阿拉伯多普西斯局部和系统伤口信号的广域实时成像

摘要

细胞外谷氨酸触发的全身钙信号对于植物防御对植物机械伤害和食草动物攻击的反应至关重要。本文描述了一种使用 阿拉伯多普西斯塔利亚纳 植物表达钙和谷氨酸敏感荧光生物传感器来可视化这两种因素的空间和时间动力学的方法。

摘要

植物对机械应力（如伤害和食草）做出反应，在受损部位和未损坏部位诱导防御响应。叶子受伤后，伤口部位的细胞酸钙离子浓度（Ca²⁺ 信号）增加。此信号被快速传输到未损坏的叶子上，在那里防御响应被激活。我们最近的研究表明，谷氨酸从叶子的受伤细胞泄漏到它们周围的凋亡作为伤口信号。这种谷氨酸激活谷氨酸受体般的Ca²⁺ 渗透通道，然后导致长途Ca²⁺ 信号在整个植物中传播。这些事件的空间和时间特征可以通过实时成像来捕捉表达基因编码荧光生物传感器的活植物。在这里，我们引入了全厂实时成像方法，以监测 Ca²⁺ 信号的动态以及因受伤而发生的可塑性谷氨酸变化。这种方法使用广域荧光显微镜和转基因 阿拉伯多普西植物 表达绿色荧光蛋白（GFP）为基础的Ca²⁺ 和谷氨酸生物传感器。此外，我们提出的方法，以容易引起伤口诱导，谷氨酸触发的快速和远距离Ca²⁺ 信号传播。该协议还可用于其他植物应力的研究，以帮助调查植物系统信号可能如何参与其信号和响应网络。

引言

植物无法摆脱生物应力，例如，以它们为食的昆虫，因此它们已经进化出复杂的应力感应和信号转导系统来检测，然后保护自己免受诸如食草动物¹这样的挑战。在受伤或食草动物攻击时，植物会启动快速防御反应，包括植物激素茉莉酸（JA）的积累，不仅在受伤部位，而且在未损坏的解剖器官^2。然后，此 JA 都会触发直接受损组织的防御响应，并先发制人地在植物未损坏的部分诱导防御。在阿拉伯多普西斯，在植物其他地方的损伤后几分钟内，就检测到由伤痕引起的JA积累，这说明从^{受伤的叶3}中传输了快速和远距离的信号。一些候选者，如^Ca2+，活性氧物种（ROS）和电信号，已被建议作为这些远程伤口信号在植物^4，5。

Ca²⁺是真核生物中最通用和无处不在的第二信使元素之一。在植物中，毛毛虫咀嚼和机械伤害导致细胞溶胶Ca²⁺浓度（[Ca^2]_细胞）在受伤的叶子和未缠绕的远处叶^6，7急剧增加。此系统 Ca²⁺信号由细胞内 Ca²⁺感应蛋白接收，导致下游防御信号通路（包括 JA 生物合成 8^、9）的激活。尽管许多此类报告支持Ca²⁺信号在植物伤口反应中的重要性，但关于Ca²⁺信号的空间和时间特征的信息有限。

使用基因编码的 Ca²⁺指示器进行实时成像是监控和量化 Ca²⁺信号的空间和时间动态的强大工具。迄今为止，已经开发出这种传感器的版本，使Ca²⁺信号在单个细胞的水平，组织，器官，甚至整个植物¹⁰的可视化。在植物中用于Ca²⁺的第一个基因编码生物传感器是来自水母Eequorea维多利亚¹¹的生物发光蛋白 aquorin。虽然这种化疗蛋白已被用于检测Ca²⁺的变化，以响应植物的各种应力12，13，14，15，16，17，18，它不适合实时成像，因为它产生的极低的发光信号。基于 Fürster 共振能量转移 （FRET） 的Ca²⁺指标（如黄骆驼）也已成功用于调查^{19、20、21、22、23、24}工厂中一系列 Ca²⁺信号事件的动态。这些传感器与成像方法兼容，最常见的是由来自肌素光链激酶的Ca²⁺结合蛋白（CAM）和CAM结合肽（M13）组成，全部融合在两种荧光蛋白之间，通常是青色荧光蛋白（CFP）和黄色荧光蛋白变种（YFP）10。Ca²⁺与 CaM 的绑定可促进 CAM 和 M13 之间的交互，从而导致传感器的构象更改。这一变化促进了 CFP 和 YFP 之间的能量转移，这增加了 YFP 的荧光强度，同时减少了 CFP 的荧光排放。监控从 CFP 到 YFP 荧光的这种转变，然后提供 Ca²⁺水平增加的度量。除了这些FRET传感器，单荧光蛋白（FP）为基础的Ca²⁺生物传感器，如GCaMP和R-GECO，也与植物成像方法兼容，并广泛用于研究[Ca^2+]_细胞的变化，由于其高灵敏度和易用性25，26，27，28，29，30。GCAMP 包含单个圆形排列 （cp） GFP，再次融合到 CaM 和 M13 肽中。CaM 和 M13 之间的 Ca²⁺依赖互导致传感器的构象变化，从而促进 cpGFP 质子状态的改变，增强其荧光信号。因此，随着 Ca²⁺级别的上升，cpGFP 信号会增加。

为了研究Ca²⁺信号的动态，以响应机械伤害或食草动物喂养，我们使用了转基因阿拉比多普西塔利亚纳植物表达GCaMP变种，GCaMP3，和广域荧光显微镜^6。这种方法成功地可视化从叶子上的伤口部位到整个工厂的长途Ca²⁺信号的快速传输。因此，在伤口部位立即检测到 [Ca^2]_细胞的增加，但随后在受伤后几分钟内通过血管向邻近的叶子传播此 Ca²⁺信号。此外，我们发现，这种快速全身伤口信号的传输在阿拉伯多皮西斯植物中被废除，在两个谷氨酸受体样基因，谷氨酸受体喜欢（GLR）， GLR3.3和GLR3.6 6突变.GLR似乎作为氨基酸门卡²⁺通道参与不同的生理过程，包括伤口反应^3，花粉管生长^31，根发育^32，冷反应^33，和先天免疫^34。尽管GLR具有这种广为人知的、广泛的生理功能，但有关其功能特性的信息，如配体特异性、离子选择性和亚细胞定位，^{是有限的。}然而，最近的研究表明，GLR3.3和GLR3.6分别在胶合板和二甲苯中本地化。植物GLR与哺乳动物的电电性谷氨酸受体（iGlluRs）36有相似之处，后者由氨基酸激活，如谷氨酸、甘氨酸和D-塞林在哺乳动物神经系统^37。事实上，我们证明，在伤口部位应用100m谷氨酸，但不是其他氨基酸，在阿拉伯多维西斯诱导一个快速的长途Ca²⁺信号，表明细胞外谷氨酸可能作为伤口信号在植物^6。这种反应在glr3.3/glr3.6突变体中被废除，这表明谷氨酸可能通过其中一个或两个受体样通道起作用，事实上，AtGL3.6最近被这些水平的谷氨酸³⁸所封闭。

在植物中，除了其作为结构氨基酸的作用外，谷氨酸还被提议为关键的发育调节器^39:然而，其空间和时间动态却鲜为人知。正如Ca^2+，已经开发出几个基因编码的谷氨酸指标，以监测这种氨基酸在活细胞^40，41的动态。iGluSnFR是一种基于GFP的单FP谷氨酸生物传感器，由cpGFP和来自埃斯切里西亚大肠杆菌^42，43的谷氨酸结合蛋白（GltI）组成。由谷氨酸与 GltI 结合引起的 iGluSnFR 的构象变化导致 GFP 荧光排放增强。为了调查细胞外谷氨酸是否在植物伤口反应中起到信号分子的作用，我们将 iGluSnFR 序列与基本的奇蒂纳塞信号肽分泌序列 （CHIB-iGluSnFR） 连接起来，以便在肿瘤空间⁶中本地化这种生物传感器。这种方法使使用表达此传感器的转基因阿拉伯多普西斯植物能够成像丙酮谷氨酸浓度（[Glu]_apo）的任何变化。我们检测到受伤现场的 iGluSnFR 信号迅速增加。这些数据支持了谷氨酸在受伤时从受损的细胞/组织泄漏到凋亡者的想法，并充当激活GLR的损伤信号，并导致^植物6中的长途Ca²⁺信号。

在这里，我们描述了一种全植物的实时成像方法，使用基因编码的生物传感器来监测和分析长途Ca²⁺ 和细胞外谷氨酸信号的动态，以回应伤害^6。宽场荧光显微镜和转基因植物表达基因编码的生物传感器提供了一个强大但易于实施的方法来检测快速传输的远距离信号，如Ca²⁺ 波。

研究方案

1. 植物材料制备

1. 在1.5 mL微管中，表面用20%（v/v）NaClO摇动3分钟，然后用无菌蒸馏水清洗5次，对 阿拉伯多普西斯塔利亚纳 （Col-0加入）植物的种子进行消毒，表达GCaMP3或CHIB-iGlusnFR。
   注:阿拉伯多普西斯表达GCaMP3或CHIB-iGluSnFR的转基因线已经描述过前^6。
2. 在无菌罩中，在装满 30 mL 无菌（自动切割）Murashige 和 Skoog （MS） 介质 [1 倍 MS 盐] 的 10 厘米方形塑料培养皿上播种 13 个表面消毒种子， 1% （w/v） 蔗糖， 0.01% （w/v） 肌醇， 0.05% （w/v） MES 和 0.5% （w/v） 胶质胶; pH 5.7 调整与 1N KOH].更换盖子，用手术胶带包裹。
3. 在黑暗中潜伏4°C2天后，将板水平置于连续光下的生长室中的22°C（90-100微米^-2-1），在使用前约2周。2周后，数一数阿拉伯树叶的数量，从最老到最小的^44（图1）。伤口反应优先从受损的叶子 （n） 移动到编号为 n 的叶子± 3 和 n ± 5⁶。
   注:在此协议中，Petri 盘将被打开，用于在荧光显微镜下对伤口和谷氨酸效果进行成像。因此，本实验的后续步骤应在温度和湿度控制的房间条件下进行。这是因为 Ca²⁺ 信号也因这些环境条件的变化而引起。另据了解，在记录生物传感器蛋白荧光激发过程中从显微镜中发出的蓝光可能会导致细胞溶胶 Ca²⁺ 浓度⁴⁵ 的增加，因此植物应在开始实验前适应蓝光辐照几分钟。

2. 化学制备

1. 溶解L-谷氨酸在液体生长介质 [1/2 倍 MS 盐， 1% （w/v） 蔗糖和 0.05% （w/v） MES; pH 5.1 调整与 1N KOH] 使 100 mM 工作解决方案.
   注意:避免使用谷氨酸盐，如谷氨酸钠，以防止潜在的与酸化相关的影响，Ca²⁺ 动力学。

3. 显微镜设置和进行实时成像

1. 打开配备 1 倍目标镜头 （NA = 0.156） 和 sCMOS 相机 （图 2）的电动荧光立体显微镜，并配置设备设置，以 470/40 nm 激发光进行辐照，并获取通过 535/50 nm 滤光器的发射灯。
   注:任何 GFP 敏感荧光显微镜均可用于实时检测 GCaMP3 和 iGluSnFR 信号，但建议使用宽 SCMOS 芯片的低功耗目标镜头和高度敏感的摄像头从整个工厂获取信号。低功率目标允许成像整个 阿拉伯多普西斯 工厂的反应，并使用高度敏感的摄像头允许快速数据采集所需的捕捉伤口触发的Ca²⁺ 波的快速时间过程。对于本研究中使用的荧光显微镜，视场和时间分辨率的最大值分别为每秒 3 厘米 x 3 厘米和 30 帧（fps）。
2. 取下盖子，将盘子放在客观镜头下。
3. 检查植物的荧光信号，然后在黑暗中等待约30分钟，直到植物适应新的环境条件。需要这个适应步骤，因为湿度的变化会导致植物的细胞高程[Ca^2+]，这些_细胞 升高会干扰任何与伤口相关的事件。
4. 调整焦点和放大倍数，查看整个工厂的视野。在当前协议中，使用了 0.63 倍的放大倍数。
5. 在开始实时成像之前，使用显微镜成像软件设置采集参数来检测荧光信号。当前协议中的成像设置为:曝光和间隔时间分别设置为 1.8 s 和 2 s（即 0.5 fps）。将录制时间设置为 11 分钟。
6. 在开始实验之前，图像为 5 分钟，以便将工厂适应显微镜的蓝光照射，然后通过单击 "立即运行"或正在使用的显微镜软件中的等效命令开始录制。要确定平均基线荧光，请在伤害或谷氨酸应用之前记录至少 10 帧（即当前协议中至少 20 帧）（见第 4 节）。
   1. 要实时成像伤口引起的 [Ca^2]_细胞和 [Glu]_apo变化，请用剪刀切割叶 L1 的娇小或中间区域（图3和图 4）。
   2. 要实时成像谷氨酸触发 [Ca^2]_细胞变化，用剪刀将叶 1 的边缘（约 1 mm 从尖端切开）切过主静脉。至少20分钟恢复期后，将10微升的100m谷氨酸涂抹在叶子的切面上（图5）。
      注意:这种预切是必要的，使谷氨酸进入叶凋亡，以触发反应。此外，在叶 L1 的切口表面涂抹一滴蒸馏水对于防止样品在施用谷氨酸之前在回收过程中干燥至关重要。
7. 完成 11 分钟录制后，保存数据。

4. 数据分析

1. 对于荧光强度分析，定义要分析荧光强度的地方的兴趣区域 （ROI）（图 6 和 图 7）。有关 Ca²⁺ 波的速度计算，定义 2 个投资回报率 （ROI1 和 ROI2） 以进行分析。在成像软件中，单击 时间测量|定义|圆圈。通过单击 注释和测量|来测量 ROI1 和 ROI2 之间的距离长度|简单行 （图 6）。
2. 通过单击" 量度"来测量每个投资回报率中的原始荧光值 （F）。将原始数据导出到电子表格软件，通过单击"全部"到Excel，将荧光信号转换为每个时间点 的数字，从而|出口。
3. 通过计算记录数据中前 10 帧（即治疗前）的 F 平均值来确定基线荧光值（定义为 F_0）。
4. 使用方程ΔF/F = （F −F_{0）/F 0}使 F 数据正常化（通过计算ΔF/F），其中ΔF是荧光时间依赖的变化。
5. 对于 Ca²⁺ 波速波分析，使用使用统计软件从 F 0 数据计算的标准偏差 （2 倍 SD） 中，使用上升到² ×标准偏差 （2x SD） 的标准值，定义为表示每个投资回报率（t₁ 和 t_2）中的 Ca₂ + 增加的检测。95% 的 F₀ 数据低于平均值的 2 倍 SD，表明超过此级别的信号偶然上升≤5%。计算 ROI1 和 ROI2 之间 Ca²⁺ 增加的时差[t₂- t₁ 时差（Δt）]，测量 ROI1 和 ROI2 之间的距离，然后确定任何 Ca^{2 +} 波的速度。

结果

[Ca^2]_细胞和 [Glu]_apo的信号传播，以回应伤害，呈现在图 3，图 4，电影S1和电影 S2.在表达 GCaMP3 （在 0s） 的植物中切割叶 1 的娇小导致 [Ca^2]细胞显著增加，这些_细胞通过血管（40s） （图 3和电影S1）在当地迅速诱发。随后，信号?...

讨论

系统信号对于植物响应局部外部环境刺激，然后在整个工厂水平上保持其平衡非常重要。虽然他们没有配备像动物这样的高级神经系统，但他们根据移动电气（可能还有液压）信号和ROS和Ca^2+46，47的传播波等因素，在器官内部和器官之间使用快速通信。上述协议允许通过监测Ca²⁺和可塑性谷氨酸的动态来对该信号系统的活动进行全厂实时?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Arabidopsis expressing GCaMP3	Saitama University
Arabidopsis expressing CHIB-iGluSnFR	Saitama University
GraphPad Prism 7	GraphPad Software
L-Glutamate	FUJIFILM Wako	072-00501	Dissolved in a liquid growth medium [1/2x MS salts, 1% (w/v) sucrose, and 0.05% (w/v) MES; pH 5.1 adjusted with 1N KOH].
Microsoft Excel	Microsoft Corporation
Murashige and Skoog (MS) medium	FUJIFILM Wako	392-00591	composition: 1x MS salts, 1% (w/v) sucrose, 0.01% (w/v) myoinositol, 0.05% (w/v) MES, and 0.5% (w/v) gellan gum; pH 5.7 adjusted with 1N KOH.
Nikon SMZ25 stereomicroscope	Nikon
NIS-Elements AR analysis	Nikon
1x objective lens (P2-SHR PLAN APO)	Nikon
sCMOS camera (ORCA-Flash4.0 V2)	Hamamatsu Photonics	C11440-22CU
Square plastic Petri dish	Simport	D210-16