ממברנות שומנים דו-שכבתיות קשורות לניטור העברת חום בין חלקיקי זהב וממברנות שומנים

Summary

עבודה זו מתארת פרוטוקול להשגת ניטור דינמי ולא פולשני של העברת חום מננו-חלקיקי זהב מוקרנים בלייזר ל- tBLMs. המערכת משלבת ספקטרוסקופיית עבלה למדידה בזמן אמת של שינויי מוליכות על פני tBLMs, עם קרן לייזר ממוקדת אופקית המניעה תאורת ננו-חלקיקים מזהב, לייצור חום.

Abstract

כאן אנו מדווחים פרוטוקול כדי לחקור את העברת החום בין חלקיקי זהב מוקרן (GNPs) וקרום שומנים דו שכבתי על ידי אלקטרוכימיה באמצעות ממברנות שומנים דו שכבתיים קשורות (tBLMs) המורכב על אלקטרודות זהב. GNPs שעברו שינוי מוקרן, כגון GNPs מצומדים בסטרפטבידין, מוטבעים ב- tBLMs המכילים מולקולות יעד, כגון ביוטין. באמצעות גישה זו, תהליכי העברת החום בין GNPs מוקרן לבין קרום השומנים דו שכבתי מודל עם ישויות עניין מתווכים על ידי קרן לייזר ממוקד אופקית. המודל החישובי הניבוי התרמי משמש כדי לאשר את שינויי המוליך המושרים אלקטרוכימית ב- tBLMs. בתנאים הספציפיים בהם נעשה שימוש, זיהוי פולסים חום דרש התקשרות ספציפית של חלקיקי הזהב לפני השטח של הממברנה, בעוד חלקיקי זהב לא מאוגדים לא הצליחו לעורר תגובה מדידה. טכניקה זו משמשת biosensor גילוי רב עוצמה אשר ניתן להשתמש ישירות לתכנון ופיתוח של אסטרטגיות לטיפולים תרמיים המאפשר אופטימיזציה של פרמטרי לייזר, גודל החלקיקים, ציפוי החלקיקים והרכב.

Introduction

הביצועים היפרתרמיים של ננו ננו זהב מוקרן מציע סוג חדש של טיפול זעיר פולשני, סלקטיבי, ממוקד לזיהומים וגידולים¹. העסקת חלקיקים שניתן לחמם על ידי לייזר שימשה להרוס תאים חולים באופן סלקטיבי, כמו גם מתן אמצעי לאספקת תרופות סלקטיבית^2,3. תוצאה של תופעות פוטותרמיליזה של חלקיקים פלסמוניים מחוממים היא נזק לקרום התא. קרום דו שכבתי שומנים נוזלי נחשב אתר פגיע במיוחד עבור תאים העוברים טיפולים כאלה כי denaturation של חלבונים ממברנה פנימית, כמו גם נזק ממברנה יכול גם להוביל למוות תאים⁴, כמו חלבונים רבים נמצאים שם כדי לשמור על שיפוע הפוטנציאלי יוני על פני קרום התא. בעוד היכולת לקבוע ולנטר העברת חום בקנה מידה ננומטרי היא עניין מרכזי למחקר ויישום של GNPs מוקרן 1^,5,6,7, הערכה והבנה של האינטראקציות המולקולריות בין GNPs ו bio-membranes, כמו גם את ההשלכות הישירות של^תופעותהחימום המושרה בלייזר של GNPs מוטבע ברקמות ביולוגיות, עדיין לא נוהרו במלואם^8. לכן, הבנה מעמיקה של תהליך היפרתרמיה של GNPs מוקרן נשאר אתגר. ככזה, פיתוח של ממשק ננו-חומרים-אלקטרודה המחקה את הסביבה הטבעית של תאים יכול לספק אמצעי שבאמצעותו לבצע חקירה מעמיקה של מאפייני העברת החום של חלקיקי זהב מוקרן בתוך מערכות ביולוגיות.

המורכבות של קרום התא המקומי הוא אחד האתגרים המשמעותיים בהבנת אינטראקציות GNPs מוקרן בתאים. היו פלטפורמות ממברנה מלאכותית שונות שפותחו כדי לספק גרסאות ביו-מימטיות פשוטות קרובות של ארכיטקטורה ופונקציונליות של קרום השומנים הטבעי, כולל, אך לא רק, ממברנות שומנים שחורות⁹, ממברנות דו-שכבתיות פלנאריות נתמכות¹⁰, ממברנות דו-שכבתיות היברידיות¹¹, ממברנות דו-שכבתיות מרופדות בשומן^{פולימר 12} וקרום השומנים הדו-שכבתי קשור¹³. לכל מודל קרום השומנים המלאכותי יש יתרונות ומגבלות ברורים ביחס לחיקוי ממברנות השומנים הטבעיות¹⁴.

מחקר זה מתאר את התעסוקה של אלקטרודות מצופות קרום השומנים כחיישן להערכת ננו-חלקיקי זהב ואינטראקציות קרום השומנים, באמצעות מודל tBLM. ערכת זיהוי הביו-סנסור המבוססת על tBLM מספקת יציבות ורגישות טבועה¹³ מכיוון שקרומים קשורים יכולים לתקן את עצמם, בניגוד למערכות אחרות (כגון ממברנות שנוצרו על ידי מהדק תיקון או ליפוזומים) שבהן רק כמות קטנה של נזק לממברנה גורמת לקריסתם^15,16,17,18. יתר על כן, מכיוון ש- tBLMs הם בממדי מ"מ^2, עבלה ברקע היא בסדרי גודל נמוכים יותר מטכניקות הקלטה של מהדק תיקון, המאפשרות הקלטה של שינויים בשטף היוני של הממברנה המבסאלית עקב אינטראקציות ננו-חלקיקים. כתוצאה מכך, הפרוטוקול הנוכחי יכול להשוות שינויים בהווכות הממברנה על ידי GNPs מאוגדים כי הם נרגשים על ידי לייזרים שכוחותיהם נמוכים כמו 135 nW / μm².

המערכת המוצגת כאן מספקת שיטה רגישה וניתנת לשחזור לקביעת פרמטרי לייזר מדויקים, גודל חלקיקים, ציפוי חלקיקים והרכב הדרושים לתכנון ופיתוח טיפולים תרמיים. זה קריטי לעידון של טיפולים פוטותרמיים מתעוררים, כמו גם מציע מידע בעל ערך עבור מנגנונים מפורטים של העברת חום בתוך מערכות ביולוגיות. הפרוטוקול המוצג מבוסס על עבודה¹⁹שפורסמה בעבר . חלוקה לרמות של הפרוטוקול היא כדלקמן: המקטע הראשון מגדיר את היווצרות tBLM; המקטע השני מתאר כיצד לבנות את ההתקנה וליישר את מקור לייזר העירור; החלק האחרון ממחיש כיצד לחלץ מידע מנתוני ספקטרוסקופיית העכבה החשמלית.

Protocol

1. הכנת אלקטרודות tBLMs

1. הכנת ציפוי מונו-שכבתי ראשון
   1. לטבול שקופית מיקרוסקופ אלקטרודה בדוגמת זהב טרי בתמיסה אתנולית המורכבת מיחס של 3 מ"מ 1:9 של בנזיל-דיסולפיד-טטרה-אתילנגליקול-OH מולקולות "ספייסר" (בנזיל דיסולפיד כללה מרווח של ארבע אתילן גליקול חמצן, שהסתיים בקבוצת OH) ובנזל-דיסולפיד (טטרה-אתילנגליקול) n = 2 מולקולות C20-phytanyl "קשורות". פעולה זו יוצרת את ציפוי השכבה הראשון שאליו ניתן לעגן דו-שכבתי.
      הערה: אלקטרודה הזהב נעשה על ידי אידוי 100 ננומטר, 99.9995% זהב (5n5 זהב) סרט על מותאם אישית 25 מ"מ x 75 מ"מ פוליקרבונט שקופיות²⁰.
   2. דגירה אלקטרודות עם השכבה הראשונה בטמפרטורת החדר לפחות 1 שעה.
   3. לשטוף את אלקטרודות הזהב על ידי טבילה בכמויות גדולות של אתנול טהור מעל 30 s.
   4. השתמש שקופית אלקטרודה זהב עם monolayer הראשון ישירות לשלב הבא או לאחסן בצנצנת מלאה אתנול טהור.
   5. הערה: כדי להבטיח את תקינות השכבה הראשונה, מזער כל מגע ישיר לחלקי הזהב של השקופית
2. הרכבת השקופית המצולמת הראשונה של השכבה המונו-שכבתית
   1. בזהירות לקחת שקופית אלקטרודה זהב coplanar אחד מן המיכל שלה באמצעות פינצטה, להיות בטוח לא ליצור קשר עם האזורים בדוגמת שבו tBLMs ייווצרו.
      הערה: שים לב לזהות את הצד של השקופית שעליה מופקד הזהב.
   2. החלקה יבשה באוויר במשך 1 - 2 דקות כדי להסיר כל אתנול שיורית.
   3. מניחים אלקטרודה מזהב על משטח יבש, ודאו שהאלקטרודה המוזהבת מכוונת כראוי עם משטח זהב בדוגמת פנים כלפי מעלה.
   4. מקלפים את שכבת הדבק השקופה מ למינציה דקה ומניחים מעל 6 הערוצים כדי להגדיר כל באר.
   5. השתמשו ברולר לחץ כדי לשחרר אוויר בין השקופית לשכבת הדבקה השקופה, כפי שמוצג באיור 1A.
      הערה: הזמן הנדרש עבור שלב זה יצטרך להיות מותאם על ידי החוקר. בפרוטוקול זה, הזמנים נעים בין 2-3 דקות.
   6. הציגו מיד עם המעשה (תוך 1-2 דקות) את דו-שכבתית השומנים השנייה לאלקטרודה המצולמת הראשונה של הקו המולייה הראשונה להרכבה עצמית כדי למנוע פגיעה בשכבה הראשונה.
3. הכנת דו-שכבתית שומנים שניה
   1. הוסף 6 μL של 3 mM שומנים של עניין לבאר הראשונה של שקופית שש בארות. אל תתנו לקצה קצה המיקרופיט לגעת במשטח הזהב, מה שעלול לפגוע בכימיה קשורה באלקטרודה.
      הערה: תערובת השומנים המשמשת בעבודה זו כללה 3 mM 70% zwitterionic C20 דיפיטניל-אתר-גלייצרו-פוספטידילכולין (DPEPC) ו 30% C20 דיפיטנילדיגליצריד אתר שומנים (GDPE) מעורבב עם 3 mM כולסטרול-PEG-ביוטין ביחס טוחנת 50:1.
   2. הצג 6 μL של תערובת השומנים לבארות האחרות עם פער של 10 s בין כל תוספת.
   3. לדגור כל באר בדיוק 2 דקות בטמפרטורת החדר לפני החלפת תערובת השומנים מעל האלקטרודות עם חוצץ כגון PBS. חלל את הזמנים עבור תוספת חילופי חיץ 10 s זה מזה, כך כל באר הוא דגירה עם השומנים במשך בדיוק 2 דקות כל אחד.
   4. לשטוף 3 פעמים נוספות עם 50 μL של חוצץ PBS (pH 7.0). הקפד להשאיר 50 μL של חוצץ מעל האלקטרודות בכל עת. אל תאפשר לאלקטרודות להתייבש.
      הערה: עקירת ממס האתנול עם הפתרון המ מימי בדרך זו (שיטת החלפת ממסים)מאפשרת היווצרות מהירה של bilayer שומנים יחיד מעוגן אלקטרודה הזהב באמצעות הכימיות קשורות.
4. בדיקת היווצרות tBLM באמצעות מדידות ספקטרוסקופיית מעיקה חשמלית (EIS)
   1. הכנס שקופית אלקטרודה מוכנה לספקטרומטר עקשת AC (למשל, טטפוד). ודא שהספקטרומטר מחובר באמצעות יציאת USB למחשב שבו פועלת התוכנה.
   2. פתח את התוכנה, לחץ על תוכנית ההתקנה ופתח חומרה.
   3. הגדר את הגדרות החומרה לשימוש בהתרגשות AC של 25 mV ממסך לשיא.
   4. הגדר תדרים בין 0.1 ל-10,000 הרץ עם שני שלבים לעשור לאמצעי עיקול מהירים לחץ על אישור.
   5. לחץ על תפריט התקנה ופתח את מודל.
   6. השתמש במודל מעגל שווה ערך המתאר את אלקטרודה הזהב הקוברת כאלמנט פאזה קבוע בסדרה עם נגד המתאר את מאגר האלקטרולים ורשת קבלי נגד מקבילה כדי לתאר את דוlayer השומנים, ולחץ על אישור.
   7. לחץ על לחצן התחל כדי להתחיל מדידה בזמן אמת של קיבוליות ממברנה (C_m)והולכת ממברנה (G_m). ערכי C_m של tBLMs טיפוסיים צריכים להיות בטווח של 12.5 nF עד 15.5 nF עבור 10% כימיה קשורה^21,22.
   8. לאחר הפעלת הפרוטוקול וסיים את הניסוי, שמור את הנתונים.
   9. חזור על המדידה עם הבאר הבאה.

2. הקרנת לייזר

1. התקנה ניסיונית
   הערה: המערכת המותאמת אישית מוגדרת עבור כל tBLM באר בנפרד.
   1. בצע ניסויים בקופסה חסינת אור כדי למזער את הלייזר בצורה מסוכנת.
   2. השתמש בטבלת אופטיקה כדי להגדיר את הניסוי כדי להפחית תנודות לא רצויות.
   3. מניחים את קורא העכבות, היכן מחוברת שקופית הזהב, על במת XYZ ומרוממים כך שהיא יושבת בנתיב של מקור הלייזר.
   4. השתמש בהילוך מיקרוסקופי ממוקד גס כדי לשלוט בגובה מקור הלייזר כדי להשיג את הדיוק המתאים.
   5. כוון לנתיב הלייזר לאורך ציר האורך של שקופית האלקטרודה.
      אזהרה: יש להרכיב תמיד משקפי בטיחות לייזר מתאימים ולשמור על פרוטוקולי בטיחות לייזר טובים.
   6. אפשר ללייזר המכוון שנבחר להתייצב לפני תחילת הניסוי.
      הערה: תרשים של ההתקנה הניסיונית מומחש באיור 2A.
2. יישור אלקטרודות לייזר וזהב
   הערה: לפני שתתחיל, תמיד להעריך את תפוקת כוח הלייזר באמצעות מד כוח כדי להבטיח רק וואט נמוך מאוד מועברים tBLMs.
   1. התאם את נתיב הלייזר או את זווית האלקטרודה כך שהלייזר יעבור דרך הנוזל המכסה את האלקטרודה והוא פשוט נראה, באופן שווה, על פני הזהב.
   2. התאם את מיקום האור של קרן הלייזר עבור כל ניסוי על ידי העלאת או הנמכה של מקור קרן הלייזר באמצעות ההתאמה העדינה תוך התבוננות בשינויים בהולכת הממברנה.
   3. נעל את הידית כדי לאבטח את המיקום של נתיב הלייזר כאשר אין שינויי מוליכות נצפים.
      הערה: ערכי מוליכות ממברנה מוגברת ייווצרו כאשר הלייזר אינטראקציה עם אלקטרודה הזהב הבסיסית. לכן חשוב להתאים את נתיב הלייזר כך שלא ניתן לקיים אינטראקציות כאלה.
3. הכנת דוגמה
   1. הכן את יישור האור של קרן הלייזר (כאשר אין שינוי במוליכת הממברנה), כפי שמוצג באיור 2, מיקום 3.
   2. הוסף GNPs של עניין (פונקציונלי או חשוף) למאגר PBS שבו tBLMs שקועים בזמן שהלייזר כבוי.
   3. מערבבים את חיץ ה- PBS המקיף את ה- tBLMs בעדינות שלוש פעמים, ונזהרים שלא לגעת באלקטרודה.
   4. דגירה במשך 5 -10 דקות בטמפרטורת החדר.
   5. הפעל את הלייזר כדי להקרין דגימה, תוך שימוש במצב האור הנכון של קרן הלייזר, כפי שניתן לראות באיור 2, מיקום 3.
   6. השתמש בשילוב המתאים של GNPs גודל, צורה וריכוז עם אורך גל אור לייזר.
      הערה: קרן הלייזר של אורך גל מוגדר צריך זוג לתדר תהודה פלסמון GNP המתאים.
   7. רשומה נמדדת בזרם ברציפות (מדידות בזמן אמת).
   8. בצע שלבים 2.2.1 - 2.3.7, השמטת תוספת GNP לניסויי הבקרה.

3. ניתוח נתונים סטטיסטיים והצגתם

1. יצא את הנתונים לגיליון אלקטרוני.
2. לחלץ את פרמטר מוליכות הממברנה לעומת זמן.
3. השתמש בנתונים המוקלטים לאחר הגדרת נורית קרן לייזר עם המיקום הנכון ולפני הצגת GNPs.
4. לנרמל נתונים על ידי חלוקת מוליכות הממברנה הנמדדת על מוליכות הממברנה הבסיסית.
   הערה: זה מאשר כי שינויים יחסיים בערכי מוליכת הממברנה שהוכנסו על ידי GNPs מוקרן הציג.
5. הצג נתונים כעלילות זמן (ציר x) לעומת מוליכת ממברנה מנורמלת (ציר y).

4. לחזות את כמות החום המקומי שנוצר ב- tBLMs מננו-חלקיקים מוקרן (מודל ניבוי תרמי)

1. לפתור את בעיית העברת הקרינה על פי דומברובסקי²³, על מנת לחשב כוח קרינה נספג בפתרונות ננו חלקיקים מוקרן.
2. חשב את ייצור החום על ידי שילוב מקור החום עקב קרינה נספגת במשוואת האנרגיה.
   הערה: להסבר מפורט על הניתוח המספרי של ייצור חום ב- tBLMs מננו-חלקיקים מוקרן וממשק ננו-חומרים-אלקטרודה, עיין ב - ¹⁹.

תוצאות

מצע הזהב שעליו ניתן ליצור tBLMs מוצג באיור 1. תרשים של ההתקנה הניסיונית מוצג באיור 2.

אלקטרודות זהב קופלנאר, כפי שמוצג באיור 1A,עשויות ממצע בסיס פוליקרבונט 25 מ"מ x 75 מ"מ x 1 מ"מ עם מערכי זהב בדוגמת דפוס. שכבת דבק שקופה מגדירה את ששת תאי ...

Discussion

פרוטוקול זה מתאר את השימוש במודל tBLM עם מצע אלקטרודה קופלנאר בשילוב עם יישור לייזר אופקי שהוקם המאפשר הקלטת עבלה חשמלית בזמן אמת בתגובה להקרנת לייזר של חלקיקי זהב. השיטה של הקלטת EIS המוצגת כאן בונה רשימה מינימלית של ניסויים הדרושים כדי לספק הקלטה של שינויים זרם יון על פני ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
30 nm diameter streptavidin-conjugated gold nanoparticles	Cytodiagnostics	AC-30-04-05	This is a streptavidin-conjugated GNPs product ready for use
30 nm diameter bare gold nanoparticles	Sigma-Aldrich	753629	This is a bare GNPs product ready for use
Cholesterol-PEG-Biotin (MW1000)	NANOCS	PG2-BNCS-10k	Dissolved in highly pure ethanol
C20 Diphytanyl-Glycero-Phosphatidylcholine lipids	SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.	SDx-S1	1 ml glass vial containing 70% C16 diphytanyl phosphatidylcholine (DPEPC) and 30% C16 diphytanyl glycerol (GDPE) in 99.9% ethanol
Benzyl-disulfide-tetra-ethyleneglycol-OH	SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.	SDx-S2	Spacer molecules
Benzyl-disulfide (tetra-ethyleneglycol) n=2 C20-phytanyl	SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.	SDx-S2	Tethered molecules
532 nm green laser continuous light	OBIS LS/OBIS CORE LS, China	ND-1000	The power of this laser was ~135 mW
tethaPod EIS reader	SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.	SDx-R1	A reader of conductance and capacitance on six channels simultaneously
tethaPlate cartridge assembly	SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.	SDx-BG	Materials to attach the slide with electrodes to the flow cell cartridge
Clamp and slide assembly jig	SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.	SDx-A1	Materials to attach the slide with electrodes to the flow cell cartridge
Lipid coated coplanar gold electrodes	SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.	SDx-T10	Coplanar  gold electrodes are made from 25 mm x 75 mm x 1 mm polycarbonate base substrate with patterned gold arrays layout, then coated with benzyldisulphide, bis-tetraethylene glycol C16 phytanyl half membrane spanning tethers in a tether ratio of 10%
tethaQuick software	SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.	SDx-B1	Software for use with tethaPod to process data and display conductance, impedance and capacitance measurements from the tethaPlate electrodes
99.9% Pure ethanol	Sigma-Aldrich	34963	Absolute,  99.9%
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417	pH 7