Wide-Field, Imágenes en tiempo real de señales de heridas locales y sistémicas en Arabidopsis

Resumen

Extracelular glutamato desencadenado por la señalización sistémica de calcio es fundamental para la inducción de las respuestas de defensa de las plantas a las heridas mecánicas y ataques de herbívoros en las plantas. Este artículo describe un método para visualizar la dinámica espacial y temporal de ambos estos factores usando las plantas del thaliana de Arabidopsis que expresan los biosensores fluorescentes calcio y glutamato-sensibles.

Resumen

Las plantas responden a tensiones mecánicas como heridas y herbívoros induciendo respuestas de defensa tanto en las partes dañadas como en las distales no dañadas. Sobre herir de una hoja, un aumento en la concentración cytosolic del ion del calcio (señal de Ca²⁺⁾ ocurre en el sitio de la herida. Esta señal se transmite rápidamente a las hojas no dañadas, donde se activan las respuestas de defensa. Nuestra investigación reciente reveló que el glutamato que se escapa de las células heridas de la hoja en el apoplasto alrededor de ellos sirve como señal de la herida. Este glutamato activa los canales permeables de Ca²⁺ similares a los receptores de glutamato, lo que luego conduce a la propagación de señales de Ca²⁺ a larga distancia en toda la planta. Las características espaciales y temporales de estos eventos se pueden capturar con imágenes en tiempo real de plantas vivas que expresan biosensores fluorescentes codificados genéticamente. Aquí introducimos un método planta-ancho, en tiempo real de la proyección de imagen para supervisar la dinámica de las señales de Ca²⁺ y de los cambios en el glutamato apoplásico que ocurren en respuesta a herir. Este enfoque utiliza un microscopio de fluorescencia de campo amplio y plantas transgénicas de Arabidopsis que expresan proteína verde fluorescente (GFP)-basado en Ca^{2 +} y biosensores de glutamato. Además, presentamos la metodología para provocar fácilmente herida-inducida, glutamato-accionado rápido y a larga distancia Ca²⁺ propagación de la señal. Este protocolo también se puede aplicar a estudios sobre otras tensiones de plantas para ayudar a investigar cómo la señalización sistémica de la planta podría estar involucrada en sus redes de señalización y respuesta.

Introducción

Las plantas no pueden escapar de las tensiones bióticas, por ejemplo, los insectos que se alimentan de ellas, por lo que han desarrollado sofisticados sistemas de detección de estrés y transducción de señales para detectar y luego protegerse de desafíos como la herbivoría^1. Al herir o atacar a los herbívoros, las plantas inician respuestas de defensa rápidas, incluida la acumulación del ácido fitohormona jasmónico (JA) no sólo en el sitio herido, sino también en los órganos distales no dañados^2. Este JA entonces ambos acciona respuestas de la defensa en los tejidos directamente dañados e induce preventivamente defensas en las partes no dañadas de la planta. En Arabidopsis,la acumulación de JA inducida por heridas se detectó en hojas distales e intactas a los pocos minutos del daño en otra parte de la planta, lo que sugiere que se está transmitiendo una señal rápida y a larga distancia desde la hoja herida^3. Varios candidatos, tales como Ca^2+,especies reactivas de oxígeno (ROS), y señales eléctricas, se han propuesto para servir como estas señales de heridas de larga distancia en las plantas^4,5.

Ca²⁺ es uno de los elementos de segundo mensajero más versátiles y ubicuos en los organismos eucariotas. En las plantas, la masticación de orugas y las heridas mecánicas causan aumentos drásticos en la concentración citosólica de Ca²⁺ ([Ca²⁺]_cyt)tanto en la hoja herida como en las hojas distantes desenrolladas^6,7. Esta señal sistémica de Ca²⁺ es recibida por proteínas intracelulares de detección de Ca^2+,que conducen a la activación de las vías de señalización de defensa aguas abajo, incluida la biosíntesis de JA^8,9. A pesar de los informes numerosos tales que apoyan la importancia de las señales de Ca²⁺ en respuestas de la herida de la planta, la información sobre las características espaciales y temporales de las señales de Ca²⁺ inducidas por herir es limitada.

Las imágenes en tiempo real utilizando indicadores de Ca²⁺ codificados genéticamente son una herramienta poderosa para monitorear y cuantificar la dinámica espacial y temporal de las señales de Ca^2+. Hasta la fecha, se han desarrollado versiones de dichos sensores que permiten la visualización de señales de Ca²⁺ a nivel de una sola célula, a tejidos, órganos e incluso plantas enteras^10. El primer biosensor codificado genéticamente para Ca²⁺ utilizado en plantas fue la proteína bioluminiscente aequorina derivada de la medusa Aequorea victoria^11. Aunque esta proteína quimioluminiscente se ha utilizado para detectar cambios de Ca²⁺ en respuesta a diversas tensiones en plantas^{12,13, 14,15, 16,17, 18,}no es adecuada para imágenes en tiempo real debido a la señal luminiscente extremadamente baja que produce. Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-basado en indicadores de Ca^{2 +,} tales como los cameleons amarillos, también se han utilizado con éxito para investigar la dinámica de una gama de eventos de señalización de Ca^{2 +} en las plantas^{19,20,21,22,23,24}. Estos sensores son compatibles con los enfoques de imagen y más comúnmente están compuestos por la proteína de unión a Ca²⁺ calmodulina (CaM) y un péptido de unión a CaM (M13) de una quinasa de cadena ligera de miosina, todos fusionados entre dos proteínas fluoróforas, generalmente una proteína fluorescente cian (CFP) y una variante de proteína fluorescente amarilla (YFP)^10. La unión de Ca²⁺ a CaM promueve la interacción entre CaM y M13, lo que lleva a un cambio conformacional del sensor. Este cambio promueve la transferencia de energía entre el CFP y el YFP, lo que aumenta la intensidad de fluorescencia del YFP al tiempo que disminuye la emisión de fluorescencia del CFP. El monitoreo de este cambio de CFP a fluorescencia YFP entonces proporciona una medida del aumento en el nivel de Ca² +. Además de estos sensores FRET, los biosensores ca²⁺ basados en proteínas fluorescentes individuales (FP), como GCaMP y R-GECO, también son compatibles con los enfoques de imágenes de plantas y se utilizan ampliamente para estudiar los cambios_{de ci cyt} [Ca²⁺] debido a su alta sensibilidad y facilidad de uso^{25,26,27,28,29,30.} GCaMPs contiene un solo circular permutated (cp) GFP, otra vez fusionado a CaM y el péptido M13. La interacción dependiente de Ca²⁺entre CaM y M13 provoca un cambio conformacional en el sensor que promueve un cambio en el estado de protonación del cpGFP, potenciando su señal fluorescente. Por lo tanto, a medida que aumentan los niveles de Ca² +, la señal cpGFP aumenta.

Para investigar la dinámica de las señales de Ca^{2 +} generadas en respuesta a heridas mecánicas o alimentación de herbívoros, hemos utilizado plantas transgénicas de Arabidopsis thaliana que expresan una variante de GCaMP, GCaMP3, y un microscopio de fluorescencia de campo ancho^6. Este enfoque ha tenido éxito en la visualización de la transmisión rápida de una señal de Ca^{2 +} de larga distancia desde el sitio de la herida en una hoja a toda la planta. Así, un aumento en [Ca²⁺]_cyt fue detectado inmediatamente en el sitio de la herida pero esta señal de Ca²⁺ entonces fue propagada a las hojas vecinas a través de la vasculatura dentro de algunos minutos de herir. Además, encontramos que la transmisión de esta señal de herida sistémica rápida se suprime en plantas de Arabidopsis con mutaciones en dos genes similares a receptores de glutamato, Glutamato Receptor Like (GLR), GLR3.3, y GLR3.6^6. Los GLRs parecen funcionar como canales de Ca²⁺ bloqueados por aminoácidos involucrados en diversos procesos fisiológicos, incluyendo la respuesta de la herida^3,el crecimiento del tubo de polen^31,el desarrollo de la raíz^32,la respuesta fría³³y la inmunidad innata^34. A pesar de esta función fisiológica amplia y bien entendida de los GLRs, la información sobre sus propiedades funcionales, como su especificidad de ligando, selectividad iónica y localización subcelular, es limitada^35. Sin embargo, estudios recientes informaron que GLR3.3 y GLR3.6 están localizados en el floema y el xilema, respectivamente. Los GLRs de plantas tienen similitudes con los receptores ionotrópicos de glutamato (iGluRs)³⁶ en mamíferos, que son activados por aminoácidos, como el glutamato, la glicina y la D-serina en el sistema nervioso de los mamíferos³⁷. De hecho, demostramos que la aplicación de glutamato de 100 mM, pero no de otros aminoácidos, en el sitio de la herida induce una señal rápida y a larga distancia de Ca²⁺ en Arabidopsis,lo que indica que el glutamato extracelular probablemente actúa como una señal de herida en las plantas^6. Esta respuesta se suprime en el mutante glr3.3/glr3.6sugiriendo que el glutamato puede estar actuando a través de uno o ambos de estos canales similares a receptores y, de hecho, AtGLR3.6 recientemente se demostró que está bloqueado por estos niveles de glutamato^38.

En las plantas, además de su papel como aminoácido estructural, el glutamato también se ha propuesto como un regulador clave del desarrollo³⁹; sin embargo, su dinámica espacial y temporal es poco conocida. Al igual que para el Ca^2+,se han desarrollado varios indicadores genéticamente codificados para el glutamato para monitorizar la dinámica de este aminoácido en células vivas^40,41. iGluSnFR es un biosensor de glutamato de fp único basado en GFP compuesto por cpGFP y una proteína de unión a glutamato (GltI) de Escherichia coli^42,43. El cambio conformacional de iGluSnFR, que es inducido por la unión de glutamato a GltI, resulta en una emisión de fluorescencia GFP mejorada. Para investigar si el glutamato extracelular actúa como molécula de señalización en la respuesta de la herida de la planta, conectamos la secuencia de iGluSnFR con la secuencia básica de secreción de péptidos de señal quitinasa (CHIB-iGluSnFR) para localizar este biosensor en el espacio apóplásico^6. Este acercamiento permitió la proyección de imagen de cualquier cambio en la concentración apoplástica del glutamato ([Glu]_apo)usando las plantas transgénicas de Arabidopsis que expresaban este sensor. Detectamos aumentos rápidos en la señal del iGluSnFR en el sitio que hería. Estos datos apoyan la idea de que el glutamato se escapa de las células/tejidos dañados al apoplasto al herir y actúa como una señal de daño que activa los GLRs y conduce a la señal de Ca²⁺ de larga distancia en las plantas⁶.

Aquí, describimos un método de imágenes en tiempo real en toda la planta utilizando biosensores codificados genéticamente para monitorear y analizar la dinámica de ca^{2 +} de larga distancia y señales de glutamato extracelular en respuesta a la herida⁶. La disponibilidad de microscopía de fluorescencia de campo amplio y plantas transgénicas que expresan biosensores codificados genéticamente proporciona un enfoque potente, pero fácil de implementar para detectar señales de larga distancia transmitidas rápidamente, como las ondas ca^{2 +.}

Protocolo

1. Preparación de material vegetal

1. En un microtubo de 1,5 mL, esterilizar en superficie las semillas de arabidopsis thaliana (col-0 accesión) planta que expresa ya sea GCaMP3 o CHIB-iGluSnFR agitando con 20% (v / v) NaClO durante 3 min y luego lavar 5 veces con agua destilada estéril.
   NOTA: Las líneas transgénicas de Arabidopsis que expresan GCaMP3 o CHIB-iGluSnFR han sido descritas^{previamente 6.}
2. En una capucha estéril, siembre 13 semillas esterilizadas en superficie en una placa de Petri de plástico cuadrada de 10 cm llena de 30 mL de murashige estéril (autoclave) y medio Skoog (MS) [1x sales ms, 1% (p/v) sacarosa, 0,01% (p/v) myoinositol, 0,05% (p/v) MES y 0,5% (p/v) goma gellan; pH 5,7 ajustado con 1N KOH]. Substituya la tapa y envuelva con cinta quirúrgica.
3. Después de la incubación en la oscuridad a 4 °C durante 2 días, colocar las placas horizontalmente a 22 °C en una cámara de crecimiento bajo luz continua (90-100 μmol m^-2 s^-1) durante aproximadamente 2 semanas antes de su uso. Después de 2 semanas, cuente el número de hojas de Arabidopsis de mayor a^{menor 44} (Figura 1). Las respuestas de la herida se desplazan preferentemente de la hoja dañada (n) a las hojas numeradas n ± 3 y n ± 5⁶.
   NOTA: En este protocolo, la placa de Petri se abrirá para obtener imágenes de los efectos de la herida y el glutamato bajo un microscopio de fluorescencia. Por lo tanto, los pasos posteriores de este experimento deben llevarse a cabo en condiciones ambiente controladas por temperatura y humedad. Esto se debe a que las señales de Ca²⁺ también son provocadas por cambios en estas condiciones ambientales. También se sabe que la luz azul, emitida por el microscopio durante el registro para la excitación de la fluorescencia de la proteína biosensor, puede provocar un aumento de la concentración citosólica de Ca^{2 + 45} y por lo tanto la planta debe aclimatarse a la irradiación de luz azul durante varios minutos antes de comenzar el experimento.

2. Preparación química

1. Disuelva el L-glutamato en un medio de crecimiento líquido [1/2x sales ms, 1% (p/v) sacarosa y 0,05% (p/v) MES; pH 5,1 ajustado con 1N KOH] para hacer una solución de trabajo de 100 mM.
   NOTA: Evite el uso de sales de glutamato como el glutamato de sodio para prevenir posibles efectos relacionados con cationes sobre la dinámica de Ca² +.

3. Ajuste del microscopio y realización de imágenes en tiempo real

1. Encienda el estereomicroscopio de fluorescencia motorizado equipado con una lente objetivo 1x (NA = 0,156) y una cámara sCMOS (Figura 2) y configure los ajustes del dispositivo para irradiar con una luz de excitación de 470/40 nm y adquirir una luz de emisión que pase a través de un filtro de 535/50 nm.
   NOTA: Cualquier microscopio de fluorescencia sensible a GFP se puede utilizar para detectar señales GCaMP3 e iGluSnFR en tiempo real, pero se recomienda una lente objetivo de baja potencia y una cámara altamente sensible con un chip sCMOS ancho para adquirir señales de toda la planta. El objetivo de baja potencia permite la obtención de imágenes de la respuesta de toda una planta de Arabidopsis y el uso de una cámara altamente sensible permite la rápida adquisición de datos necesaria para capturar el rápido curso de tiempo de la onda de Ca^{2 +} activada por heridas. Para el microscopio de fluorescencia utilizado en este estudio, los valores máximos del campo de visión y la resolución temporal son de 3 cm x 3 cm y 30 cuadros por segundo (fps), respectivamente.
2. Retire la tapa y coloque el plato debajo de la lente objetivo.
3. Compruebe la señal de fluorescencia de la planta y luego espere aproximadamente 30 minutos en la oscuridad hasta que las plantas se adapten a las nuevas condiciones ambientales. Este paso de adaptación es necesario porque los cambios en la humedad provocan [Ca^{2 +}]_{elevación cyt} en las plantas que pueden interferir con cualquier evento relacionado con la herida.
4. Ajuste el enfoque y la ampliación para ver toda la planta en el campo de visión. En el protocolo actual, se utilizó un aumento de 0,63x.
5. Antes de comenzar las imágenes en tiempo real, configure los parámetros de adquisición para detectar las señales de fluorescencia utilizando el software de imágenes de microscopio. Los ajustes para la proyección de imagen en el protocolo actual son: tiempos de la exposición y del intervalo fijados a 1.8 s y 2 s (es decir, 0.5 fps), respectivamente. Establezca el tiempo de grabación en 11 min.
6. Imagen durante 5 minutos antes de comenzar el experimento para aclimatar la planta a la irradiación de luz azul del microscopio, luego comience a grabar haciendo clic en Ejecutar ahora,o el comando equivalente en el software de microscopio que se está utilizando. Para determinar la fluorescencia basal promedio, registre al menos 10 fotogramas (es decir, al menos 20 s en el protocolo actual) antes de la herida o la aplicación de glutamato (consulte la Sección 4).
   1. Para obtener imágenes en tiempo real de los cambios_{de cyt} y [Glu]_apo inducidos por heridas [Ca^2+],corte el pecíolo o la región media de la hoja L1 con tijeras (Figura 3 y Figura 4).
   2. Para obtener imágenes en tiempo real de los cambios_{de cyt} desencadenados por glutamato [Ca^2+],corte el borde (aproximadamente 1 mm de la punta) de la hoja 1 a través de la vena principal con tijeras. Después de al menos un período de recuperación de 20 min, aplique 10 μL de glutamato de 100 mM a la superficie de corte de la hoja (Figura 5).
      NOTA: Este pre-corte fue necesario para permitir el acceso del glutamato al apoplasto de la hoja con el fin de desencadenar respuestas. Además, se encontró que la aplicación de una gota de agua destilada a la superficie de corte de la hoja L1 era crítica para evitar que las muestras se desecaran durante la recuperación antes de aplicar glutamato.
7. Después de terminar la grabación de 11 minutos, guarde los datos.

4. Análisis de datos

1. Para el análisis de la intensidad de fluorescencia a lo largo del tiempo, defina una región de interés (ROI) en el lugar donde se va a analizar la intensidad de fluorescencia (Figura 6 y Figura 7). Para el cálculo de la velocidad de la onda Ca^2+, defina 2 ROI (ROI1 y ROI2) para el análisis. En el software de imágenes, haga clic en Medición de tiempo | Definir | Círculo. Mida la distancia entre ROI1 y ROI2 haciendo clic en Anotaciones y | Longitud | Línea simple (Figura 6).
2. Mida los valores de fluorescencia sin procesar (F) en cada ROI a lo largo del tiempo haciendo clic en Medir. Exportar datos sin procesar a un software de hoja de cálculo para convertir la señal de fluorescencia en números en cada punto de tiempo haciendo clic en Todo a Excel | Exportar.
3. Determine el valor de fluorescencia basal, que se define como F_0,calculando el promedio de F durante los primeros 10 fotogramas (es decir, antes del tratamiento) en los datos registrados.
4. Normalice los datos de F (calculando ΔF/F) usando la ecuación ΔF/F = (F−F₀)/F₀, donde ΔF es el cambio dependiente del tiempo en fluorescencia.
5. Para el análisis de onda de velocidad de onda de Ca^2+, defina un punto de ascenso de señal significativo por encima de los valores preestimulados como representación de la detección de un aumento de Ca²⁺ en cada ROI(t₁ y t₂₎utilizando el criterio de un aumento a 2× la desviación estándar (2x SD) que se calcula a partir de los datos de F₀ utilizando software estadístico. El 95% de los datos de F₀ se encuentra dentro de 2x SD de la media, lo que indica que un aumento de la señal por encima de este nivel por casualidad es ≤5%. Calcule la diferencia de tiempo del aumento de Ca²⁺ entre ROI1 y ROI2 [t₂- t₁ time-lag (Δt)] y mida la distancia entre ROI1 y ROI2, luego determine las velocidades de cualquier onda de Ca^2+.

Resultados

La propagación de la señal de [Ca²⁺]_cyt y [Glu]_apo en respuesta a la herida se presenta en la Figura 3, figura 4, película S1y película S2. El corte del pecíolo de la hoja 1 en plantas que expresan GCaMP3 (a 0 s) llevó a un aumento significativo de [Ca²⁺]_cyt que fue rápidamente inducido localmente a través de la vasculatura (a los 40 ...

Discusión

La señalización sistémica es importante para que las plantas respondan a estímulos ambientales externos localizados y luego mantengan su homeostasis a nivel de toda la planta. Aunque no están equipados con un sistema nervioso avanzado como los animales, emplean una comunicación rápida tanto dentro como entre órganos basados en factores como las señales eléctricas móviles (y posiblemente hidráulicas) y las ondas de propagación de ROS y Ca^2+46,47....

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Arabidopsis expressing GCaMP3	Saitama University
Arabidopsis expressing CHIB-iGluSnFR	Saitama University
GraphPad Prism 7	GraphPad Software
L-Glutamate	FUJIFILM Wako	072-00501	Dissolved in a liquid growth medium [1/2x MS salts, 1% (w/v) sucrose, and 0.05% (w/v) MES; pH 5.1 adjusted with 1N KOH].
Microsoft Excel	Microsoft Corporation
Murashige and Skoog (MS) medium	FUJIFILM Wako	392-00591	composition: 1x MS salts, 1% (w/v) sucrose, 0.01% (w/v) myoinositol, 0.05% (w/v) MES, and 0.5% (w/v) gellan gum; pH 5.7 adjusted with 1N KOH.
Nikon SMZ25 stereomicroscope	Nikon
NIS-Elements AR analysis	Nikon
1x objective lens (P2-SHR PLAN APO)	Nikon
sCMOS camera (ORCA-Flash4.0 V2)	Hamamatsu Photonics	C11440-22CU
Square plastic Petri dish	Simport	D210-16