Imagens em campo amplo e em tempo real de sinais de feridas locais e sistêmicas em Arabidopsis

Resumo

A sinalização sistêmica de cálcio acionada por glutamato extracelular é fundamental para a indução de respostas de defesa vegetal a ferimentos mecânicos e ataque herbívoro em plantas. Este artigo descreve um método para visualizar a dinâmica espacial e temporal de ambos os fatores usando plantas arabidopsis thaliana expressando biosensores fluorescentes sensíveis ao cálcio e glutamato.

Resumo

As plantas respondem a tensões mecânicas, como ferimentos e herbívoros, induzindo respostas de defesa tanto nas partes danificadas quanto nas partes distais não danificadas. Após o ferimento de uma folha, ocorre um aumento na concentração de íons de cálcio citosos (sinal ca²⁺⁾ no local da ferida. Este sinal é rapidamente transmitido para folhas não danificadas, onde as respostas de defesa são ativadas. Nossa pesquisa recente revelou que o glutamato vazando das células feridas da folha para o apoplasto ao seu redor serve como um sinal de ferimento. Este glutamato ativa os canais permeáveis ca²⁺ semelhantes ao receptor de glutamato, o que leva à propagação de sinal Ca²⁺ de longa distância em toda a planta. As características espaciais e temporais desses eventos podem ser capturadas com imagens em tempo real de plantas vivas expressando biosensores fluorescentes geneticamente codificados. Aqui introduzimos um método de imagem em tempo real em toda a planta para monitorar a dinâmica dos sinais ca²⁺ e mudanças no glutamato apoplástico que ocorrem em resposta ao ferimento. Esta abordagem usa um microscópio de fluorescência de campo largo e plantas de Arabidopsis transgênicas expressando Ca²⁺ à base de Proteína Fluorescente Verde (GFP) e biosensores de glutamato. Além disso, apresentamos metodologia para facilmente provocar a propagação de sinal Ca²⁺ induzida por feridas e glutamato. Este protocolo também pode ser aplicado a estudos sobre outras estações vegetais para ajudar a investigar como a sinalização sistêmica da planta pode estar envolvida em suas redes de sinalização e resposta.

Introdução

As plantas não podem escapar de estresses bióticos, por exemplo, insetos que se alimentam deles, por isso desenvolveram sofisticados sistemas de sensoriamento de estresse e transdução de sinais para detectar e, em seguida, proteger-se de desafios como herbívoro¹. Ao ferir ou atacar herbívoros, as plantas iniciam respostas rápidas de defesa, incluindo o acúmulo do ácido jasmônico fitohormônio (JA) não apenas no local ferido, mas também em órgãos distais não danificados². Este JA então ambos desencadeiam respostas de defesa nos tecidos diretamente danificados e induz preventivamente defesas nas partes não danificadas da planta. Em Arabidopsis, o acúmulo de JA induzido pelo ferimento foi detectado em folhas distais e intactas em apenas alguns minutos de danos em outros lugares da planta sugerindo que um sinal rápido e de longa distância está sendo transmitido da folha³ferida . Vários candidatos, como ca^2+,espécies reativas de oxigênio (ROS) e sinais elétricos, foram propostos para servir como esses sinais de ferida de longa distância nas plantas^4,5.

Ca²⁺ é um dos mais versáteis e onipresentes segundo elementos mensageiros em organismos eucarióticos. Nas plantas, a mastigação de lagartas e o ferimento mecânico causam aumentos drásticos na concentração citosolic Ca²⁺ ([Ca²⁺]_cyt) tanto na folha ferida quanto em folhas distantes desenroladas^6,7. Este sinal sistêmico Ca²⁺ é recebido por proteínas de sensoriamento intracelular Ca^2+,que levam à ativação de vias de sinalização de defesa a jusante, incluindo a biossíntese JA^8,9. Apesar de inúmeros desses relatos que sustentam a importância dos sinais de Ca²⁺ nas respostas de feridas vegetais, as informações sobre as características espaciais e temporais dos sinais Ca²⁺ induzidos pelo ferimento são limitadas.

A imagem em tempo real usando indicadores Ca²⁺ geneticamente codificados é uma ferramenta poderosa para monitorar e quantificar a dinâmica espacial e temporal dos sinais Ca^2+. Até o momento, foram desenvolvidas versões desses sensores que permitem a visualização de sinais ca²⁺ ao nível de uma única célula, para tecidos, órgãos e até plantas inteiras¹⁰. O primeiro biosensor geneticamente codificado para Ca²⁺ usado em plantas foi a proteína bioluminescente aequorin derivada da água-viva Aequorea victoria¹¹. Embora esta proteína quemiluminescente tenha sido usada para detectar alterações de Ca²⁺ em resposta a várias tensões nas plantas^{12,13,14,15,16,17,18}, não é adequada para imagens em tempo real devido ao sinal extremamente baixo luminescente que produz. Os indicadores Ca²⁺ baseados em Förster Resonance Energy Transfer (FRET), como os cameleons Amarelos, também foram usados com sucesso para investigar a dinâmica de uma gama de eventos de sinalização Ca²⁺ nas usinas^{19,20,21,22,23,24}. Estes sensores são compatíveis com abordagens de imagem e, mais comumente, são compostos pela proteína de ligação Ca²⁺ calmodulin (CaM) e um peptídeo de ligação de CaM (M13) de uma quinase da cadeia de luz da miosina, tudo fundido entre duas proteínas fluorforas, geralmente uma Proteína Fluorescente Cyan (CFP) e uma variante de Proteína Fluorescente Amarela (YFP)¹⁰. A ligação Ca²⁺ ao CaM promove a interação entre CaM e M13 levando a uma mudança conformacional do sensor. Essa mudança promove a transferência de energia entre o PCP e o YFP, o que aumenta a intensidade da fluorescência do YFP, diminuindo a emissão de fluorescência do PCP. O monitoramento dessa mudança de CFP para fluorescência YFP fornece então uma medida do aumento do nível Ca^2+. Além desses sensores FRET, biosensores ca²⁺ baseados em proteína única (FP) como GCaMP e R-GECO, também são compatíveis com abordagens de imagem vegetal e são amplamente utilizados para estudar as alterações_{de citos} [Ca²⁺] devido à sua alta sensibilidade e facilidade de uso^{25,26,27,28,29,30}. Os GCaMPs contêm um único GFP circularmente permutado (cp), novamente fundido ao CaM e ao peptídeo M13. A interação dependente de Ca²⁺entre CaM e M13 provoca uma mudança conformacional no sensor que promove uma mudança no estado de protonação do cpGFP, aumentando seu sinal fluorescente. Assim, à medida que os níveis de Ca²⁺ aumentam, o sinal cpGFP aumenta.

Para investigar a dinâmica dos sinais ca²⁺ gerados em resposta a ferimentos mecânicos ou alimentação herbívora, utilizamos plantas transgênicas arabidopsis thaliana expressando uma variante GCaMP, GCaMP3, e um microscópio de fluorescência de campo largo⁶. Esta abordagem conseguiu visualizar a transmissão rápida de um sinal Ca²⁺ de longa distância do local da ferida em uma folha para toda a planta. Assim, um aumento no_cite [Ca²⁺] foi imediatamente detectado no local da ferida, mas este sinal Ca²⁺ foi então propagado para as folhas vizinhas através da vasculatura poucos minutos após o ferimento. Além disso, descobrimos que a transmissão desse sinal de ferida sistêmica rápida é abolida em plantas arabidopsis com mutações em dois genes semelhantes a receptores de glutamato, Glutamato Receptor Like (GLR), GLR3.3 e GLR3.6⁶. Os GLRs parecem funcionar como canais de aminoácidos fechados Ca²⁺ envolvidos em diversos processos fisiológicos, incluindo resposta à ferida^3,crescimento do tubo de pólen^31,desenvolvimento raiz^32,resposta fria³³e imunidade inata³⁴. Apesar dessa função fisiológica bem compreendida e ampla das GLRs, as informações sobre suas propriedades funcionais, como sua especificidade de ligante, seletividade de íons e localização subcelular, são limitadas³⁵. No entanto, estudos recentes relataram que GLR3.3 e GLR3.6 estão localizados nos phloem e xilem, respectivamente. As GLRs vegetais têm semelhanças com receptores de glutamato ionotrópicos (iGluRs)³⁶ em mamíferos, que são ativados por aminoácidos, como glutamato, glicina e D-serina no sistema nervoso mamífero³⁷. De fato, demonstramos que a aplicação de glutamato de 100 mM, mas não outros aminoácidos, no local da ferida induz um sinal ca²⁺ rápido e de longa distância em Arabidopsis,indicando que o glutamato extracelular provavelmente age como sinal de ferida nas plantas⁶. Esta resposta é abolida no mutante glr3.3/glr3.6 sugerindo que o glutamato pode estar agindo através de um ou ambos esses canais semelhantes a receptores e, de fato, o AtGLR3.6 foi recentemente mostrado como fechado por esses níveis de glutamato³⁸.

Nas plantas, além de seu papel como aminoácido estrutural, o glutamato também foi proposto como um importante regulador de desenvolvimento³⁹; no entanto, sua dinâmica espacial e temporal são mal compreendidas. Assim como no Ca²⁺, vários indicadores geneticamente codificados para glutamato foram desenvolvidos para monitorar a dinâmica deste aminoácido em células vivas^40,41. IGluSnFR é um biosensor de glutamato uni FP baseado em GFP composto por cpGFP e uma proteína de ligação de glutamato (GLT) da Escherichia coli^42,43. A mudança conformacional do iGluSnFR, que é induzido pela ligação de glutamato ao GLI, resulta em uma emissão de fluorescência GFP aprimorada. Para investigar se o glutamato extracelular age como uma molécula de sinalização na resposta à ferida vegetal, conectamos a sequência iGluSnFR com a sequência básica de secreção de peptídeo de sinal de chitinase (CHIB-iGluSnFR) para localizar esse biosensor no espaço apoplásico⁶. Esta abordagem permitiu a imagem de quaisquer alterações na concentração de glutamato apoplástico ([Glu]_apo) usando plantas de Arabidopsis transgênicas expressando este sensor. Detectamos aumentos rápidos no sinal iGluSnFR no local do ferimento. Esses dados apoiam a ideia de que o glutamato vaza das células/tecidos danificados para o apoplasto ao ferimento e age como um sinal de dano ativando as GLRs e levando ao sinal Ca²⁺ de longa distância nas plantas⁶.

Aqui, descrevemos um método de imagem em tempo real em toda a planta usando biosensores geneticamente codificados para monitorar e analisar a dinâmica dos sinais de glutamato Ca²⁺ de longa distância e extracelulares em resposta ao ferimento⁶. A disponibilidade de microscopia de fluorescência de campo amplo e plantas transgênicas expressando biosensores geneticamente codificados fornece uma abordagem poderosa, mas facilmente implementada para detectar sinais de longa distância rapidamente transmitidos, como ondas ca^2+.

Protocolo

1. Preparação do material vegetal

1. Em um microtubo de 1,5 mL, a superfície esteriliza as sementes de Arabidopsis thaliana (adesão Col-0) expressando gCaMP3 ou CHIB-iGluSnFR tremendo com 20% (v/v) NaClO por 3 min e depois lave 5 vezes com água destilada estéril.
   NOTA: As linhas transgênicas de Arabidopsis expressando GCaMP3 ou CHIB-iGluSnFR foram descritas anteriormente⁶.
2. Em um capô estéril, semeear 13 sementes esterilizadas pela superfície em uma placa de Petri de plástico quadrado de 10 cm, preenchida com 30 mL estéril (autoclaved) Murashige e Skoog (MS) médio [1x sais MS, 1% (p/v) sacarose, 0,01% (w/v) mioinositol, 0,05% (w/v) MES e 0,5% (w/v) goma gellan; pH 5,7 ajustado com 1N KOH]. Substitua a tampa e enrole com fita cirúrgica.
3. Após a incubação no escuro a 4 °C por 2 dias, coloque as placas horizontalmente a 22 °C em uma câmara de crescimento sob luz contínua (90-100 μmol m^-2 s^-1) durante aproximadamente 2 semanas antes do uso. Após 2 semanas, conte o número de folhas arabidopsis do mais velho para o caçula⁴⁴ (Figura 1). As respostas da ferida se movem preferencialmente da folha danificada (n) para as folhas numeradas n ± 3 e n ± 5⁶.
   NOTA: Neste protocolo, a placa de Petri será aberta para a imagem dos efeitos da ferida e glutamato sob um microscópio de fluorescência. Portanto, as etapas subsequentes deste experimento devem ser conduzidas sob condições de ambiente controladas pela temperatura e umidade. Isso porque os sinais ca²⁺ também são provocados por mudanças nessas condições ambientais. Também é sabido que a luz azul, emitida do microscópio durante o registro para excitação da fluorescência da proteína biosensor, pode provocar um aumento da concentração citosolica Ca^{2+ 45} e, portanto, a planta deve ser aclimatada à irradiação da luz azul por vários minutos antes de iniciar o experimento.

2. Preparação química

1. Dissolver L-Glutamato em um meio de crescimento líquido [sais de 1/2x MS, 1% (w/v) sacarose e 0,05% (w/v) MES; pH 5.1 ajustado com 1N KOH] para fazer uma solução de trabalho de 100 mM.
   NOTA: Evite o uso de sais de glutamato, como glutamato de sódio, para evitar potenciais efeitos relacionados à cação na dinâmica ca^2+.

3. Configuração do microscópio e condução de imagens em tempo real

1. Ligue o estereóquio de fluorescência motorizada equipado com uma lente objetiva de 1x (NA = 0,156) e uma câmera sCMOS(Figura 2) e configure as configurações do dispositivo para irradiar com uma luz de excitação de 470/40 nm e adquirir uma luz de emissão passando por um filtro de 535/50 nm.
   NOTA: Qualquer microscópio de fluorescência sensível ao GFP pode ser usado para detectar sinais GCaMP3 e iGluSnFR em tempo real, mas uma lente objetiva de baixa potência e uma câmera altamente sensível com um chip sCMOS largo são recomendados para adquirir sinais de toda a planta. O objetivo de baixa potência permite a imagem de toda a resposta de uma planta arabidopsis e o uso de uma câmera altamente sensível permite a rápida aquisição de dados necessários para capturar o curso de tempo rápido da onda Ca²⁺ acionada pela ferida. Para o microscópio de fluorescência utilizado neste estudo, os valores máximos do campo de visão e resolução temporal são de 3 cm x 3 cm e 30 quadros por segundo (fps), respectivamente.
2. Retire a tampa e coloque o prato sob a lente objetiva.
3. Verifique o sinal de fluorescência da planta e, em seguida, aguarde aproximadamente 30 minutos no escuro até que as plantas sejam adaptadas às novas condições ambientais. Esta etapa de adaptação é necessária porquemudanças na umidade provocam a elevação_{de citos} em plantas que podem interferir em qualquer evento relacionado à ferida.
4. Ajuste o foco e a ampliação para ver toda a planta no campo de visão. No protocolo atual, foi utilizada uma ampliação de 0,63x.
5. Antes de iniciar a imagem em tempo real, configure os parâmetros de aquisição para detectar os sinais de fluorescência usando software de imagem de microscópio. As configurações para imagem no protocolo atual são: tempo de exposição e intervalo definidos para 1,8 s e 2 s (ou seja, 0,5 fps), respectivamente. Defina o tempo de gravação para 11 min.
6. Imagem por 5 minutos antes de iniciar o experimento para aclimatar a planta à irradiação de luz azul do microscópio, em seguida, começar a gravar clicando em Run Now, ou o comando equivalente no software de microscópio que está sendo usado. Para determinar a fluorescência média da linha de base, grave pelo menos 10 quadros (ou seja, pelo menos 20 s no protocolo atual) antes de ferir ou apresentar aplicação de glutamato (ver Seção 4).
   1. Para imagens em tempo real de_cite induzido por ferida [Ca²⁺] e [Glu]_apo alterações, corte a petiole ou a região média da folha L1 com tesoura(Figura 3 e Figura 4).
   2. Para imagens em tempo real de alterações de_cite de glutamato [Ca^2+],corte a borda (aproximadamente 1 mm da ponta) da folha 1 através da veia principal com a tesoura. Após pelo menos 20 min de período de recuperação, aplique 10 μL de glutamato de 100 mM na superfície cortada da folha(Figura 5).
      NOTA: Este pré-corte foi necessário para permitir o acesso de glutamato ao apoplast da folha, a fim de desencadear respostas. Além disso, a aplicação de uma gota de água destilada na superfície cortada da folha L1 foi considerada fundamental para evitar que as amostras se desselicissem durante a recuperação antes da aplicação do glutamato.
7. Depois de terminar a gravação de 11 minutos, salve os dados.

4. Análise de dados

1. Para análise da intensidade da fluorescência ao longo do tempo, defina uma região de interesse (ROI) no local onde a intensidade da fluorescência deve ser analisada(Figura 6 e Figura 7). Para o cálculo de velocidade da onda Ca^2+, defina 2 ROIs (ROI1 e ROI2) para análise. No software de imagem, clique em | de Medição de Tempo Defina | Círculo. Meça a distância entre ROI1 e ROI2 clicando em Anotações e | | de comprimento Linha Simples (Figura 6).
2. Meça os valores de fluorescência bruta (F) em cada ROI ao longo do tempo clicando em Measure. Exporte dados brutos para um software de planilha para converter o sinal de fluorescência em números em cada ponto de tempo clicando em All to Excel | Exportação.
3. Determine o valor da fluorescência da linha de base, que é definido como F₀, calculando a média de F sobre os primeiros 10 quadros (ou seja, antes do tratamento) nos dados registrados.
4. Normalize os dados F (calculando ΔF/F) usando a equação ΔF/F = (F−F₀)/F₀, onde ΔF é a mudança dependente do tempo na fluorescência.
5. Para a análise de ondas de velocidade de onda Ca^2+, defina um ponto de elevação significativo do sinal acima dos valores pré-estimulados como representando a detecção de um aumento de Ca²⁺ em cada ROI (t₁ e t₂) usando o critério de elevação para 2× o desvio padrão (2x SD) que é calculado a partir dos dados F₀ usando software estatístico. 95% dos dados do F₀ estão dentro de 2x SD da média, indicando que um aumento do sinal acima desse nível por acaso é ≤5%. Calcule a diferença de tempo do aumento de Ca²⁺ entre ROI1 e ROI2 [t₂- t₁ time-lag (Δt)] e meça a distância entre ROI1 e ROI2, então determine as velocidades de qualquer onda Ca^2+.

Resultados

A propagação de sinais de [Ca²⁺]_cyt e [Glu]_apo em resposta ao ferimento é apresentada na Figura 3, Figura 4, Filme S1e Filme S2. Cortar a petiola da folha 1 em plantas expressando GCaMP3 (em 0 s) levou a um aumento significativo no_cite [Ca²⁺] que foi rapidamente induzido localmente através da vasculatura (aos 40 s) (F...

Discussão

A sinalização sistêmica é importante para que as plantas respondam a estímulos ambientais externos localizados e, em seguida, mantenham sua homeostase em todo o nível da planta. Embora não estejam equipados com um sistema nervoso avançado como animais, eles empregam comunicação rápida dentro e entre órgãos com base em fatores como sinais elétricos móveis (e possivelmente hidráulicos) e ondas propagadoras de ROS e Ca^2+ 46,47. O protocol...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Arabidopsis expressing GCaMP3	Saitama University
Arabidopsis expressing CHIB-iGluSnFR	Saitama University
GraphPad Prism 7	GraphPad Software
L-Glutamate	FUJIFILM Wako	072-00501	Dissolved in a liquid growth medium [1/2x MS salts, 1% (w/v) sucrose, and 0.05% (w/v) MES; pH 5.1 adjusted with 1N KOH].
Microsoft Excel	Microsoft Corporation
Murashige and Skoog (MS) medium	FUJIFILM Wako	392-00591	composition: 1x MS salts, 1% (w/v) sucrose, 0.01% (w/v) myoinositol, 0.05% (w/v) MES, and 0.5% (w/v) gellan gum; pH 5.7 adjusted with 1N KOH.
Nikon SMZ25 stereomicroscope	Nikon
NIS-Elements AR analysis	Nikon
1x objective lens (P2-SHR PLAN APO)	Nikon
sCMOS camera (ORCA-Flash4.0 V2)	Hamamatsu Photonics	C11440-22CU
Square plastic Petri dish	Simport	D210-16