系绳双层脂膜，以监测金纳米粒子和脂膜之间的热传递

摘要

这项工作概述了一项协议，以实现从激光辐照的金纳米粒子到tBLM的热传递的动态、非侵入性监测。该系统结合阻抗光谱，用于实时测量 TBLM 的传导变化，并配有水平聚焦激光束，驱动金纳米粒子照明，用于热生产。

摘要

在这里，我们报告了一项协议，使用用金电极组装的系绳双层脂质膜（tBLMs）进行电化学，调查辐照金纳米粒子（GNPs）和双层脂质膜之间的热传递。辐照改性GNP，如链球菌素结合的GNP，嵌入含有目标分子（如生物素）的tBLM中。通过使用这种方法，辐照GNP和具有相关实体的双层脂膜之间的传热过程由水平聚焦激光束进行介导。热预测计算模型用于确认 tBLM 中的电化学诱导导电导变化。在所使用的特定条件下，检测热脉冲需要金纳米粒子与膜表面的特定附着，而未绑定的金纳米粒子则无法引起可测量的反应。该技术作为强大的检测生物传感器，可直接用于设计和开发热疗法策略，从而优化激光参数、颗粒大小、粒子涂层和成分。

引言

辐照金纳米材料的高温性能为感染和肿瘤提供了一类新的微创、选择性、有针对性的^{治疗方法。}可以用激光加热的纳米粒子被用来选择性地摧毁患病细胞，并为选择性^{药物输送提供手段。}加热质子纳米粒子光热化现象的后果是对细胞膜的损害。流体脂质双层膜被认为是接受此类治疗的细胞特别脆弱的部位，因为内膜蛋白的变性以及膜损伤也可能导致细胞死亡^4，因为许多蛋白质在那里维持细胞膜的离子潜在梯度。虽然确定和监测纳米级传热的能力对研究和应用辐照GNP^{1、5、6、7、}评估和理解GNP与生物膜之间的分子相互作用以及嵌入式GNP在生物组织中的激光诱发加热现象的直接后果至关重要， 尚未完全阐明^8。因此，彻底了解辐照GNP的体温过高过程仍然是一个挑战。因此，开发一个模拟细胞自然环境的纳米材料电极接口，可以提供一种手段，对生物系统中辐照金纳米粒子的传热特性进行深入研究。

原生细胞膜的复杂性是理解细胞中辐照GNP相互作用的重大挑战之一。已开发出各种人造膜平台，提供接近简单的生物模仿版本的天然脂膜结构和功能，包括，但不限于，黑色脂膜^9，支持平面双层膜^10，混合双层膜^11，聚合物缓冲脂质双层膜¹²和系绳双层脂膜^13。每个人造脂膜模型在模仿天然脂膜^方面具有明显的优点和局限性。

本研究利用tBLM模型，将脂质膜涂层电极作为评估金纳米粒子和脂膜相互作用的传感器。基于tBLM的生物传感器检测方案提供了固有的稳定性和灵敏度¹³作为系绳膜可以自我修复，不像其他系统（如膜形成的补丁夹或脂质体），其中只有少量的膜损伤导致其崩溃15，16，17，18。此外，由于 tBLM 的尺寸为 mm^2，因此背景阻抗的幅度比贴片夹式记录技术低，从而能够记录由于纳米粒子相互作用而导致的基底膜离子通量的变化。因此，本协议可以对比受约束的GNP对膜传导的变化，这些GNP是由其功耗低至135 nW/μm²的激光激发的。

此处介绍的系统为确定设计和开发热疗法所需的精确激光参数、粒子大小、粒子涂层和成分提供了一种敏感且可重复的方法。这对改进新兴的光热疗法至关重要，并为生物系统内的详细传热机制提供了有价值的信息。提交的协议是基于先前公布的工作^19。协议大纲如下:第一部分定义 tBLM 形成:第二部分概述了如何构建设置和对齐激发激光源:最后一部分说明了如何从电阻抗光谱数据中提取信息。

研究方案

1. tBLM 电极制备

1. 准备第一层单层涂层
   1. 浸入一个新鲜溅出的金色图案电极显微镜滑动在乙烷溶液中，该溶液由 3 mM 1:9 比例的苯二甲醚- 四乙二醇-OH"垫片"分子（苯二甲醚由四个氧乙二醇垫片组成， 终止与OH组）和苯二硫化物（四乙酰二醇）n=2 C20-植物基"系"分子。这将创建可以固定双层的第一层涂层。
      注:金电极通过蒸发100纳米，99.9995%黄金（5n5金）薄膜到定制25毫米x75毫米聚碳酸酯幻灯片^20。
   2. 在室温下用第一层孵化电极至少1小时。
   3. 通过浸入大量超过30的纯乙醇来冲洗金电极。
   4. 使用金电极滑梯与第一个单层直接为下一步或存储在一个充满纯乙醇的罐子。
   5. 注意:为了确保第一层的完整性，请尽量减少与幻灯片黄金部分的任何直接接触
2. 组装第一个单层涂层幻灯片
   1. 小心地从容器中取出一个胶质金电极滑梯，使用钳子，确保不会与 tBLM 形成的图案区域接触。
      注意:注意识别存放黄金的幻灯片的侧面。
   2. 空气干燥滑梯1 -2分钟，以消除任何残留乙醇。
   3. 将金电极置于干燥表面，确保金电极正确定位，图案金面朝上。
   4. 将透明胶粘层盖从薄层压板中剥离，并放置在 6 个通道上以定义每个井。
   5. 使用压力辊在滑梯和透明粘合层之间释放任何空气，如图1A所示。
      注:此步骤所需的时间需要由研究人员优化。在此协议中，时间范围为 2-3 分钟。
   6. 尽快（在 1-2 分钟内）将第二个脂质双层引入组装的第一层涂层电极进行自组装，以避免损坏第一层。
3. 准备第二脂质双层
   1. 在六口井滑梯中的第一口井中加入 6 μL 的 3 mM 脂质。不要让微管尖的边缘接触金表面，金表面会损坏电极上的系绳化学。
      注:本工作使用的脂质混合物包括3 mM 70% zwitterionic C20 二苯二甲醚-甘油磷酸酯 （DPEPC） 和 30% C20 二苯二甲醚乙醚脂质 （GDPE） 与 3 mM 胆固醇-PEG-Biotin 混合在 50:1 摩尔比。
   2. 将 6 μL 的脂质混合物引入其他油井，每口油井之间的间隙为 10。
   3. 在室温下将每口井孵育整整2分钟，然后用PBS等缓冲器将脂质混合物交换到电极上。空间的时间添加和缓冲交换10秒分开，所以每口井孵育与脂质正好2分钟每个。
   4. 再洗 3 次，用 50 μL 的 PBS 缓冲器 （pH 7.0） 清洗 3 次。请务必在电极上随时留下 50 μL 的缓冲。不要让电极干燥。
      注:用这种方式（溶剂交换方法）将乙醇溶剂与溶剂分离，通过系绳化学快速形成固定在金电极上的单脂双层。
4. 使用电气阻抗光谱 （EIS） 测量测试 tBLM 形成
   1. 将准备好的电极滑动插入交流阻抗光谱仪（例如 Tethapod）。确保光谱仪通过 USB 端口连接到运行软件的计算机。
   2. 打开软件，单击设置并打开硬件。
   3. 设置硬件设置，使用 25 mV 峰值到峰值交流激发。
   4. 将频率设置在 0.1 到 10，000 Hz 之间，每十年设置两个步骤，用于快速阻抗措施按 OK。
   5. 单击设置菜单并打开模型。
   6. 使用等效电路模型，将系绳金电极描述为连续的恒定相位元件，电阻器描述电解质缓冲器和并行电阻电容器网络来描述脂质双层，并按确定。
   7. 按下"开始"按钮，开始实时测量膜电容 （C_m）和膜传导 （G_m）。C_m值的典型 tBLM 应在 12.5 nF 到 15.5 nF 的范围内为 10% 系绳化学^21，22。
   8. 运行协议并完成实验后，保存数据。
   9. 用下一口井重复测量。

2.激光照射

1. 实验设置
   注:为每个 tBLM 单独设置定制系统。
   1. 在防光箱中执行实验，以最大限度地减少激光危险。
   2. 使用光学表设置实验以减少不必要的振动。
   3. 将阻抗读器（黄金幻灯片连接在哪里）放在 XYZ 舞台上，并提升使其位于激光源的路径上。
   4. 使用粗细聚焦微观齿轮控制激光源的高度，达到适当的精度。
   5. 沿着电极滑梯的纵向轴瞄准激光路径。
      注意:始终佩戴合适的激光安全眼镜，保持良好的激光安全规程。
   6. 在开始实验之前，允许选定的调谐激光器稳定下来。
      注:实验设置的示意图在图2A中说明。
2. 激光和金电极的对齐
   注:在开始之前，请始终使用功率计评估激光功率输出，以确保仅向 tBLM 输送非常低的功率。
   1. 调整激光路径或电极的角度，使激光穿过覆盖电极的液体，在金表面均匀可见。
   2. 通过在观察膜传导变化的同时，通过微调提高或降低激光束源来调整每个实验的激光束光位置。
   3. 在没有电导变化时，锁定旋钮以固定激光路径的位置。
      注:当激光与底层金电极相互作用时，将产生增加的膜传导值。因此，调整激光路径非常重要，因此不可能进行这种相互作用。
3. 样品制备
   1. 准备激光束光对齐（膜传导没有变化），如图2所示，位置3。
   2. 将感兴趣的 GNP（功能化或裸露）添加到 PBS 缓冲器中，当激光关闭时，TBLM 会沉浸其中。
   3. 轻轻混合 TBLM 周围的 PBS 缓冲器三次，小心不要触摸电极。
   4. 在室温下孵育5-10分钟。
   5. 将激光打开以照射样品，使用图2、位置3中正确的对齐激光束光位置。
   6. 使用 GNP 大小、形状和浓度与激光波长的适当组合。
      注:设置波长的激光束应耦合到相应的GNP质子共振频率。
   7. 记录连续测量电流（实时测量）。
   8. 执行步骤 2.2.1 - 2.3.7，省略控制实验的 GNP 添加。

3.统计数据分析和介绍

1. 将数据导出到电子表格中。
2. 提取膜传导参数与时间。
3. 在以正确位置设置激光束灯后和引入 GNP 之前使用记录的数据。
4. 通过将测量的膜导电度除以基线膜导电性来使数据正常化。
   注:这证实了引入辐照GNP引起的膜传导值的相对变化。
5. 将数据作为时间图（x轴）与规范化膜传导（y轴）。

4.预测从辐照纳米粒子（热预测模型）中TBLM中产生的局部热量量

1. 根据多布罗夫斯基²³日解决辐射转移问题，以计算辐照纳米粒子溶液中的吸收辐射功率。
2. 通过将吸收辐射产生的热源纳入能量方程来计算热量生成。
   注:有关辐照纳米粒子和纳米电极界面的tBLM中热生成数值分析的详细解释，请参阅^19。

结果

可以创建 tBLM 的黄金基板显示在图 1中。实验设置的示意图在图2中提出。

如图1A所示，平面金电极由25毫米×75毫米×1毫米聚碳酸酯基底基板制成，并配有图案黄金阵列。透明胶粘层定义了六个单独的测量室。平面金电极允许激光直接照射到tBLMs膜上。电极阵列的每个井都包含一个圆形工作电极（区域:0.707 cm

讨论

该协议描述了使用tBLM模型与平面电极基板结合水平激光对齐设置，使实时电阻抗记录响应激光照射金纳米粒子。此处介绍的 EIS 记录方法构建了一个最少的实验列表，用于记录整个膜的离子电流变化，这与耦合激光和金纳米粒子相互作用产生的热量相对应。本协议中的关键步骤是激光路径向双层脂膜周围的缓冲器的仔细和精确对齐。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
30 nm diameter streptavidin-conjugated gold nanoparticles	Cytodiagnostics	AC-30-04-05	This is a streptavidin-conjugated GNPs product ready for use
30 nm diameter bare gold nanoparticles	Sigma-Aldrich	753629	This is a bare GNPs product ready for use
Cholesterol-PEG-Biotin (MW1000)	NANOCS	PG2-BNCS-10k	Dissolved in highly pure ethanol
C20 Diphytanyl-Glycero-Phosphatidylcholine lipids	SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.	SDx-S1	1 ml glass vial containing 70% C16 diphytanyl phosphatidylcholine (DPEPC) and 30% C16 diphytanyl glycerol (GDPE) in 99.9% ethanol
Benzyl-disulfide-tetra-ethyleneglycol-OH	SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.	SDx-S2	Spacer molecules
Benzyl-disulfide (tetra-ethyleneglycol) n=2 C20-phytanyl	SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.	SDx-S2	Tethered molecules
532 nm green laser continuous light	OBIS LS/OBIS CORE LS, China	ND-1000	The power of this laser was ~135 mW
tethaPod EIS reader	SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.	SDx-R1	A reader of conductance and capacitance on six channels simultaneously
tethaPlate cartridge assembly	SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.	SDx-BG	Materials to attach the slide with electrodes to the flow cell cartridge
Clamp and slide assembly jig	SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.	SDx-A1	Materials to attach the slide with electrodes to the flow cell cartridge
Lipid coated coplanar gold electrodes	SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.	SDx-T10	Coplanar  gold electrodes are made from 25 mm x 75 mm x 1 mm polycarbonate base substrate with patterned gold arrays layout, then coated with benzyldisulphide, bis-tetraethylene glycol C16 phytanyl half membrane spanning tethers in a tether ratio of 10%
tethaQuick software	SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.	SDx-B1	Software for use with tethaPod to process data and display conductance, impedance and capacitance measurements from the tethaPlate electrodes
99.9% Pure ethanol	Sigma-Aldrich	34963	Absolute,  99.9%
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417	pH 7