 7).
   1. Используя щипцы, чтобы захватить самый задний конец, опустите заднюю кишку на дно тарелки (не повреждая никаких структур, которые будут измерены). Как только орган коснется поли-L-лизиновой оболочки, она прилипнет. Этот рассеченный образец готов к измерениям. (См. шаги 14–16 для настройки и измерений SIET.)
7. Для анализа сокращения подвздошной кишки убедитесь, что задняя кишка остается прикрепленной к средней кишке во время рассечения (рисунок 4D). Осторожно удалите МТ, чтобы иметь беспрепятственный обзор задней кишки. Этот орган будет перенесен в новое блюдо, приготовленное, как описано в шаге 4.1. (См. шаг 17 для получения видео анализа.)

7. Настройка анализа Рамзая

1. Используя кончик щипцов, осторожно приподнимите проксимальный (открытый) конец канальца, задрапировав его над щипцами (не защемляйте канальцу), и переложите в лунку пробирную посуду. Этот шаг также может быть выполнен с использованием тонких стеклянных зондов.
2. После того, как каналец погружен в колодец, поднимите проксимальный конец канальца щипцами, извлеките его из капельки для купания и оберните конец вокруг штифта. Оберните канальцу вокруг штифта дважды - и держите длину канальца, оставшуюся в капле для купания, в соответствии с другими канальцами. В этот момент дистальный конец канальца должен находиться в капле для купания, в то время как проксимальный конец обернут вокруг штифта вдали от капли для купания, позволяя выделяемой жидкости накапливаться на кончике штифта с открытого проксимального конца.
3. Сразу после того, как каналец обернут вокруг штифта, запишите скважины (например, A, B, C), время (которое будет временем начала, когда жидкость начнет выделяться из канальца) и любую другую идентифицирующую информацию (например, гормон, генотип и т. Д.).
4. Каждый комар имеет пять канальцев, таким образом повторяя шаги 7,1–7,3 с остальными канальцами. Для контрольной и экспериментальной обработки разделите пять канальцев в рамках различных обработок. Продолжайте с последующим вскрытием, пока не будет заполнена вся пробная тарелка. При практике эта техника должна занимать обычно 2-3 минуты, чтобы рассечь канальцы, перенести их в физиологический раствор для купания и обернуть вокруг штифта, тем самым создавая разницу во времени начала 2-3 минут между каждым канальцем.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом эксперимента откалибруйте глазной микрометр микроскопа с помощью ступенчатого микрометра под выбранным объективом. Секретируемые капли обычно измеряются при общем увеличении 40-50x.
5. По истечении отведенного времени инкубации секретируемую капельку можно измерить. С помощью глазного микрометра микроскопа измерьте и запишите диаметр секретируемой капли. Рассчитайте диаметр (d) секретируемой капли, умножив диаметр глазной единицы, измеренный калибровочным преобразованием (таблица 3). Рассчитайте объем секретируемой капли по уравнению V = ^πd3/6.
6. Для расчета скорости секреции (nL ^min-1) используют уравнение, скорость секреции жидкости = V/время секреции, где V - объем секретируемой капли, рассчитанный на шаге 7.5, а время секреции относится к инкубационному периоду канальца.

8. Настройка ISME

1. Поместите микроманипуляторы по обе стороны стереомикроскопа, чтобы настроить станцию ISME. Хлорирование серебряных проводов может быть достигнуто путем погружения в раствор хлорида железа и продевания каждой серебряной проволоки в каждый из микроэлектродных держателей (или припаивания проводов к коаксиальным кабелям, если это необходимо). Повторяйте этот шаг всякий раз, когда серебряные провода становятся нехлоридными.
2. Подключите серебряные провода к усилителю, который будет считывать данные в систему сбора данных. Настройте и откалибруйте систему в соответствии с инструкциями производителя. В случае повышенных электрических помех используйте правильно заземленную клетку Фарадея.

9. Подготовка микроэлектродов для ISME и SIET

1. Используя съемник пипетки P-97 Flaming Brown, вытяните ~5–6 нефиламентированных боросиликатных стеклянных капилляров (наружный диаметр 1,5 мм, внутренний диаметр 1,12 мм, длина 100 мм) с наконечником 1–5 мкм. Они будут использоваться в качестве ионселективных микроэлектродов. Для микроэлектродов SIET полученный электрод должен иметь отверстие наконечника ~5 мкм, характеризующееся коротким хвостовиком.
2. В вытяжку поместите микроэлектроды на конфорку (осторожно опустите, чтобы не сломать кончики электродов). Добавьте дихлордиметилсилан внутрь стеклянной чашки Петри 15 см и переверните электроды на конфорке. Используйте дихлордиметилсилан для силанизации ионоселективных электродов путем добавления гидрофобного покрытия ко всем поверхностям электрода, позволяя ему удерживать гидрофобный ионофор37. Неиспользованные силанизированные электроды можно оставить на несколько недель; поэтому этот этап выполняется каждые несколько недель или для вновь вытянутых электродов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Соблюдайте осторожность при обращении с дихлордиметилсиланом – легковоспламеняющимся, коррозионным и токсичным, см. MSDS для безопасного обращения.
   1. Поверните конфорку до 350 °C и оставьте на месте на 75 минут. Используйте соотношение 1:2 количества микроэлектродов к объему (мкл) дихлордиметилсилана, чтобы добавить на стеклянную чашку Петри. Таким образом, к 10 микроэлектродам добавляют 20 мкл дихлордиметилсилана.
3. Через 75 минут выключите конфорку. После того, как электроды и конфорка остынут, снимите стеклянную чашку Петри и переложите электроды (с щипцами) в ящик для хранения с формовочной глиной. Убедитесь, что наконечник электрода направлен вверх, чтобы предотвратить любые повреждения.
4. Чтобы сделать опорные электроды для ISME, потяните ~4–5 боросиликатных стеклянных капиллярных трубок с нитью (наружный диаметр 1 мм, внутренний диаметр 0,58 мм, длина 100 мм). Эти электроды не нуждаются в силанизации. Наклейте этикетку и храните в аналогичной коробке, избегая каких-либо повреждений наконечника.
5. Опорные электроды SIET изготавливаются из стандартных стеклянных капилляров (наружный диаметр 2 мм, внутренний диаметр 1,12 мм, длина 102 мм). Капилляры заполняют расплавленным 1 M KCl + 3% агаром и должны храниться в центрифужной трубке объемом 50 мл, содержащей 1 M KCl (полностью погруженной) до использования. Их можно использовать многократно, пока не начнут образовываться пузырьки или если агар сломается. Если есть какое-либо воздушное пространство, утилизируйте стекло и используйте новое, чтобы убедиться, что схема завершена.

10. Подготовка шприцев с засыпкой

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг выполняется для создания шприцев с тонким наконечником для засыпки электродов для ISME.

1. Используйте шприц со скользящим наконечником объемом 1 мл с одноразовой иглой. Отбросьте иглу и оттяните шприц до отметки 1 мл. Под дымом включите горелку Бунзена и нагрейте пластиковый наконечник шприца, пока он не начнет плавиться. Используя старую пару щипцов, осторожно зажмите расплавленный наконечник шприца и потяните вниз, чтобы растянуть наконечник.
2. С помощью ножниц разрежьте расплавленный наконечник до нужной длины, оставив диаметр достаточно маленьким, чтобы поместиться внутри электродов (см. схему). После того, как шприц остынет, проверьте давление шприца с водой, чтобы убедиться, что нет засора. Создайте по одному для каждого требуемого решения для засыпки и метьте соответствующим образом (рисунок 8).

11. Заполнение ионоселективного и эталонного микроэлектрода для ISME и SIET

ПРИМЕЧАНИЕ: Микроэлектрод может быть повторно использован до тех пор, пока он все еще работает (калибруйте перед каждым экспериментом). Для ISME этот шаг может быть выполнен, пока МТ инкубируются в анализе Рамзая.

1. Чтобы сделать Na⁺-селективный микроэлектрод, используйте шприц объемом 1 мл, созданный на шаге 10, для засыпки электрода 100 мМ NaCl. Убедитесь, что раствор для засыпки заполнен до конца электрода. При появлении пузырьков воздуха осторожно проведите микроэлектродом или извлеките раствор и снова заполните. Это должно быть сделано под стереоскопическим микроскопом, чтобы лучше визуализировать.
2. Под стереоскопическим микроскопом окуните наконечник пипетки объемом 10 мкл в раствор Na⁺-селективного ионофора. Выстроив электрод перпендикулярно пипетке, поместите палец в перчатке на дно кончика, чтобы создать давление и изгнать небольшую каплю ионофора. Рассматривая под высокой целью микроскопа, осторожно прикоснитесь каплей ионофора к кончику микроэлектрода, избегая поломки наконечника. Как правило, микроэлектроды заполняются колонной ионофорного коктейля длиной от 150 до 300 мкм, пока граница ионофора/раствора засыпки не станет плоской.
   ВНИМАНИЕ: Этот ионофор токсичен, см. MSDS для безопасного обращения.
3. В небольшом стакане заполните половину пути 100 мМ NaCl и поместите немного моделирующей глины внутрь в верхней части стакана. После того, как ионофор Na⁺ был взят, поместите наконечник электрода вниз на стенку стакана, позволив наконечнику находиться в пределах 100 мМ NaCl, и держите ISME в стакане до тех пор, пока он не будет готов к использованию.
4. Чтобы сделать электрод сравнения ISME, засыпьте электрод 500 мМ KCl, гарантируя, что раствор заполнен до конца (следуйте тому же протоколу, что и выше). Храните KCl в стакане.

12. Калибровочные электроды для ISME

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг выполняется непосредственно перед измерением секретируемой жидкости (~10–15 мин до этого). Калибровки должны выполняться каждые ~ 5-6 измерений, чтобы убедиться, что наклон является последовательным.

1. Обложите наконечники электродов раствором ~3,5% (мас./об.) поливинилхлорида, растворенного в тетрагидрофуране, чтобы избежать смещения ионофора при погружении в парафиновое масло.
   ВНИМАНИЕ: Это легковоспламеняющееся, см. MSDS для безопасного обращения.
2. Чтобы откалибровать электрод Na⁺ , поместите 10 мкл капель следующих стандартных концентраций NaCl на край чашки Ramsay с инкубированными MTs: 200 мМ NaCl и 20 мМ + 180 мМ LiCl. Поместите стандартные капли ~ 2 см друг от друга, с более высокой концентрацией сверху.
3. Вставьте как опорный электрод, так и ионселективный электрод поверх хлоридных серебряных проводов и надежно скрепите их с помощью держателей электродов, которые прикреплены к микроманипуляторам. Направляйте оба электрода к капле NaCl 200 мМ с помощью микроманипуляторов, следя за тем, чтобы наконечники электродов не касались дна тарелки. Включите электрометр, чтобы начать запись и стабилизировать показания.
4. Запишите показания и переходите к следующему стандарту (20 мМ NaCl + 180 мМ LiCl). Рассчитайте уклон, и если показания электрода стабильны, а наклон находится в пределах диапазона, приступайте к использованию электрода для измерения секретируемой капли. Если показания нестабильны, не дают надлежащей записи или наклона, или требуется некоторое время для уравновешивания, приготовьте либо новый ионоселективный электрод, либо сломайте самый кончик опорного электрода, проведя тканью по кончику. Уклон для Na⁺ должен составлять ~58–60 ^мВ38, хотя допустимый диапазон составляет 50–60 мВ.

13. Записи и расчеты ISME

1. После измерения скорости секреции жидкости (см. шаг 7.7) осторожно переместите как эталонный, так и ионселективный электрод в секретируемую каплю с помощью микроманипуляторов. Включите запись и позвольте показаниям стабилизироваться и записать значение. Повторите этот шаг для других капель (повторяйте калибровочные измерения каждые ~5–6 измерений).
2. Концентрации катионов рассчитываются с использованием уравнения, описанного ^{ранее22,38}, [ион] = [C] x ^10ΔV/м, где [C] - концентрация в ммоле ^L-1 калибровочного раствора, используемого для калибровки ISME, ΔV - изменение напряжения между напряжением, зарегистрированным от выделяемой капли жидкости, и напряжением того же калибровочного раствора, и m — разность напряжений между двумя стандартными калибровками, которая также является наклоном.

14. Настройка SIET

ПРИМЕЧАНИЕ: Система SIET была описана ^{ранее27,39}. Для уменьшения фонового шума вокруг светового микроскопа и головной сцены устанавливается клетка Фарадея. Эксперименты, представленные в этой статье, используют следующие настройки в программном обеспечении Automated Scanning Electrode Technique (ASET) 2.0: 4-секундный период ожидания, позволяющий ионным градиентам полностью восстановиться после микроэлектродных движений, при этом напряжение регистрируется в течение 0,5 с после периода ожидания, расстояние экскурсии 100 мкм и три повторения для каждой записи. Некоторые настройки могут быть изменены пользователем в ASET по мере необходимости.

1. Включите ионный/полярографический усилитель IPA-2, световой микроскоп (с подключенной видеокамерой) и компьютер(ы), подключенный к каждому из этих работающих ASET и cellSens.
2. Подготовьте микроэлектроды и эталонные электроды, описанные на этапах 9.1–9.3, 9.5, 10 и 11.1–11.3. Ионселективный микроэлектрод будет содержать ионофор Na⁺ с засыпкой NaCl 100 мМ, а электрод сравнения (с агаровыми мостиками) всегда будет заполнен 3 М ККл.
3. Поместите Na⁺-селективный микроэлектрод на держатель, состоящий из проволоки из хлорида серебра (AgCl), и прикрепите его к гнезду разъема. Используя шприц, заполните держатель электрода сравнения свежими 3 M KCl (могут быть изготовлены до дня эксперимента и храниться в RT).
   ПРИМЕЧАНИЕ: После экспериментов вымойте держатель электрода сравнения с помощью _ddH2O.
4. Извлеките один опорный электрод из стакана, содержащего все опорные электроды, погруженные в 3 M KCl, поместив один палец на один конец и наклонив стеклянный капилляр к этому пальцу, чтобы предотвратить выпадение агара. Осторожно поместите один конец в держатель, следя за тем, чтобы не образовались пузырьки. При наличии пузырька снимите опорный электрод, повторно заполните держатель более чем 3 МКл и повторите. Поместите держатель электрода в гнездо разъема.

15. Калибровочные электроды для SIET

1. Для измерений Na⁺ используйте растворы NaCl 150 мМ и NaCl 15 мМ + 135 мМ ^LiCl24. Между двумя растворами должна существовать 10-кратная разница в концентрациях Na⁺ , охватывающая диапазон уровней Na⁺ (20 мМ) в физиологическом растворе (таблица 2).
2. Храните калибровочные растворы на RT в 50 мл центрифужной трубки и аликвоте в чашке Петри при проведении эксперимента. Эта аликвота утилизируется в конце дня. Если есть какие-либо признаки загрязнения в запасе растворов, утилизируйте и сделайте свежие растворы.
3. Для калибровки распределите два калибровочных раствора (шаг 15.1) в отдельные 35-миллиметровые чашки Петри и поместите их на ступень микроскопа. Используя ручные ручки регулировки, которые управляют шаговыми двигателями с «отключением», выбранным на блоке управления движением компьютера, убедитесь, что микроэлектродный наконечник размещен внутри калибровочного раствора. Не погружайте наконечник слишком далеко, так как он может сломаться. Если наконечник ломается, подготовьте новый ионселективный микроэлектрод и повторно откалибруйте.
   1. На компьютере, подключенном к усилителю, откройте программное обеспечение ASET. Откройте Параметры калибровки. Выберите Nernst Slope для типа калибровки, установите образец на 3 секунды и введите концентрации калибровочных растворов. Например, для измерений Na⁺ введите 150 мМ в раствор 1, поместите Na⁺-селективный микроэлектродный наконечник и опорный электрод внутрь этого калибровочного раствора. Показания напряжения на усилителе должны быть стабильными. Нажмите на Решение 1, дождитесь записи напряжения (в мВ). Затем поместите микроэлектрод и электрод сравнения внутрь раствора NaCl + 135 мМ LiCl, введите 15 мМ в раствор 2 и нажмите раствор 2 для получения показаний напряжения. Наклон будет представлять собой разницу между этими двумя напряжениями, рассчитанную в этих настройках. После калибровки нажмите OK.
   2. Наклоны для Na⁺-селективных микроэлектродов для десятикратного изменения концентрации ионов должны составлять около 59,0 ± 1,624. Если склон Нернста сильно отклоняется от этого диапазона, подготовьте новый микроэлектрод или аликвот новые стандарты (так как они могут быть загрязнены). Калибровка требуется перед каждыми 2–3 образцами, в зависимости от стабильности напряжения. Если напряжение становится нестабильным и начинает колебаться, приготовьте новый ионоселективный микроэлектрод.

16. Измерения SIET

ПРИМЕЧАНИЕ: Переключатель двигателя на блоке управления движением компьютера всегда должен быть отключен, за исключением случаев, когда вы управляете электродом с помощью компьютерных клавиш через ASET или во время записи измерений (в этот момент клавиша должна быть переключена на Enable).

1. После калибровки рассекните орган (см. шаг 6.6). Поместите поли-L-лизиновую тарелку с рассеченным образцом на ступень микроскопа и вставьте наконечник эталонного электрода внутрь физиологического раствора. Погрузите наконечник ионселективного микроэлектрода в физиологический раствор, следя за тем, чтобы не сломать наконечник.
2. Используйте ручные регуляторы для регулировки положения микроэлектрода во время просмотра под световым микроскопом. Отрегулируйте вертикальное положение микроэлектрода таким образом, чтобы его кончик находился в той же плоскости, что и орган или ткань. Оказавшись в нужном положении, поверните переключатель двигателя в положение Enable. На данный момент шаговые двигатели могут управляться только с помощью компьютерного программного обеспечения.
3. С помощью клавиш со стрелками компьютера переместите микроэлектрод горизонтально в положение на расстоянии 3 мм от ткани для измерения фоновых записей. Вставка заметок нажатием клавиши F2. Когда все будет готово, начните запись (нажав клавишу F5). Получите пять измерений фоновой активности. Средняя активность фонового напряжения для каждого образца будет вычтена из градиентов напряжения, измеренных вдоль ткани для одного и того же образца.
4. Переместите кончик микроэлектрода назад близко к ткани, стараясь не проткнуть орган. Уменьшают чувствительность ключа, чтобы поместить наконечник микроэлектрода 2 мкм непосредственно вправо, перпендикулярно ткани. Получите три записи на каждом участке вдоль ректальной прокладки, чтобы определить место наибольшей активности ионов. Получение исходных измерений физиологического раствора на участке, демонстрирующем наибольшую активность (участок «горячей точки»).
5. Переключите двигатель на Отключить и добавьте соответствующее лечение в блюдо, чтобы получить окончательную желаемую дозу. После применения создайте новую заметку (т.е. название лечения и дозу), переключите двигатель обратно на Enable и запишите напряжение с помощью F5. Если цель состоит в том, чтобы наблюдать изменения с течением времени, продолжайте проводить измерения через определенные промежутки времени. Несколько протоколов могут быть созданы для конкретных приложений с использованием SIET, в зависимости от цели исследователя.
6. Наблюдайте, как программное обеспечение ASET записывает напряжение в месте вдоль ткани и вычитает его из напряжения на расстоянии экскурсии (рисунок 7) 100 мкм от ткани. Поскольку первая запись производится в ткани, положительная разница напряжений указывает на то, что напряжение в эпителии (ткани) выше (рисунок 7А), чем вдали от эпителия (рисунок 7B), и, таким образом, катион поглощается. Отрицательный градиент напряжения указывает на секрецию катионов.
7. Получите фоновые записи снова после обработки (на расстоянии 3 мм) и используйте их при расчете потока ионов после лечения. Сделайте один набор фоновых записей в «базовой линии» и один набор после обработки. Переключите двигатель на Отключить каждый раз, когда микроэлектрод не настраивается с помощью клавиш компьютера или когда напряжение не записывается. Экспортируйте данные в текстовый файл и откройте с помощью Excel для проведения всех вычислений.
8. Рассчитайте поток ионов с помощью уравнений, описанных ^{ранее24,26}. Чистый поток ионов для каждой обработки может быть выражен как абсолютное изменение по сравнению с исходными измерениями потока ионов. Для проверки значимости результатов может быть использован контроль транспортного средства (т.е. добавление только физиологического раствора в блюдо вместо обработки). Изменения в транспорте ионов после гормонального лечения должны быть оценены относительно любых изменений в ответ на этот контроль.

17. Анализы сокращения задних конечностей

1. Наполните одну из лунок в блюде, описанном на этапе 4.1, известным объемом физиологического раствора Aedes (шаг 5.1). После рассечения (шаг 6.7) осторожно перенесите рассеченную заднюю кишку, прикрепленную к средней кишке, в колодец в другом блюде, следя за тем, чтобы не защемить исследуемый орган (подвздошную кишку). Погрузите кишечник в физиологический раствор внутри колодца и поместите штифты Minutien в среднюю кишку и прямую кишку. При этом подвздошная кишка не должна находиться под напряжением, и должны наблюдаться самопроизвольные сокращения, возникающие у пилорического клапана в передней подвздошной кишке.
2. Подключите видеокамеру к стереоскопическому микроскопу и записывайте видео с помощью программного обеспечения для захвата видео (например, INFINITY CAPTURE от Luminera). Поместите блюдо, содержащее рассеченный орган, под микроскоп и записывайте в течение 2 мин. Это будет условие «Базовый уровень».
3. Добавьте известный объем физиологического раствора 1X Aedes (шаг 5.1) в скважину, чтобы учесть любые изменения подвижности подвздошной кости при увеличении объема в скважине. Подождите 1 минуту после нанесения, затем снова запишите в течение 2 минут. Это «соленое» состояние.
4. Добавьте известный объем обработки (из 10-кратной концентрации запаса для получения нужной дозы в лунке). Подождите 1 минуту после нанесения, затем снова запишите в течение 2 минут. Это будет условие «лечения».
5. Сохраните все видео и конвертируйте их в MP4. Для анализа подсчитывают количество сокращений в интервалах 2 мин (определяемые как перистальтическая волна, инициирующая в пилорическом клапане и распространяющаяся по всей подвздошной кишке). Разделите это число на 2 мин, чтобы получить скорость сжатия. Также могут быть оценены другие параметры, такие как продолжительность сокращения или расслабления. После сбора необработанных данных выразите каждый параметр относительно данных для «базовых» условий для каждой выборки. График смены складок для «физиологического раствора» и «обработки» относительно «базового уровня».

Результаты

Применение _DH31 против нестимулированных МТ приводит к значительному увеличению скорости секреции жидкости, подтверждая ее роль в качестве мочегонного гормона у комаров Aedes (рисунок 1A). При обработке канальцев AedaeCAPA-1 наблюдается снижение скорости секреци...

Обсуждение

При проглатывании кровяной муки гематофагусные насекомые сталкиваются с проблемой избытка растворенных веществ и воды в своей гемолимфе2. Чтобы справиться с этим, они имеют специализированную выделительную систему, которая жестко контролируется гормональными факторами...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringes	Fisher Scientific	14955456
35 mm Petri dishes	Corning Falcon (Fisher Scientific)	C351008
Borosillicate glass capillary filamented tubes (OD 1 mm, ID 0.58 mm, length 100 mm)	World Precision Instruments	1B100F-4	used for ISME reference electrodes
Borosillicate glass capillary filamented tubes (OD 2 mm, ID 1.12 mm, length 102 mm)	World Precision Instruments	1B200F-4	used for SIET reference electrodes
Borosillicate glass capillary unfilamented tubes (OD 1.5 mm, ID 1.12 mm, length 100 mm)	World Precision Instruments	TW150-4	used for ISME and SIET electrodes
CO2 pad	Diamed	GEN59-114
Dimethyltrimethylsilylamine solution	Sigma-Aldrich	41716
Faraday cage	Custom		Can be fabricated by local machine shop
Ferric chloride	Sigma-Aldrich	157740
Forceps (Dumont #5)	Fine Science Tools	91150-20
Glass Petri dish	Fisher Scientific	08-748A
Hydrated mineral oil	Fisher Scientific	8042-47-5	Specific brand is not important
INFINITY1-2CB video camera	Luminera	INFINITY1-2CB
Micromanipulators (left and right handed)	World Precision Instruments	MMJL and MMJR	Specific brand is not important so long as high quality manipulator
Mineral Oil, Light	Fisher Scientific	0121-4
Minutien pins (0.1 mm stainless steel)	Fine Science Tools	26002-10
Non-hardening modeling clay	Sargent Art		Specific brand is not important
Olympus light microscope (FOR SIET)	Olympus	customized system
Plastic Pasteur (transfer) pipette	Fisher Scientific	13-711-7M
Poly-L-lysine solution (0.1 mg/mL)	Sigma-Aldrich	A-005-M	84 kDa
Polyvinyl chloride (PVC)	Sigma-Aldrich	81395
Scalpel Blade	Fine Science Tools	10050-00
Scalpel Handle	Fine Science Tools	10053-09
Schneider's Drosophila medium	Sigma-Aldrich	S0146
SIET system	Applicable Electronics	customized system	Details available at: http://www.applicableelectronics.com/overview
Silver wire	World Precision Instruments	AGW1010
Sodium ionophore II cocktail A	Fluka	99357
Standard polystyrene Petri (culture) dishes	Fisherbrand	FB012921	Any size would work, but 60 mm dishes are good for both dissections and assay
Stereomicroscope with ocular micrometer	Nikon	SMZ800
Sutter P-97 Flaming Brown Pipette puller	Sutter Instruments	FGPN7
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Chemical Company	NC9285739
Tetrahydrofuran	Sigma-Aldrich	401757
VWR advanced hotplate stirrer - aluminum	VWR	9578	Specific brand is not important