Arabidopsis'te Lokal ve Sistemik Yara Sinyallerinin Geniş Alan, Gerçek Zamanlı Görüntülenmesi

Özet

Hücre dışı glutamat tetiklenen sistemik kalsiyum sinyali, bitkilerde mekanik yaralama ve otobur saldırısına karşı bitki savunma yanıtlarının indüksiyonu için kritik öneme sahiptir. Bu makalede, kalsiyum ve glutamaca duyarlı floresan biyosensörleri ifade eden Arabidopsis thaliana bitkilerini kullanarak her iki faktörün de mekansal ve zamansal dinamiklerini görselleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Özet

Bitkiler, hem hasarlı hem de distal hasarsız kısımlarda savunma tepkileri vererek yaralama ve otçulluk gibi mekanik streslere yanıt verir. Bir yaprağın yaralanması üzerine, yara bölgesinde sitozolik kalsiyum iyon konsantrasyonunda (Ca²⁺ sinyali) bir artış meydana gelir. Bu sinyal, savunma yanıtlarının etkinleştirildiği hasarsız yapraklara hızla iletilir. Son araştırmalarımız, yaprağın yaralı hücrelerinden etrafdaki apoplast içine sızan glutamatın yara sinyali görevi aldığını ortaya koydu. Bu glutamat glutamat reseptörü benzeri Ca²⁺ geçirgen kanalları aktive eder ve bu da bitki genelinde uzun mesafeli Ca²⁺ sinyal yayılmasına yol açar. Bu olayların mekansal ve zamansal özellikleri, genetik olarak kodlanmış floresan biyosensörleri ifade eden canlı bitkilerin gerçek zamanlı görüntülenmesiyle yakalanabilir. Burada, hem Ca²⁺ sinyallerinin dinamiklerini hem de yara almaya yanıt olarak meydana gelen apoplastik glutamazdaki değişiklikleri izlemek için bitki çapında, gerçek zamanlı bir görüntüleme yöntemi sunuyoruz. Bu yaklaşım, Yeşil Floresan Protein (GFP) bazlı Ca²⁺ ve glutamat biyosensörlerini ifade eden geniş alan floresan mikroskobu ve transgenik Arabidopsis bitkilerini kullanır. Buna ek olarak, yara kaynaklı, glutamat tetiklenen hızlı ve uzun mesafeli Ca²⁺ sinyal yayılımını kolayca ortaya çıkarmak için metodoloji sunuyoruz. Bu protokol, tesis sistemik sinyalinin sinyal ve yanıt ağlarında nasıl yer aldığını araştırmaya yardımcı olmak için diğer bitki stresleri üzerindeki çalışmalara da uygulanabilir.

Giriş

Bitkiler biyotik streslerden kaçamazlar, örneğin, onları besleyen böcekler, bu nedenle otçul¹gibi zorlukları tespit etmek ve daha sonra kendilerini korumak için sofistike stres algılama ve sinyal dönüştürme sistemleri geliştirmişlerdir. Yaralanma veya otçul saldırısı üzerine, bitkiler sadece yaralı bölgede değil, aynı zamanda hasarsız distal organlarda fitohormone jasmonik asit (JA) birikimi de dahil olmak üzere hızlı savunma yanıtları başlatır². Bu JA daha sonra hem doğrudan hasar görmüş dokularda savunma tepkilerini tetikler hem de bitkinin hasarsız kısımlarında savunmayı önceden tetikler. Arabidopsis'te, yaralanma ile indüklenen JA birikimi, tesisin başka bir yerindeki hasardan sadece birkaç dakika içinde distal, bozulmamış yapraklarda tespit edildi ve yaralı yaprak^3'tenhızlı ve uzun mesafeli bir sinyal iletildiğini düşündürdü. Ca²⁺, reaktif oksijen türleri (ROS) ve elektrik sinyalleri gibi çeşitli adayların,^4,5bitkilerinde bu uzun mesafeli yara sinyalleri olarak hizmet etmesi önerilmiştir.

Ca^2+, ökaryotik organizmalardaki en çok yönlü ve her yerde bulunan ikinci haberci elementlerden biridir. Bitkilerde, tırtıl çiğneme ve mekanik yaralama, hem yaralı yaprakta hem de çözülmemiş uzak yapraklarda sitozolik Ca^{2 +} konsantrasyonunda ([Ca²⁺]_sitot)sert artışlara neden olur^6,7. Bu sistemik Ca²⁺ sinyali, JA biyosentez 8^,9dahil olmak üzere aşağı akış savunma sinyal yollarının aktivasyonuna yol açan hücre içi Ca²⁺algılama proteinleri tarafından alınır. Ca²⁺ sinyallerinin bitki yarası yanıtlarındaki önemini destekleyen çok sayıda rapora rağmen, yaranın neden olduğu Ca²⁺ sinyallerinin mekansal ve zamansal özellikleri hakkında bilgi sınırlıdır.

Genetik olarak kodlanmış Ca²⁺ göstergeleri kullanılarak gerçek zamanlı görüntüleme, Ca²⁺ sinyallerinin uzamsal ve zamansal dinamiklerini izlemek ve ölçmek için güçlü bir araçtır. Bugüne kadar, bu tür sensörlerin tek bir hücre düzeyinde Ca^{2 +} sinyallerinin dokulara, organlara ve hatta tüm bitkilere görselleştirilmesini sağlayan versiyonları geliştirilmiştir¹⁰. Bitkilerde kullanılan Ca²⁺ için genetik olarak kodlanmış ilk biyosensör, Aequorea victoria¹¹denizanasından elde edilen biyolüminesan protein aequorin idi. Bu chemiluminescentprotein bitkiler^{12, 13} ,^{14 , 15,16,17,18}çeşitli streslere yanıt Ca 2 + değişiklikleri tespit etmek için kullanılmış olsa da, ürettiği son derece düşük lüminesan sinyal nedeniyle gerçek zamanlı görüntüleme için uygun değildir. Sarı kameripler gibi Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) tabanlı Ca²⁺ göstergeleri de¹⁹, 20 , 21, 22^,23^,24 tesislerinde bir dizi Ca²⁺sinyal olayının dinamiklerini araştırmak için başarıyla kullanılmıştır. Bu sensörler görüntüleme yaklaşımlarıyla uyumludur ve en yaygın olarak, tümü iki florofor proteini, genellikle bir Siyan Floresan Proteini (CFP) ve Sarı Floresan Protein varyantı (YFP)¹⁰arasında kaynaşmış bir miyosin ışık zinciri kinazından Ca²⁺ bağlayıcı protein calmodulin (CaM) ve bir CaM bağlayıcı peptitten (M13) oluşur. Ca²⁺ bağlama, CaM ve M13 arasındaki etkileşimi teşvik eder ve sensörün konformasyonsal olarak değiştirilmesine neden olabilir. Bu değişiklik CFP ve YFP arasında enerji transferini teşvik eder, bu da CFP'den floresan emisyonunu azaltırken YFP'nin floresan yoğunluğunu arttırır. CfP'den YFP floresansına bu geçişin izlenmesi, Ca²⁺ seviyesindeki artışın bir ölçüsünü sağlar. Bu FRET sensörlerine ek olarak, GCaMP ve R-GECO gibi tek floresan protein (FP) bazlı Ca²⁺ biyosensörleri de bitki görüntüleme yaklaşımlarıyla uyumludur ve yüksek hassasiyetleri ve kullanım kolaylığı nedeniyle [Ca²⁺]_cyt değişikliklerini incelemek için yaygın olarak kullanılır^{25 , 26,27},^28,29,30. GCAMP'ler, yine CaM ve M13 peptidi ile kaynaşmış tek bir dairesel permütasyonlu (cp) GFP içerir. CaM ve M13 arasındaki Ca²⁺bağımlı etkileşim, sensörde cpGFP'nin protonasyon durumunda bir kaymayı teşvik eden ve floresan sinyalini artıran konformasyonsal bir değişikliğe neden olur. Böylece, Ca²⁺ seviyeleri yükseldikçe, cpGFP sinyali artar.

Mekanik yaralama veya otçul beslemeye yanıt olarak üretilen Ca²⁺ sinyallerinin dinamiklerini araştırmak için, bir GCaMP varyantı olan GCaMP3 ve geniş alan floresan mikroskobu^6'yıifade eden transgenik Arabidopsis thaliana bitkilerini kullandık. Bu yaklaşım, bir yapraktaki yara bölgesinden tüm bitkiye uzun mesafeli bir Ca²⁺ sinyalinin hızlı iletimini görselleştirmeyi başarmıştır. Böylece, yara bölgesinde hemen [Ca²⁺_cyt'de bir artış tespit edildi, ancak bu Ca²⁺ sinyali daha sonra yaralandıktan birkaç dakika sonra damar yoluyla komşu yapraklara yayılmıştır. Ayrıca, bu hızlı sistemik yara sinyalinin iletiminin Arabidopsis tesislerinde glutamat reseptör benzeri iki gen, Glutamat Reseptör Gibi (GLR ), GLR3.3ve GLR3.6 6mutasyonları ile kaldırıldığını bulduk. GSR'ler, yara yanıtı 3 , polen tüpü büyümesi 31 , kök gelişimi³², soğuk tepki 33 ve doğuştan gelen bağışıklık³⁴dahil olmak üzere çeşitli fizyolojik süreçlerde yer alan amino asit kapılı Ca²⁺kanalları olarak işlev görür. BGLR'ların bu iyi anlaşılan, geniş fizyolojik işlevine rağmen, ligand özgüllükleri, iyon seçicilikleri ve hücre altı lokalizasyonları gibi işlevsel özellikleri hakkında bilgiler sınırlıdır³⁵. Bununla birlikte, son çalışmalar sırasıyla phloem ve ksilenm'de GLR3.3 ve GLR3.6'nın lokalize olduğunu bildirmektedir. Bitki GSR'leri, memeli sinir sisteminde glutamat, glisin ve D-serine gibi amino asitler tarafından aktive edilen^memelilerde iyonotropik glutamat reseptörleri (iGluR) 36 ile benzerliklere sahiptir³⁷. Gerçekten de, yara bölgesinde 100 mM glutamat uygulanmasının, ancak diğer amino asitlerin, Arabidopsis'tehızlı, uzun mesafeli bir Ca^{2 +} sinyaline neden olduğunu gösterdik Hücre dışı glutamatın muhtemelen bitkilerde bir yara sinyali görevi aldığını gösteren⁶. Bu yanıt,glutamatın bu reseptör benzeri kanallardan biri veya her ikisinde de etki ediyor olabileceğini öne sürenglr3.3 / glr3.6 mutantında kaldırılmıştır ve gerçekten de, AtGLR3.6'nın yakın zamanda bu glutamat seviyeleri tarafından kapılı olduğu gösterilmiştir³⁸.

Bitkilerde, yapısal bir amino asit olarak rolüne ek olarak, glutamat da önemli bir gelişim düzenleyici olarak önerilmiştir^39; ancak mekansal ve zamansal dinamikleri yeneksin anlaşılamamıştır. Tıpkı Ca²⁺için olduğu gibi, bu amino asidin canlı hücrelerdeki dinamiklerini izlemek için glutamat için genetik olarak kodlanmış birkaç gösterge geliştirilmiştir^40,41. iGluSnFR, cpGFP ve Escherichia coli 42^,43'tenbir glutamat bağlayıcı proteinden (GltI) oluşan GFP tabanlı tek FP glutamat biyosensördür. GltI'ye glutamat bağlanmasıyla indüklenen iGluSnFR'nin konformasyonsal değişimi, gelişmiş bir GFP floresan emisyonu ile sonuçlanır. Hücre dışı glutamatın bitki yarası yanıtında bir sinyal molekülü olarak etki edip etmediğini araştırmak için, bu biyosensörü apoplastik alanda lokalize etmek için iGluSnFR dizisini temel kitine sinyal peptid salgılama dizisi (CHIB-iGluSnFR) ile bağladık⁶. Bu yaklaşım, bu sensörü ifade eden transgenik Arabidopsis bitkileri kullanılarak apoplastik glutamat konsantrasyonundaki ([Glu]_apo)herhangi bir değişikliğin görüntülenmesini sağladı. Yara sahasında iGluSnFR sinyalinde hızlı artışlar tespit ettik. Bu veriler, glutamanın hasarlı hücrelerden/ dokulardan yaralanarak apoplast'a sızdırdığı ve GGLR'leri aktive eden ve bitkilerde uzun mesafeli Ca²⁺ sinyaline yol açan bir hasar sinyali görevi gördüğü fikrini destekler⁶.

Burada, uzun mesafeli Ca²⁺ ve hücre dışı glutamat sinyallerinin dinamiklerini izlemek ve analiz etmek için genetik olarak kodlanmış biyosensörler kullanarak bitki çapında gerçek zamanlı görüntüleme yöntemini açıklıyoruz⁶. Genetik olarak kodlanmış biyosensörleri ifade eden geniş alan floresan mikroskopisi ve transgenik bitkilerin mevcudiyeti, Ca²⁺ dalgaları gibi hızla iletilen uzun mesafe sinyallerini tespit etmek için güçlü, ancak kolayca uygulanan bir yaklaşım sağlar.

Protokol

1. Bitki malzemesi hazırlama

1. 1,5 mL mikrotüpte yüzey, GCaMP3 veya CHIB-iGluSnFR'yi ifade eden Arabidopsis thaliana (Col-0 katılım) bitkisinin tohumlarını% 20 (v/v) NaClO ile 3 dakika çalkalayarak sterilize eder ve ardından steril damıtılmış su ile 5 kez yıkayın.
   NOT: Arabidopsis'in GCaMP3 veya CHIB-iGluSnFR'yi ifade eden transgenik çizgileri daha önce^{tanımlanmıştır 6}.
2. Steril bir kaputta, 30 mL steril (otoklavlı) Murashige ve Skoog (MS) ortamı [1x MS tuzları, %1 (w/v) sakkaroz, %0,01 (w/v) miyoinositol, %0,05 (w/v) MES ve %0,5 (w/v) gellan sakız; pH 5,7 1N KOH ile ayarlanmıştır]. Kapağı değiştirin ve cerrahi bantla sarın.
3. 2 gün boyunca 4 °C'de karanlıkta inkübasyondan sonra, plakaları kullanımdan yaklaşık 2 hafta önce sürekli ışık altında (90-100 μmol m^-2 s^-1)bir büyüme odasına yatay olarak yerleştirin. 2 hafta sonra, arabidopsis yapraklarının sayısını en yaşlıdan en genç^44'e kadar sayın (Şekil 1). Yara yanıtları tercihen hasarlı yapraktan (n) 3 ± ve n ± 5⁶numaralı yapraklara hareket eder.
   NOT: Bu protokolde Petri kabı, yara ve glutamat etkilerinin floresan mikroskop altında görüntülenmesi için açılacaktır. Bu nedenle, bu deneydeki sonraki adımlar sıcaklık ve nem kontrollü oda koşullarında yapılmalıdır. Bunun nedeni, Ca²⁺ sinyallerinin de bu çevre koşullarındaki değişikliklerle ortaya çıkar. Ayrıca, biyosensör proteininin floresanının çıkarılması için kayıt sırasında mikroskoptan yayılan mavi ışığın, sitozolitik Ca^{2 + konsantrasyonu 45'in} artmasına neden olabileceği ve bu nedenle bitkinin deneye başlamadan önce birkaç dakika boyunca mavi ışık ışınlanmasına alışması gerektiği bilinmektedir.

2. Kimyasal preparat

1. L-Glutamat'ı sıvı büyüme ortamında çözün [1/2x MS tuzları, %1 (w/v) sakkaroz ve %0,05 (w/v) MES; pH 5.1 1N KOH ile ayarlanarak 100 mM çalışma çözümü yapın.
   NOT: Ca²⁺ dinamikleri üzerinde katyonla ilgili olası etkileri önlemek için sodyum glutamat gibi glutamat tuzlarının kullanımından kaçının.

3. Mikroskop ayarı ve gerçek zamanlı görüntülemenin yapılması

1. 1x objektif lens (NA = 0.156) ve bir sCMOS kamera (Şekil 2) ile donatılmış motorlu floresan stereomikroskopunu açın ve cihaz ayarlarını 470/40 nm eksitasyon ışığı ile ışınlamak ve 535/50 nm filtreden geçen bir emisyon ışığı elde etmek için yapılandırın.
   NOT: GCaMP3 ve iGluSnFR sinyallerini gerçek zamanlı olarak tespit etmek için GFP'ye duyarlı herhangi bir floresan mikroskobu kullanılabilir, ancak tüm tesisten sinyal almak için düşük güçlü objektif lens ve geniş bir sCMOS çipine sahip son derece hassas bir kamera önerilir. Düşük güç hedefi, tüm arabidopsis tesisinin tepkisinin görüntülenmesini sağlar ve son derece hassas bir kameranın kullanılması, yara tetiklenen Ca²⁺ dalgasının hızlı zaman akışını yakalamak için gereken hızlı veri alımını sağlar. Bu çalışmada kullanılan floresan mikroskop için görüş alanının ve zamansal çözünürlüğün maksimum değerleri sırasıyla 3 cm x 3 cm ve saniyede 30 karedir (fps).
2. Kapağı çıkarın ve kabı objektif merceğin altına yerleştirin.
3. Bitkiden gelen floresan sinyalini kontrol edin ve bitkiler yeni çevre koşullarına adapte olana kadar karanlıkta yaklaşık 30 dakika bekleyin. Bu adaptasyon adımı gereklidir, çünkü nemdeki değişiklikler, yarayla ilgili olaylara müdahale edebilecek bitkilerde [Ca²⁺]_sit yükselmesini sağlar.
4. Tüm bitkiyi görüş alanında görmek için odağı ve büyütmeyi ayarlayın. Mevcut protokolde 0.63x büyütme kullanıldı.
5. Gerçek zamanlı görüntülemeye başlamadan önce, mikroskop görüntüleme yazılımını kullanarak floresan sinyallerini algılamak için alma parametrelerini ayarlayın. Geçerli protokoldeki görüntüleme ayarları şunlardır: pozlama ve aralık süreleri sırasıyla 1,8 s ve 2 s (yani 0,5 fps) olarak ayarlanır. Kayıt süresini 11 dakika olarak ayarlayın.
6. Bitkiyi mikroskoptan mavi ışık ışınlamasıyla uyumlulaştırma denemesine başlamadan önce 5 dakika boyunca görüntü, ardından Şimdi Çalıştır'a veya kullanılan mikroskop yazılımındaki eşdeğer komuta tıklayarak kayda başlayın. Ortalama taban çizgisi floresanını belirlemek için, yaralama veya glutamat uygulamasından önce en az 10 kare (yani, mevcut protokolde en az 20 s) kaydedin (bkz. Bölüm 4).
   1. Yara kaynaklı [Ca²⁺]_cyt ve [Glu]_apo değişikliklerinin gerçek zamanlı görüntülenmesi için, yaprak L1'in yaprak veya orta bölgesini makasla kesin (Şekil 3 ve Şekil 4).
   2. Glutamat tetiklenen [Ca²⁺] cyt değişikliklerinin gerçek zamanlı_{görüntülenmesi} için, ana damar boyunca yaprak 1'in kenarını (ucundan yaklaşık 1 mm) makasla kesin. En az 20 dakikalık iyileşme süresinden sonra, yaprağın kesme yüzeyine 10 μL 100 mM glutamat uygulayın (Şekil 5).
      NOT: Bu ön kesim, tepkileri tetiklemek için yaprak apoplastlarına glutamat erişimine izin vermek için gerekliydi. Ek olarak, yaprak L1'in kesilmiş yüzeyine bir damla damıtılmış su uygulanmasının, glutamat uygulamadan önce numunelerin geri kazanım sırasında kurumasını önlemek için kritik olduğu bulunmuştur.
7. 11 dakikalık kaydı bitirdikten sonra verileri kaydedin.

4. Veri analizi

1. Zaman içinde floresan yoğunluğu analizi için, floresan yoğunluğunun analiz edilmesi gereken yerde bir ilgi alanı (ROI) tanımlayın (Şekil 6 ve Şekil 7). Ca²⁺ dalgasının hız hesaplaması için analiz için 2 ROI (ROI1 ve ROI2) tanımlayın. Görüntüleme yazılımında, Zaman Ölçümü | | tanımla Daire çizin. Ek Açıklamalar ve Ölçüm | tıklayarak YATıRıM YTM'leri ile yatırım getirisi arasındaki mesafeyi ölçme Uzunluk | Basit Çizgi (Şekil 6).
2. Ölçü 'ye tıklayarak zaman içinde her yatırım getirislerindeki ham floresan değerlerini (F) ölçün. Excel'e Her Şey'e | 'ye tıklayarak floresan sinyalini her zaman noktasında sayıya dönüştürmek için ham verileri bir elektronik tablo yazılımına dışa aktarma Dışa aktarma.
3. Kaydedilen verilerdeki ilk₁₀karenin (yani tedaviden önce) üzerindeki F ortalamasını hesaplayarak, F 0 olarak tanımlanan temel floresan değerini belirleyin.
4. ΔF/ F = (F−F 0 ) / F 0 denklemini kullanarak_Fverilerini normalleştirin_(ΔF/F ) ΔF floresandaki zamana bağlı değişikliktir.
5. Ca²⁺ dalga hızı dalga analizi için, istatistiksel yazılım kullanılarak F₀ verilerinden hesaplanan standart sapma^(2x SD) × 2'ye yükselme kriterini kullanarak her yatırım getirisinde(t₁ ve t₂₎ca 2+ artışının algılanmasını temsil eden önceden uyarılmış değerlerin üzerinde önemli bir sinyal yükselme noktası tanımlayın. F₀ verilerinin %95'i ortalamadan 2x SD'ye düşüyor ve bu da sinyalde şans eseri bu seviyenin üzerinde bir yükselişin %≤5 olduğunu gösteriyor. Roi1 ve^ROI2 arasındaki Ca 2+ artışının zaman farkını hesaplayın [t₂- t₁ zaman gecikmesi (Δt)] ve ROI1 ile ROI2 arasındaki mesafeyi ölçün, ardından herhangi bir Ca²⁺ dalgasının hızlarını belirleyin.

Sonuçlar

[Ca²⁺]_cyt ve [Glu]_apo'nun yaralamaya yanıt olarak sinyal yayılması Şekil 3, Şekil 4, Film S1ve Film S2'de sunulmuştur. GCaMP3'i ifade eden bitkilerde yaprak 1'in yaprak sapını kesmek (0 s'de), vaskültür (40 s'de)(Şekil 3 ve Film S1)yoluyla lokal olarak hızla indüklenen [Ca²⁺]_sitosunda

Tartışmalar

Sistemik sinyalizasyon, bitkilerin lokalize dış çevresel uyaranlara yanıt vermesi ve daha sonra homeostazlarını tüm bitki seviyesinde tutması için önemlidir. Hayvanlar gibi gelişmiş bir sinir sistemi ile donatılamasalar da, mobil elektrik (ve muhtemelen hidrolik) sinyalleri ve ROS ve Ca^{2+ 46,47}dalgalarının yayılması gibi faktörlere dayanarak hem organlar içinde hem de organlar arasında hızlı iletişim sağlarlar. Yukarıda açıkl...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Arabidopsis expressing GCaMP3	Saitama University
Arabidopsis expressing CHIB-iGluSnFR	Saitama University
GraphPad Prism 7	GraphPad Software
L-Glutamate	FUJIFILM Wako	072-00501	Dissolved in a liquid growth medium [1/2x MS salts, 1% (w/v) sucrose, and 0.05% (w/v) MES; pH 5.1 adjusted with 1N KOH].
Microsoft Excel	Microsoft Corporation
Murashige and Skoog (MS) medium	FUJIFILM Wako	392-00591	composition: 1x MS salts, 1% (w/v) sucrose, 0.01% (w/v) myoinositol, 0.05% (w/v) MES, and 0.5% (w/v) gellan gum; pH 5.7 adjusted with 1N KOH.
Nikon SMZ25 stereomicroscope	Nikon
NIS-Elements AR analysis	Nikon
1x objective lens (P2-SHR PLAN APO)	Nikon
sCMOS camera (ORCA-Flash4.0 V2)	Hamamatsu Photonics	C11440-22CU
Square plastic Petri dish	Simport	D210-16