금 나노 입자와 지질 막 사이의 열 전달을 모니터링하는 테더링 된 바이 레이어 지질 멤브레인

요약

이 작업은 레이저 조사 금 나노 입자에서 tBLM으로의 열 전달의 동적 비 침습적 모니터링을 달성하기 위한 프로토콜을 간략하게 설명합니다. 이 시스템은 tBLM 전반에 걸쳐 전도도 변화의 실시간 측정을 위해 임피던스 분광기를 결합하고, 열 생산을 위해 금 나노 입자 조명을 구동하는 수평 집중 레이저 빔을 결합합니다.

초록

여기서 우리는 금 전극에 조립된 테더드 바이레이어 지질 막(tBLM)을 사용하여 전기화학에 의한 조사금 나노입자(GNP)와 이중층 지질막 간의 열 전달을 조사하는 프로토콜을 보고합니다. 연쇄상 구문 GNP와 같은 검개한 GNP는 비오틴과 같은 표적 분자를 포함하는 tBLM에 내장되어 있습니다. 이 방법을 사용하여, 조사의 GNP와 관심있는 개체와 모델 이중 층 지질 막 사이의 열 전달 과정은 수평 집중 레이저 빔에 의해 중재된다. 열 예측 전산 모델은 tBLM의 전기화학적으로 유도된 전도도 변화를 확인하는 데 사용됩니다. 사용되는 특정 조건하에서 열 펄스를 감지하려면 멤브레인 표면에 금 나노 입자의 특정 부착이 필요했으며, 언바운드 금 나노 입자는 측정 가능한 반응을 유도하지 못했습니다. 이 기술은 레이저 파라미터, 입자 크기, 입자 코팅 및 조성물의 최적화를 허용하는 열 치료에 대한 전략의 설계 및 개발에 직접 활용할 수 있는 강력한 검출 바이오센서역할을 합니다.

서문

조사된 금 나노 물질의 고열성 성능은 감염 및 종양^1을위한 최소 침습적이고 선택적이며 표적화된 치료의 새로운 클래스를 제공한다. 레이저에 의해 가열될 수 있는 나노입자의 고용은 병들수 세포를 선택적으로 파괴하고^2,3을선택적으로 전달하는 수단을 제공하는 데 사용되어 왔다. 가열된 플라스모닉 나노입자의 광열염 현상의 결과는 세포막에 손상된다. 유체 지질 양성막은 내성 막 단백질의 데포화뿐만 아니라 막 손상의 저하가 세포^사멸4로이어질 수 있기 때문에 이러한 치료를 받는 세포에 특히 취약한 부위로 간주됩니다. 나노스케일에서 열 전달을 결정하고 모니터링하는 능력은 조사된 GNP^1,5,6,7,GNP와 바이오 멤브레인 간의 분자 상호 작용의 평가 및 이해뿐만 아니라 생물학적 조직에서 임베디드 GNPs의 레이저 유도 가열 현상의 직접적인 결과에 대한 연구 및 적용에 주요 관심사이지만, 아직 완전히 해명 되지⁸. 따라서 한나라당의 고열혈 과정에 대한 철저한 이해는 여전히 어려운 과제다. 이와 같이, 세포의 자연 환경을 모방하는 나노물질-전극 인터페이스의 개발은 생물학적 시스템 내의 조사된 금 나노입자의 열 전달 특성에 대한 심층적인 조사를 수행할 수 있는 수단을 제공할 수 있다.

네이티브 세포막의 복잡성은 세포에서 조사된 GNPs 상호 작용을 이해하는 데 중요한 과제 중 하나입니다. 블랙 지질막^9,지원 평면 막^10,하이브리드 이중층 멤브레인^11,폴리머 쿠션 지질 양성막¹² 및 테더레드 드립레이어 립드 멤브레인^13을포함하되 이에 국한되지 않는 천연 지질 막 아키텍처 및 기능성의 가까운 간단한 바이오 마메틱 버전을 제공하기 위해 개발된 다양한 인공 멤브레인 플랫폼이 있다. 각 인공 지질 막 모델은 천연 지질^막(14)을모방하는 데 있어 뚜렷한 장점과 한계를 가지고 있다.

이 연구는 tBLM 모델을 사용하여 금 나노 입자 및 지질 막 상호 작용을 평가하기위한 센서로 지질 막 코팅 전극의 사용을 설명합니다. tBLM 기반 바이오센서 검출 방식은 테더링 멤브레인이 자체 수리할 수 있는 고유의 안정성 과^{감도(13)를} 제공하며, 다른 시스템(예: 패치 클램프 또는 리포솜에 의해 형성된 멤브레인)과 달리 소량의 막 손상만 발생하여^{붕괴 15,16,17,18을}발생시킵니다. 또한, tBLM은 mm² 치수이기 때문에 배경 임피던스는 패치 클램프 기록 기술보다 크기가 낮기 때문에 나노 입자 상호 작용으로 인해 기저막 이온 플럭스의 변화를 기록할 수 있습니다. 그 결과, 본 프로토콜은 135nW/μm^2의힘이 낮은 레이저에 의해 흥분되는 결합된 GNP에 의해 멤브레인 전도도의 변화를 대조할 수 있다.

여기에 제시된 시스템은 열 요법을 설계하고 개발하는 데 필요한 정확한 레이저 파라미터, 입자 크기, 입자 코팅 및 조성물을 결정하는 민감하고 재현 가능한 방법을 제공합니다. 이것은 새로운 광열 치료의 정제뿐만 아니라 생물학적 시스템 내의 열 전달의 상세한 메커니즘에 대한 귀중한 정보를 제공하는 데 중요합니다. 제시된 프로토콜은 이전에 게시된^{작업(19)을}기반으로 합니다. 프로토콜의 개요는 다음과 같습니다: 첫 번째 단면은 tBLM 형성을 정의합니다. 두 번째 단면은 설정을 구성하고 흥분 레이저 소스를 정렬하는 방법을 간략하게 설명합니다. 마지막 섹션에서는 전기 임피던스 분광기 데이터에서 정보를 추출하는 방법을 보여 줍니다.

프로토콜

1. tBLM 전극 준비

1. 첫 번째 단층 코팅 준비
   1. 벤질-이설화-테트라-에틸레네글리콜-OH "스페이서" 분자(벤질 이설화4개의 산소-에틸렌 글리콜 스페이저로 구성된 3mM 1:9 비율로 구성된 에탄올릭 용액에 갓 스퍼터 골드 패턴의 전극 현미경 슬라이드를 담급니다. OH 군) 및 벤질-디설파이드(테트라-에틸레네글리콜) n=2 C20-피타닐 "테더링" 분자로 종결하였다. 이렇게 하면 이중레이어를 고정할 수 있는 첫 번째 층 코팅이 만들어집니다.
      참고: 금 전극은 100nm, 99.9995% 골드(5n5 골드) 필름을 사용자 지정 25mm x 75mm 폴리카보네이트 슬라이드^20으로증발시켜 만들어집니다.
   2. 적어도 1 h에 대한 실온에서 첫 번째 층으로 전극을 배양.
   3. 30s 이상의 순수한 에탄올에 담가 서 금 전극을 헹구십시오.
   4. 첫 번째 단층과 금 전극 슬라이드를 사용하여 다음 단계를 위해 직접 사용하거나 순수 에탄올로 가득 찬 항아리에 보관하십시오.
   5. 참고: 첫 번째 레이어의 무결성을 보장하기 위해 슬라이드의 골드 부분에 대한 직접 접촉을 최소화합니다.
2. 첫 번째 단층 코팅 슬라이드 조립
   1. 핀셋을 사용하여 용기에서 하나의 코플러너 금 전극 슬라이드를 조심스럽게 벗고 tBLM이 형성되는 패턴 영역과 접촉하지 않도록하십시오.
      참고: 금이 증착되는 슬라이드의 측면을 식별하려면 주의하십시오.
   2. 잔류 에탄올을 제거하기 위해 1 -2 분 동안 공기 건조 슬라이드.
   3. 금 전극을 건조한 표면에 놓고 금 전극이 패턴 골드 표면을 향하고 있는지 확인합니다.
   4. 얇은 라미네이트에서 투명 접착제 층 커버를 껍질을 벗기고 6 개 채널 위에 배치하여 각 채널을 잘 정의합니다.
   5. 도 1A에도시된 것처럼 압력 롤러를 사용하여 슬라이드와 투명한 접착제 층 사이의 공기를 방출합니다.
      참고: 이 단계에 필요한 시간은 연구원에 의해 최적화되어야 합니다. 이 프로토콜에서 시간은 2-3분입니다.
   6. 제1층을 손상시키지 않도록 자체 조립을 위해 조립된 첫 번째 단층 코팅 전극에 제2 지질 이중층을 가능한(1-2분 이내)에 즉시 소개합니다.
3. 두 번째 지질 이중 층의 준비
   1. 6개의 웰 슬라이드 중 첫 번째 웰에 관심 있는 3mm 지질의 6 μL을 추가합니다. 마이크로 피펫 팁의 가장자리가 전극의 테더링 된 화학을 손상시킬 수있는 금 표면에 닿지 마십시오.
      참고: 이 작품에 사용된 지질 혼합물은 3mM 70% zwitterionic C20 디피타닐-글리세로-인파디딜콜린(DPEPC) 및 30% C20 디피타니글리글리세라이드 에테르 지질지질(GDPE)과 혼합되어 5mM 콜레스테롤-PEG-BIOtin 비율로 50:10m비율로 구성되었다.
   2. 지질 혼합물의 6 μL을 다른 우물에 10s 간격으로 도입합니다.
   3. PBS와 같은 완충제와 전극 위에 지질 혼합물을 교환하기 전에 실온에서 정확히 2 분 동안 각각 양호유하십시오. 추가 및 버퍼 교환을 위한 시간을 10초 간격으로 공간화하여 각 우물은 각각 정확히 2분 동안 지질과 함께 배양됩니다.
   4. PBS 버퍼(pH 7.0)의 50μL로 3회 더 세척합니다. 항상 전극 위에 50 μL의 버퍼를 두어야 합니다. 전극이 건조하지 마십시오.
      참고: 이러한 방식으로 수성 용액으로 에탄올 용매를 대체하는 방법(용매 교환 방법)은테더드 화학을 통해 금 전극에 고정된 단일 지질 이중층의 신속한 형성을 가능하게 한다.
4. 전기 임피던스 분광기(EIS) 측정을 이용한 tBLM 형성 테스트
   1. 준비된 전극 슬라이드를 AC 임피던스 분광기(예: Tethapod)에 삽입합니다. 분광계가 USB 포트를 통해 소프트웨어를 실행하는 컴퓨터에 연결되어 있는지 확인합니다.
   2. 소프트웨어를 열고 설치를 클릭하고 하드웨어를엽니다.
   3. 하드웨어 설정을 설정하여 25mV 피크-투 피크 AC 여기를 사용합니다.
   4. 빠른 임피던스 조치에 대한 10년당 2단계로 0.1~10,000Hz 사이의 주파수를 설정하십시오.
   5. 설정 메뉴를 클릭하고 모델을 엽니다.
   6. 전해질 버퍼와 병렬 저항기 커패시터 네트워크를 설명하는 저항기와 함께 계열의 일정한 위상 요소로 테더링 골드 전극을 설명하는 동등한 회로 모델을 사용하여 지질 이중층을 설명하고 OK를누릅니다.
   7. 멤브레인 정전용량(Cm) 및 멤브레인 전도(G_m)의실시간 측정을시작하려면 시작 버튼을 누릅니다. 일반적인 tBLM의 C_m 값은 10% 테더드^{화학21,22에}대해 12.5nF ~ 15.5nF의 범위에 있어야 한다.
   8. 프로토콜을 실행하고 실험을 완료한 후 데이터를 저장합니다.
   9. 다음 잘 측정을 반복합니다.

2. 레이저 조사

1. 실험 설정
   참고: 각 tBLM에 대해 맞춤 제작 시스템이 개별적으로 설정됩니다.
   1. 레이저를 위험하게 최소화하기 위해 광방지 상자에서 실험을 수행합니다.
   2. 광학 테이블을 사용하여 원치 않는 진동을 줄이기 위해 실험을 설정합니다.
   3. 골드 슬라이드가 연결된 임피던스 리더를 XYZ 단계에 배치하고 레이저 소스의 경로에 앉을 수 있도록 상승합니다.
   4. 거친 초점 미세 초점 미세 기어링을 사용하여 레이저 소스의 높이를 제어하여 적절한 정밀도를 달성하십시오.
   5. 전극 슬라이드의 세로 축을 따라 레이저 경로를 대상으로 합니다.
      주의: 항상 적합한 레이저 안전 안경을 착용하고 좋은 레이저 안전 프로토콜을 유지합니다.
   6. 실험을 시작하기 전에 선택한 조정된 레이저가 안정화되도록 합니다.
      참고: 실험 설정의 회로도는 도 2A에도시되어 있다.
2. 레이저 및 금 전극의 정렬
   참고: 시작하기 전에 항상 전력 계를 사용하여 레이저 출력을 평가하여 매우 낮은 와트만 tBLM에 전달되도록 합니다.
   1. 레이저 경로 또는 전극의 각도를 조정하여 레이저가 전극을 덮는 액체를 통과하고 금 표면에서 균등하게 볼 수 있도록 조정합니다.
   2. 멤브레인 전도도의 변화를 관찰하면서 미세 조정을 사용하여 레이저 빔 소스를 높이거나 낮추어 각 실험에 대한 레이저 빔 광선 위치를 조정합니다.
   3. 전도도 변화가 관찰되지 않은 경우 노브를 잠그면 레이저 경로의 위치를 확보한다.
      참고: 레이저가 기본 금 전극과 상호 작용할 때 멤브레인 전도도 값이 증가합니다. 따라서 이러한 상호 작용이 불가능하도록 레이저 경로를 조정하는 것이 중요합니다.
3. 샘플 준비
   1. 도 2,위치 3에 도시된 바와 같이 레이저 빔 라이트 정렬(멤브레인 전도도에 변화가 없는 경우)을 준비한다.
   2. 레이저가 꺼지는 동안 tBLM이 침지되는 PBS 버퍼에 GNP(기능화 또는 맨손으로)를 추가합니다.
   3. TBLM을 둘러싼 PBS 버퍼를 세 번 부드럽게 섞어 전극을 만지지 않도록 주의하십시오.
   4. 실온에서 5-10분 동안 배양하십시오.
   5. 도 2,위치 3에서 볼 수 있는 올바른 정렬 레이저 빔 빔 위치를 사용하여 레이저 ON을 돌려 샘플을 조사한다.
   6. GNP 크기, 모양 및 농도와 레이저 광 파장의 적절한 조합을 사용합니다.
      참고: 세트 파장의 레이저 빔은 해당 GNP 플라스몬 공명 주파수와 결합되어야 합니다.
   7. 기록은 전류를 지속적으로 측정(실시간 측정)합니다.
   8. 대조군 실험에 대한 한나라당 추가를 생략하여 2.2.1 - 2.3.7단계를 수행한다.

3. 통계 데이터 분석 및 프레젠테이션

1. 데이터를 스프레드시트로 내보냅니다.
2. 멤브레인 전도도 파라미터를 시간 대 추출합니다.
3. 올바른 위치와 GNP 도입 전에 레이저 빔 라이트를 설정한 후 기록된 데이터를 사용합니다.
4. 측정된 멤브레인 전도도를 기준막 전도도보다 나누어 데이터를 정상화한다.
   참고: 이것은 소개된 조사된 GNP에 의해 유도된 막 전도 값에 있는 상대적인 변경이 있다는 것을 확인합니다.
5. 데이터를 정규화된 멤브레인 전도(y축)에 비해 시간(x 축)으로 데이터를 제시합니다.

4. 조사 된 나노 입자 (열 예측 모델)에서 tBLM에서 발생하는 국소화 된 열의 양을 예측합니다.

1. ^{돔브로프스키(23)에}따른 방사선 전달 문제를 해결하여 조사된 나노입자 용액에서 흡수된 방사선 전력을 계산한다.
2. 흡수된 방사선으로 인한 열원을 에너지 방정식에 통합하여 열발생을 계산합니다.
   참고: 조사된 나노입자 및 나노물질-전극 인터페이스로부터 tBLM에서 의 열발생의 수치 분석에 대한 자세한 설명은 ^19를참조한다.

결과

tBLM을 만들 수 있는 금 기판은 도 1에표시됩니다. 실험 설정의 회로도는 도 2에제시된다.

그림 1A에도시된 바와 같이 코플러니 골드 전극은 패턴 골드 어레이가 있는 25mm x 75mm x 1mm 폴리카보네이트 베이스 기판으로 만들어집니다. 투명한 접착제 층은 6개의 개별 측정 챔버를 정의합니다. 코플라나 금 전극은 tBLM ...

토론

이 프로토콜은 금 나노 입자의 레이저 조사에 대한 응답으로 실시간 전기 임피던스 기록을 가능하게 수평 레이저 정렬 설정과 함께 코플라나르 전극 기판과 tBLM 모델의 사용을 설명합니다. 여기에 제시된 EIS 기록 방법은 결합된 레이저 및 금 나노입자 상호작용에 의해 생성된 열에 해당하는 멤브레인 전반에 걸쳐 이온 전류 변화를 기록하는 데 필요한 최소한의 실험 목록?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
30 nm diameter streptavidin-conjugated gold nanoparticles	Cytodiagnostics	AC-30-04-05	This is a streptavidin-conjugated GNPs product ready for use
30 nm diameter bare gold nanoparticles	Sigma-Aldrich	753629	This is a bare GNPs product ready for use
Cholesterol-PEG-Biotin (MW1000)	NANOCS	PG2-BNCS-10k	Dissolved in highly pure ethanol
C20 Diphytanyl-Glycero-Phosphatidylcholine lipids	SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.	SDx-S1	1 ml glass vial containing 70% C16 diphytanyl phosphatidylcholine (DPEPC) and 30% C16 diphytanyl glycerol (GDPE) in 99.9% ethanol
Benzyl-disulfide-tetra-ethyleneglycol-OH	SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.	SDx-S2	Spacer molecules
Benzyl-disulfide (tetra-ethyleneglycol) n=2 C20-phytanyl	SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.	SDx-S2	Tethered molecules
532 nm green laser continuous light	OBIS LS/OBIS CORE LS, China	ND-1000	The power of this laser was ~135 mW
tethaPod EIS reader	SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.	SDx-R1	A reader of conductance and capacitance on six channels simultaneously
tethaPlate cartridge assembly	SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.	SDx-BG	Materials to attach the slide with electrodes to the flow cell cartridge
Clamp and slide assembly jig	SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.	SDx-A1	Materials to attach the slide with electrodes to the flow cell cartridge
Lipid coated coplanar gold electrodes	SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.	SDx-T10	Coplanar  gold electrodes are made from 25 mm x 75 mm x 1 mm polycarbonate base substrate with patterned gold arrays layout, then coated with benzyldisulphide, bis-tetraethylene glycol C16 phytanyl half membrane spanning tethers in a tether ratio of 10%
tethaQuick software	SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.	SDx-B1	Software for use with tethaPod to process data and display conductance, impedance and capacitance measurements from the tethaPlate electrodes
99.9% Pure ethanol	Sigma-Aldrich	34963	Absolute,  99.9%
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417	pH 7