Привязанные двухслойные липидные мембраны для мониторинга теплопередачи между наночастицами золота и липидными мембранами

Резюме

В этой работе описывается протокол для достижения динамического, неинвазивного мониторинга теплопередачи от облученных лазером наночастиц золота к tBLM. Система сочетает в себе импедансную спектроскопию для измерения изменений проводимости в реальном времени в tBLM с горизонтально сфокусированной лазерной лучом, которая управляет освещением наночастиц золота, для производства тепла.

Аннотация

Здесь мы сообщаем о протоколе исследования теплопередачи между облученными наночастицами золота (GGNP) и двухслойными липидными мембранами с помощью электрохимии с использованием привязанных двухслойных липидных мембран (tBLM), собранных на золотых электродах. Облученные модифицированные ГПН, такие как стрептавидин-конъюгированные ГПН, встроены в tBLM, содержащие молекулы-мишени, такие как биотин. Используя этот подход, процессы теплопередачи между облученными ГНН и модельной двухслойной липидной мембраной с объектами, представляющими интерес, опосредованы горизонтально сфокусированным лазерным лучом. Тепловая прогностическая вычислительная модель используется для подтверждения электрохимически индуцированных изменений проводимости в tBLM. В определенных условиях обнаружения тепловых импульсов требовалось специфическое прикрепление наночастиц золота к поверхности мембраны, в то время как несвязанные наночастицы золота не смогли вызвать измеримый ответ. Этот метод служит мощным биосенсором обнаружения, который может быть непосредственно использован для проектирования и разработки стратегий тепловой терапии, которая позволяет оптимизировать параметры лазера, размер частиц, покрытия частиц и состав.

Введение

Гипертермические характеристики облученных наноматериалов золота предлагают новый класс минимально инвазивного, селективного, целенаправленного лечения инфекций и^{опухолей1.} Применение наночастиц, которые могут быть нагреты лазером, было использовано для избирательного уничтожения больных клеток, а также для обеспечения средства для селективной доставки лекарств^2,3. Следствием явлений фототермолиза нагретых плазмонных наночастиц является повреждение клеточных мембран. Жидко-липидная двухслойная мембрана считается особенно уязвимым местом для клеток, проходящих такое лечение, поскольку денатурация внутренних мембранных белков, а также повреждение мембраны также могут привести к гибели клеток^4,поскольку многие белки существуют для поддержания градиента ионного потенциала через клеточные мембраны. В то время как способность определять и контролировать теплопередачу на наноуровне представляет ключевой интерес для изучения и применения облученных ГПН^1,5,6,7,оценки и понимания молекулярных взаимодействий между ГПН и биомембранами, а также прямых последствий лазерно-индуцированных явлений нагрева встроенных ГПН в биологических тканях, еще предстоит полностью прояснить⁸. Поэтому глубокое понимание процесса гипертермии облученных ГПН остается проблемой. Таким образом, разработка интерфейса наноматериал-электрод, который имитирует естественную среду клеток, может обеспечить средство для проведения углубленного исследования характеристик теплопередачи облученных наночастиц золота в биологических системах.

Сложность нативных клеточных мембран является одной из значительных проблем в понимании взаимодействий облученных ГПН в клетках. Были разработаны различные искусственные мембранные платформы для обеспечения близких простых биомиметических версий архитектуры и функциональности естественной липидной мембраны, включая, но не ограничиваясь ими, черные липидные мембраны^9,поддерживаемые планарные бислойные мембраны^10,гибридные двухслойные мембраны^11,полимерные амортизированные липидные двухслойные мембраны¹² и привязанные двухслойные липидные мембраны^13. Каждая модель искусственной липидной мембраны имеет явные преимущества и ограничения в отношении имитации естественных липидных мембран^14.

Это исследование описывает использование электродов с липидным мембранным покрытием в качестве датчика для оценки взаимодействия наночастиц золота и липидной мембраны с использованием модели tBLM. Схема обнаружения биосенсоров на основе tBLM обеспечивает присущую им стабильность и^{чувствительность 13,} поскольку привязанные мембраны могут самовоспроизводиться, в отличие от других систем (таких как мембраны, образованные патч-зажимом или липосомами), в которых только небольшое количество повреждений мембран приводит к их коллапсу^15,16,17,18. Кроме того, поскольку tBLM имеют размеры^{мм 2,} фоновое сопротивление на порядки ниже, чем методы записи патч-зажима, что позволяет регистрировать изменения в ионном потоке базальной мембраны из-за взаимодействий наночастиц. В результате этого настоящий протокол может противопоставлять изменения в проводимости мембраны связанными GNP, которые возбуждаются лазерами, мощность которых равна 135 нВт/мкм2.

Система, представленная здесь, обеспечивает чувствительный и воспроизводимый метод определения точных параметров лазера, размера частиц, покрытий частиц и состава, необходимых для проектирования и разработки тепловой терапии. Это имеет решающее значение для уточнения новых фототермических методов лечения, а также предлагает ценную информацию для подробных механизмов теплопередачи в биологических системах. Представленный протокол основан на ранее опубликованной работе^19. Схема протокола выглядит следующим образом: первый раздел определяет формирование tBLM; во втором разделе описывается, как построить установку и выровнять источник лазера возбуждения; в заключительном разделе показано, как извлечь информацию из данных электроимпедантной спектроскопии.

протокол

1. Подготовка электродов tBLMs

1. Приготовление первого однослойного покрытия
   1. Погрузите свеженапыленный золотой узорчатый электродный микроскопический слайд в этаноловый раствор, состоящий из соотношения 3 мМ 1:9 бензил-дисульфид-тетра-этиленгликоль-OH «спейсерных» молекул (бензилдисульфид содержал четыре кислородно-этиленгликолевых спейсера, заканчивающихся группой ОН) и бензилдисульфида (тетра-этиленгликоль) n=2 молекул C20-фитанила «привязанных». Это создает первый слой покрытия, к которому может быть прикреплен бислой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Золотой электрод изготовлен путем испарения 100 нм, 99,9995% золотой (5n5 золота) пленки на пользовательские поликарбонатные слайды 25 мм х 75 мм²⁰.
   2. Инкубировать электроды первым слоем при комнатной температуре не менее 1 ч.
   3. Промывайте золотые электроды, погружаясь в обильное количество чистого этанола в течение 30 с.
   4. Используйте золотую электродную горку с первым монослоем непосредственно для следующего шага или храните в банке, полной чистого этанола.
   5. ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы обеспечить целостность первого слоя, сведите к минимуму любой прямой контакт с золотыми частями слайда
2. Сборка первого монослойного слайда с покрытием
   1. Осторожно снимайте один копланарный золотой электрод из контейнера с помощью пинцета, следя за тем, чтобы не контактировать с узорчатыми областями, где будут формироваться tBLM.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте внимательны, чтобы определить сторону слайда, на которую кладется золото.
   2. Воздушный сухой горка в течение 1 - 2 мин для удаления остатков этанола.
   3. Поместите золотой электрод на сухую поверхность, убедитесь, что золотой электрод правильно ориентирован с узорчатой золотой поверхностью, обращенной вверх.
   4. Очистите прозрачный клеевой слой от тонкого ламината и поместите на 6 каналов, чтобы определить каждую скважину.
   5. Используйте прижимный ролик для высвобождения любого воздуха между слайдом и прозрачным клеевым слоем, как показано на рисунке 1A.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время, необходимое для этого шага, должно быть оптимизировано исследователем. В этом протоколе время колеблется от 2-3 мин.
   6. Внесите как можно скорее (в течение 1-2 минут) второй липидный бислой в собранный первый монослойный электрод для самостоятельной сборки, чтобы избежать повреждения первого слоя.
3. Получение второго липидного бислоя
   1. Добавьте 6 мкл липидов 3 мМ, представляющих интерес, в первую скважину из шести скважин. Не позволяйте краю наконечника микропипетки касаться золотой поверхности, что может повредить привязанные химикаты на электроде.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Липидная смесь, использованная в этой работе, состояла из 3 мМ 70% цвиттерионических C20 дифитанил-эфир-глицеро-фосфатидилхолин (DPEPC) и 30% C20 дифитанилдиглицеридных эфирных липидов (GDPE), смешанных с 3 мМ холестерин-ПЭГ-биотин в молярном соотношении 50:1.
   2. Вводят 6 мкл липидной смеси в другие скважины с зазором 10 с между каждым добавлением.
   3. Инкубировать каждую скважину ровно 2 мин при комнатной температуре перед обменом липидной смеси на электроды с буфером, таким как PBS. Размещайте время для добавления и буферного обмена на 10 с друг от друга, чтобы каждая скважина инкубировался с липидами ровно по 2 мин каждая.
   4. Промыть еще 3 раза 50 мкл буфера PBS (рН 7,0). Обязательно оставляйте 50 мкл буфера над электродами в любое время. Не позволяйте электродам высохнуть.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вытеснение растворителя этанола водным раствором таким образом (метод обмена растворителем)позволяет быстро сформировать один липидный бислой, закрепленный на золотом электроде через привязанные химические вещества.
4. Тестирование образования tBLM с помощью измерений электрической импедансной спектроскопии (EIS)
   1. Вставьте подготовленный электродный слайд в импедантный спектрометр переменного тока (например, Тетапод). Убедитесь, что спектрометр подключен через USB-порт к компьютеру, на котором запущено программное обеспечение.
   2. Откройте программное обеспечение, нажмите настройка и откройте Оборудование.
   3. Установите аппаратные настройки для использования возбуждения переменного тока от пика до пика 25 мВ.
   4. Установите частоты от 0,1 до 10 000 Гц с двумя шагами в десятилетие для измерения быстрого импеданса, нажмите ok.
   5. Откройте меню Настройка и откройте Модель.
   6. Используйте эквивалентную модель схемы, которая описывает привязанный золотой электрод как постоянный фазовый элемент последовательно с резистором, описывающим буфер электролита и параллельную резисторно-конденсаторную сеть, чтобы описать липидный бислой, и нажмите OK.
   7. Нажмите кнопку Start, чтобы начать измерение емкости мембраны (C_m)и мембранной проводимости (G_m)в режиме реального времени. Значения C_m типичных tBLM должны находиться в диапазоне от 12,5 нФ до 15,5 нФ для 10% привязанных химических^21,22.
   8. После запуска протокола и завершения эксперимента сохраните данные.
   9. Повторите измерение со следующей скважиной.

2. Лазерное облучение

1. Экспериментальная установка
   ПРИМЕЧАНИЕ: Индивидуальная система настраивается для каждой скважины tBLM индивидуально.
   1. Проводите эксперименты в светонепроницаемой коробке, чтобы свести к минимуму опасность лазера.
   2. Используйте стол оптики, чтобы настроить эксперимент на уменьшение нежелательных вибраций.
   3. Поместите импедансный считыватель, где подключен золотой слайд, на ступень XYZ и поднимите так, чтобы он сидел на пути лазерного источника.
   4. Используйте микроскопическое зацепляние с грубой фокусировки для управления высотой лазерного источника для достижения соответствующей точности.
   5. Наведите лазерный путь вдоль продольной оси скольжения электрода.
      ВНИМАНИЕ: Всегда носите подходящие лазерные защитные очки и соблюдайте хорошие протоколы лазерной безопасности.
   6. Позвольте выбранному настроенной лазеру стабилизироваться перед началом эксперимента.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Схема экспериментальной установки проиллюстрирована на рисунке 2А.
2. Выравнивание лазерных и золотых электродов
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом всегда оценивайте выходную мощность лазера с помощью измерителя мощности, чтобы обеспечить доставку только очень низкой мощности на tBLM.
   1. Отрегулируйте либо траекторию лазера, либо угол электрода таким образом, чтобы лазер проходил через жидкость, покрывающую электрод, и был виден ровно на поверхности золота.
   2. Отрегулируйте положение лазерного луча для каждого эксперимента, поднимая или опуская источник лазерного луча с помощью тонкой регулировки при наблюдении за изменениями в проводимости мембраны.
   3. Зафиксируйте ручку, чтобы закрепить положение лазерного тракта, когда не наблюдается изменений проводимости.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Повышенные значения проводимости мембраны будут генерироваться, когда лазер взаимодействует с лежащим в основе золотым электродом. Поэтому важно настроить траекторию лазера таким образом, чтобы такие взаимодействия были невозможны.
3. Пробоподготовка
   1. Подготовьте выравнивание света лазерным лучом (где нет изменения проводимости мембраны), как показано на рисунке 2,положение 3.
   2. Добавьте интересующих GGNP (функционализированные или голые) в буфер PBS, в который погружаются tBLM, а лазер выключен.
   3. Смешайте буфер PBS, окружающий tBLM, осторожно три раза, стараясь не коснуться электрода.
   4. Инкубировать в течение 5-10 мин при комнатной температуре.
   5. Включите лазер для облучения образца, используя правильное положение света выровненного лазерного луча, как показано на рисунке 2,положение 3.
   6. Используйте соответствующую комбинацию размера, формы и концентрации GNP с длиной волны лазерного света.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лазерный луч заданной длины волны должен соединяться с соответствующей частотой плазмонного резонанса GNP.
   7. Непрерывно записывайте измеренный ток (измерения в режиме реального времени).
   8. Выполните шаги 2.2.1 - 2.3.7, исключив добавление ВНП для контрольных экспериментов.

3. Анализ и представление статистических данных

1. Экспортируйте данные в электронную таблицу.
2. Извлеките параметр проводимости мембраны в сравнении со временем.
3. Используйте записанные данные после установки лазерного луча с правильным положением и до введения ГПН.
4. Нормализуйте данные, разделив измеренную мембранную проводимость на базовую проводимость мембраны.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это подтверждает относительные изменения значений мембранной проводимости, вызванные введенными облученными ГПН.
5. Представление данных в виде графиков времени (ось X) по сравнению с нормализованной мембранной проводимости (ось Y).

4. Прогнозирование количества локализованного тепла, генерируемого в tBLM из облученных наночастиц (тепловая прогностическая модель)

1. Решить задачу переноса излучения по Домбровскому^23,чтобы рассчитать поглощенную мощность излучения в облученных растворах наночастиц.
2. Рассчитайте выработку тепла, включив источник тепла из-за поглощенного излучения в энергетическое уравнение.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подробное объяснение численного анализа теплогенерации в tBLM из облученных наночастиц и интерфейса наноматериал-электрод см. в ¹⁹.

Результаты

Золотая подложка, на которой могут быть созданы tBLM, показана на рисунке 1. Схема экспериментальной установки представлена на рисунке 2.

Копланарные золотые электроды, как показано на рисунке 1А,изготавливаются из подложки и...

Обсуждение

Этот протокол описывает использование модели tBLM с копланарной электродной подложкой в сочетании с установкой горизонтального лазерного выравнивания, которое позволяет регистрировать электрическое сопротивление в режиме реального времени в ответ на лазерное облуч...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
30 nm diameter streptavidin-conjugated gold nanoparticles	Cytodiagnostics	AC-30-04-05	This is a streptavidin-conjugated GNPs product ready for use
30 nm diameter bare gold nanoparticles	Sigma-Aldrich	753629	This is a bare GNPs product ready for use
Cholesterol-PEG-Biotin (MW1000)	NANOCS	PG2-BNCS-10k	Dissolved in highly pure ethanol
C20 Diphytanyl-Glycero-Phosphatidylcholine lipids	SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.	SDx-S1	1 ml glass vial containing 70% C16 diphytanyl phosphatidylcholine (DPEPC) and 30% C16 diphytanyl glycerol (GDPE) in 99.9% ethanol
Benzyl-disulfide-tetra-ethyleneglycol-OH	SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.	SDx-S2	Spacer molecules
Benzyl-disulfide (tetra-ethyleneglycol) n=2 C20-phytanyl	SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.	SDx-S2	Tethered molecules
532 nm green laser continuous light	OBIS LS/OBIS CORE LS, China	ND-1000	The power of this laser was ~135 mW
tethaPod EIS reader	SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.	SDx-R1	A reader of conductance and capacitance on six channels simultaneously
tethaPlate cartridge assembly	SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.	SDx-BG	Materials to attach the slide with electrodes to the flow cell cartridge
Clamp and slide assembly jig	SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.	SDx-A1	Materials to attach the slide with electrodes to the flow cell cartridge
Lipid coated coplanar gold electrodes	SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.	SDx-T10	Coplanar  gold electrodes are made from 25 mm x 75 mm x 1 mm polycarbonate base substrate with patterned gold arrays layout, then coated with benzyldisulphide, bis-tetraethylene glycol C16 phytanyl half membrane spanning tethers in a tether ratio of 10%
tethaQuick software	SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.	SDx-B1	Software for use with tethaPod to process data and display conductance, impedance and capacitance measurements from the tethaPlate electrodes
99.9% Pure ethanol	Sigma-Aldrich	34963	Absolute,  99.9%
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417	pH 7