金刚石光源的固定目标串行数据收集

摘要

我们提供了有关钻石光束线 I24 的串行同步加速器晶体学的固定目标样品制备、数据收集和数据处理的全面指南。

摘要

对于同步加速器用户来说，串行数据收集是一种相对较新的技术。I24的固定目标数据收集用户手册，钻石光源提供了详细的分步说明，数字和视频，以便顺利收集数据。

引言

串行同步加速器晶体学（SSX）是一种新兴的数据收集方法，其灵感来自X射线自由电子激光器（XFEL）1，2，3。在XFEL上，在晶体被极其明亮的X射线脉冲破坏之前，从通常非常小的蛋白质晶体中记录单个衍射图。这意味着，通常，必须将新晶体引入X射线束以获得另一种衍射图^4。这种不断补充晶体的需求推动了许多连续样品输送技术的发展⁵.

在同步加速器中，经典（非串行）旋转晶体学方法被广泛应用，利用单个大晶体使用测角仪在X射线束中旋转，以收集结构解⁶的完整数据集。为了延长晶体的寿命，以便可以收集完整的数据集^7、8，也为了便于运输和自动样品转移，晶体被低温冷却至~100 K用于数据收集。在强烈的微焦点光束线上，经常采用多晶策略，因为辐射损伤会阻止从单晶^9，10，11收集完整的数据集。尽管辐射损伤施加了限制，但使用的晶体数量仍然相对较少，并且使用的方法与单晶实验基本相同。

另一方面，SSX使用串行样品交付从数千个随机取向的晶体中获取单个静止衍射图，以生成完整的数据集。值得注意的是，包含晶体旋转的串行技术正在开发^12，13，尽管我们专注于静止，零旋转，方法。有各种各样的样品输送系统，具有不同的优缺点^14，从在流动聚焦/粘性射流^{15，16，17，}微流控芯片^18，19或固定目标上的晶体（如蚀刻硅芯片20，21）中输送晶体流.通常，晶体保持在室温下，允许观察到更大的构象多样性并提供更具生理相关性的环境^22。SSX可以收集非常低剂量的数据集^23，因为数据集的总剂量相当于一个晶体的单次短X射线曝光。SSX提供的另一个主要优点是通过时间分辨方法研究蛋白质动力学，通过暴露于激光^{24，25，26，27}或通过晶体和配体/底物^28，29的混合来触发反应。使用较小的晶体意味着激光可以穿透整个晶体，均匀地引发反应而不吸收多光子，为在不同时间点采集的衍射数据提供明确定义的反应中间体^27。使用较大的晶体和基于旋转的数据收集方法会受到有限的激光穿透深度，非均匀或多光子激活，辐射损伤以及数据扫描中的机械开销时间的影响，从而导致反应中间体的混合，这些中间体在更快的反应速度下难以或不可能解释。较小的晶体在混合实验中提供了类似的优势，因为配体可以快速，更均匀地扩散到整个晶体中，再次允许在不同的时间延迟^30，31，32下记录定义的反应中间体。

在Diamond的微焦点光束线I24上，可以进行传统的旋转和SSX实验。这里提出了用于SSX样品制备和数据收集的综合协议，该协议使用I24的固定目标，以及用于在Diamond上进行串行数据分析的协议。虽然手稿和随附的视频应该允许用户在I24上成功进行SSX实验，但应该注意的是，这是一个快速发展的领域，并且方法正在不断发展。还应该注意的是，串行方法在其他同步加速器源上可用，包括但不限于Petra III（P14-TREXX），MAX IV（BioMAX）33，SLS（PXI和PXII）34和NSLS（FMX）35。虽然串行数据收集和处理的细节因来源而异，但核心原则将保持不变。下面的协议应被视为代表一个起点和通往大本营的途径，而不是可能取得的成就的顶峰。

该协议假设用户具有蛋白质或小分子晶体系统，从中产生了数量级为0.5-2.0 mL的微晶浆料，每mL具有良好的微晶密度。用于获得晶体浆料的方案已在前面^36中描述过。有许多不同类型的固定目标可用，I24最常用的是利用精确定义的硅芯片。为了与其他芯片布局区分开来，在光束线接口下方和中间，这被称为"牛津芯片"。如前所述，牛津芯片布局包括8×8个"城市街区"，每个街区包含20×20个光圈，总共25，600个光圈^20，21个。

研究方案

1. 准备和加载芯片

注意:该过程发生在湿度受控的环境中（图1），通常在80%至90%或更高的相对湿度之间，以防止蛋白质晶体变干。一旦装载并密封，晶体可以存活超过24小时。然而，这在晶体系统之间可能会有很大差异。在腔室内，需要一个低功率真空泵连接到装载级以容纳硅芯片（图1），硅芯片，带聚酯箔的芯片支架（图2），p200移液器，200μL移液器吸头，镊子，滤纸和蛋白质晶体浆料。

1. 准备一个芯片支架。
   1. 将两张聚酯箔切成正方形，约 6 厘米 x 6 厘米。
   2. 将聚酯板铺在两个底板（大和小）上。
   3. 使用金属密封圈将聚酯板固定到位。
   4. 小心地拉动多余的聚酯箔以去除任何折痕，以便以后更容易可视化和定心样品。
2. 选择相对于晶体尺寸具有适当孔径（7-30μm）的硅芯片。
3. Glow 在 0.39 mBar 下对芯片放电 25 秒，并使用 15 mA 的电流使微晶体在芯片上轻松扩散。
4. 使用镊子将硅芯片放在芯片加载台上，凸起的杆朝下。
5. 使用移液器将200μL微晶浆液涂在芯片的平坦侧。
6. 展开晶体浆料以覆盖芯片的所有"城市街区"。
7. 如果切屑损坏，请用一小块聚酯箔或过滤器移液器吸头覆盖任何孔，以确保可以施加均匀的真空。
8. 轻轻真空，直到所有多余的液体都被吸入芯片。
9. 用镊子从芯片加载级中取出芯片。
10. 用滤纸小心地擦拭芯片的底部，以除去多余的液体。
11. 将装载的切屑放在切屑支架的较大一半上，在导向标记平放的一面朝下之间。
12. 通过将切屑支架的小半部分放在顶部来密封芯片。
    1. 芯片支架的两半将卡入到位。如果后半部分没有齐平，请将支架旋转180°以正确对齐磁铁。
13. 用六角螺栓拧紧芯片支架，将芯片牢固地固定到位。
    注意:或者，可以以类似的方式加载"无屑"芯片，将较小体积的晶体浆料（〜15μL）夹在芯片支架 ³⁷中的两层聚酯箔之间，或者可以使用50μm厚的双面粘合剂垫片加载较小体积，直接施加到聚酯箔上，如前所述³⁸.使用粘合垫片还允许在每个无芯片芯片上加载多个样品（或样品的变体，例如配体浸泡）。Diamond³⁹也可以使用利用声波跌落喷射 （ADE） 来装载硅芯片的互补加载方法。与移液器装载相比，ADE允许使用更小体积的晶体浆料装载芯片。当样品稀缺时，这是一种特别有用的技术，但必须考虑浆料的化学成分和粘度。

2. 光束线上的 GUI 和设置

1. 通过简单的 EPICS 显示管理器 （edm） 图形用户界面 （GUI） 执行所有芯片对准和设置，以进行数据收集（图 3a）。这为波束线仪器提供了一个点击式接口，并为基于Python的数据收集提供了输入参数。子窗口为从样品架的子区域收集（图3b）或激光/ LED泵浦探针实验（图3c）提供了额外的控制。

3. 对齐芯片

1. 使用运动学安装座将加载的芯片放在光束线的XYZ级上（如图 4a所示）。
   1. 注意避免沿着行进方向拉动载物台。运动学支架中的磁铁非常坚固，因此可以很容易地意外完成。
   2. 接近安装座时，应将芯片支架保持在轻微的角度（±30°）。当磁铁接触时，允许芯片支架平行于地板旋转（0°），芯片支架将卡入到位（图4b）。
   3. 卸载芯片时，请遵循相反的路径。在将切屑支架拉开之前，旋转芯片并将其倾斜远离载物台。
2. 使用光束线的轴上查看系统和芯片对准 GUI，定位芯片的左上角基准。基准面是三个正方形，两个小和一个大，彼此成直角（图5a）。芯片被背面照亮，因此芯片将呈现黑暗，光圈为白色方块。
3. 以 X、Y 和 Z 中的基准零为中心（图 5b）。通过分别向左/向右和向上/向下移动来对齐 X 和 Y。通过将芯片移入和移出焦点来对齐 Z。
4. 单击"设置基准零"。
5. 对基准1（右上方， 图5c）和基准2（左下， 图5d）重复步骤3.2，以使所有基准与X射线束对齐。
6. 通过按 使坐标系统生成坐标矩阵，该系统计算芯片相对于级的偏移，俯仰，滚动和偏航，从而允许所有后续运动在芯片坐标系中完成。
7. 单击" 块检查 "将 XYZ 阶段移动到每个城市块的第一个井，以直观地确认芯片是否对齐良好。
8. 如果X射线十字准线与光圈对齐，则芯片对齐。如果没有，请重复步骤 3.2-3.3。
   注意:如果对齐困难（基准面损坏），芯片上的不同光圈可以使用"对齐类型"下拉菜单进行对齐。许多不同类型的芯片可用于固定目标数据收集。通过使用"芯片类型"下拉菜单，可以适应不同的芯片类型。I24最常用的芯片类型是"牛津"和"定制"芯片。芯片上孔径和基准的数字和间距是从 通过 下拉菜单定义的芯片字典中读取的。定制芯片允许动态定义孔径间距，这对于薄膜片对片或其他"无芯片"类型芯片特别有用，其中晶体随机位于支架³⁷上。一个新的Python GUI，提供移动点击功能和自动芯片对齐目前正在开发中，但在撰写本手稿时尚未准备好常规使用。

4. 设置数据收集

注:数据收集设置将取决于所研究的系统以及要执行的实验。这可以从最简单的SSX实验，收集低剂量结构，到使用激光或快速混合来启动反应的时间分辨实验，这将需要在不同的时间延迟下进行多个完整的数据集。要设置数据收集，需要定义以下参数。

1. 实验变量:根据需要填写文件夹、文件名、曝光时间、透射率、探测器距离和每个光圈的拍摄次数。
2. 芯片类型:如上所述，将芯片类型与正在使用的芯片相匹配。
   1. 如果正在使用薄膜或"无芯片"芯片，请将芯片类型设置为 无。
   2. 在 GUI 中以 x 和 y 定义步数和步长。
3. 设置映射类型:这允许选择芯片的子部分进行数据收集（图3b）。"无"意味着从芯片上的每个孔径收集数据。"Lite"表示从芯片上的选定城市街区收集数据（图3b）。例如，如果已知芯片的某个区域加载不良或为空，这可能很有用。"全"允许选择单个光圈进行数据收集。在这种情况下，必须提供格式正确的文本文件。详细信息和模板可以从光束线工作人员处获得。
4. 泵探头:选择泵探头实验的类型和所需的时间延迟。泵（通常是LED或激光）的触发通常特定于特定的实验，因此此处不会详细描述。
   1. "短"延迟是指当泵和探头之间的每个孔径处都有停留时的实验（即泵，探头，"移动到下一个样品"。延迟通常约为 1 秒或数十毫秒。
   2. 长延迟是指兴奋和再次访问（EAVA）策略，其中孔径被访问两次，在访问之间具有定义的时间延迟（即，泵，移动，泵，移动，探头，移动，探头等）。计算时间延迟和X射线曝光时间（图3c），通常约为1秒或更长时间。

5. 常见的数据收集方法

注意:以下是定义所执行实验类型的关键参数。本节假定已定义协议 3"设置数据收集"中的其他设置。

1. 方案 1: 低剂量数据收集。从样品架上的每个选定孔径收集单个衍射图像。
   1. 将每个光圈的拍摄张数设置为 1。
   2. 将泵探头设置为 无。
2. 方案 2: 剂量序列，从样品架上的每个选定孔径依次收集 n 个图像。芯片在每个光圈处静止，同时收集每组 n个 图像。
   1. 将每个光圈的拍摄张数设置为'n'。请注意，如果 n= 5、10、20 或 10 的另一个倍数，则处理将简化。如果 n < 5，则很难建立趋势。考虑覆盖芯片所需的总时间以及 增加n 时产生的图像文件数量是有用的。
   2. 将泵探头设置为 无。
3. 方案 3: 泵探针方法
   1. 从 泵浦探头 下拉菜单中选择一种方法以打开激光激发控制中心。
   2. 对于泵浦探头实验，在每个 孔径选项处填充激光停留 。
   3. 对于 EAVA，请在 每个光圈 和 X 射线曝光 处填充激光停留，然后单击 计算。
   4. 在 edm GUI 泵探头下拉菜单中选择相应的 "重复 "选项，以获得所需的延迟时间。
   5. 如果实验需要预照明步骤，请填充 激光2停留 部分。
   6. 定义完所有实验变量后，按 设置参数 并创建短列表。这会将实验变量加载到 geobrick 控制器上。完成此操作后，按 Start 键可将探测器移入，将背光移出，然后开始数据收集。在设置数据收集的所有点上，打开一个终端窗口是很有用的，其中打印了有关每个步骤的状态和结果的反馈。

6. 数据处理

注意:从广义上讲，数据处理可以根据需要反馈的紧迫性分为三组。需要快速反馈来显示晶体是否存在和衍射，如果是，以什么数量。这应该跟上数据收集的步伐。执行数据索引和集成，速度可能较慢，但仍应在与数据收集相当的时间尺度上执行。将反射强度合并和缩放到mtz文件中以进行结构解和电子密度图的生成是最后一步，并且可能更慢。在这里，将仅讨论在I24处启动前两个阶段的管道，因为它们是指导实验的实时反馈所必需的，但请注意，命中率和缩放统计等指标不能代替检查电子密度，这可能提供配体已经结合或发生反应的唯一确认， 在水晶中。

1. 快速反馈
   1. 要加载数据处理模块类型 ，请将 i24-ssx 加载 到任何波束线工作站上的终端中。
   2. 要在终端中运行命中结果分析类型 i24-ssx /path/to/visit/directory/， 请执行以下操作:i24-ssx /dls/i24/data/2020/mx12345-6/
      注:这将打开三个终端窗口，一旦数据写入磁盘，就会以图形表示来自高级光源衍射集成^{（DIALS）40，41}的点查找结果（图6a）。
      1. 默认设置每 10^{张图像评分} 一次，每隔几秒钟刷新一次，以最大程度地减少计算负载。
      2. 通过在上面命令的末尾添加一个参数来更改默认值。例如，'i24-ssx /dls/i24/data/2020/mx12345-6 2' i24-ssx 将对其他每个图像运行命中查找。但是，这可能会给群集（共享资源！）带来不适当的压力，并减慢处理时间。该图根据成功分度的可能性进行颜色编码，红色表示至少发现了15个布拉格斑点（索引的良好机会），蓝色表示几乎没有有用的衍射。
      3. 通过单击点查找器界面上的点，在 DIALS 图像查看器中查看感兴趣的衍射图像。
2. 索引和集成反馈
   注:衍射数据的分度和积分使用DIALS使用dials.still_process函数^40，41进行。因此，与晶体相关的特定信息（预期的晶体空间组、晶胞和实验几何图形）应放入 .phil 文本文件中。
   1. 通过键入模块加载终端中的 负载拨号来加载 DIALS 模块。
   2. 要开始处理数据集类型，dials.still_process /path/to/images/ /pathto/phil- file.phil。所有仍在处理的数据集的进度可以通过键入monitor_stills_process.py（在执行模块加载i24-ssx并将目录更改为当前访问后）来运行stills_monitor脚本来监视（图6b）。
   3. 索引衍射数据的晶胞分布（图7a）可以使用命令ctbx.xfel.plot_uc_cloud_from_experiments/path/to/dials/output/*refined.expt combine_all_input=true来监测，这对于识别和解析晶胞多晶型特别有用，如前所述^42。
   4. 'Visualzie'如果以及如何通过生成一个2D绘图（图7b），使用 命令python pacman.py/visit/processing/_hit_finding/chip.out来改变这种分布。
   5. 使用 DIALS 命令生成所有索引衍射数据的立体投影（图 7c），dials.stereographic_projection hkl= 0，0，1 expand_to_P 1 = True /path/to/dials/output/*refined.expt。
      注意:当处理来自晶体的静止图像数据时，这是一种常见的病理学，其中Bravais晶格的对称性高于合并数据显示为完美孪生的空间组对称性。数据处理算法已经发展到可以解决这种病理学43，44，45，46，但用户在处理他们的数据时应该注意这一点。

结果

低剂量数据收集和系列
在I24处的亚硝酸铜还原酶微晶体上收集了低剂量（步骤5.1:情景1）和剂量系列（步骤5.2:情景2）数据，并且之前已经发表过^42。所有样品均按步骤1所述制备，按照步骤3，4和5收集数据，并使用步骤6中的方法进行处理。在这项工作 中，收集了一个快速剂量系列，在每个孔径上拍摄了20张衍射图像（即，在上面显示的数据收集GUI中n = 20），然后移动到新鲜样品。从这些数据中确定了空间组P2_{1 3}中单元单元的双峰分布（a = b = c = 97.25 Å，a = b = c = 96.38 Å）。识别和分离这些用于处理的单元细胞多晶型显示数据质量指标显着改善，并在残基189-193之间的柔性循环中揭示了两种不同的结构，而不是在处理所有数据时观察到的混合状态。在一个微妙的时间分辨结构研究中，识别这种多晶型可能会使一切变得不同，因为预计只有很小的结构变化。此外，收集的剂量序列揭示了晶体中剂量依赖性单位细胞的变化，增加的剂量使种群转向更大的单位细胞。

Ebrahim等人（2019）47进行了类似的工作，其中从Streptomyces lividans（DtpAa）的染料型血红素过氧化物酶中收集了剂量序列（步骤5.2:场景2），以比较SSX的低剂量结构（步骤5.1:场景1）与使用SFX在同一固定目标系统中测量的结构。在SACLA Beamline BL2 EH3上收集了SFX数据，脉冲长度为10飞秒，重复率为30 Hz。10 飞秒脉冲持续时间可确保 SFX 数据中不存在剂量依赖性效应。将SFX数据与在光束线上I24上收集的SSX数据进行比较，其中在每个样品位置测量10个连续的10毫秒曝光（即，n= 10）。观察到血红素铁配位水分子远离铁的剂量依赖性迁移，以及SSX剂量系列中血红素丙酸酯基团之一的构象变化。虽然不像SFX结构那样无损伤，但剂量序列允许外推零剂量数据集（血红素铁）的Fe-O键长度，这与实验误差与从SFX获得的值一致。

这里描述的串行晶体学数据收集方法也可以很容易地适应提供新的样品环境，例如，在室温下研究厌氧蛋白结构。如Rabe 等人 2020 ⁴⁸所述，在厌氧室中加载具有不同密封膜的"片上"样品或"无屑芯片"，可以从双氧敏感样品中室温收集结构数据。

泵探头
虽然以下代表性结果没有在Diamond Beamline I24上收集，但这些方法是在iNEXT计划中的设施之间密切合作开发的，以努力实现连续晶体学方法开发中的标准方法。Beamline I24提供或将很快提供与下述方法等效的收集方法，以使用上述协议中描述的方法进行此类实验。

泵探头:快速混合
Mehrabi等人（2019）28在PETRA III的光束线T-REXX上进行了快速混合SSX，使用压电驱动的液滴注入器在固定目标上启动反应。 这项工作提供了芯片混合实验结合GlcNac₃与溶菌酶微晶的原理证明，结合发生在施加到样品上的75 pL液滴的50 ms内。该研究随后以7结构的时间分辨系列木糖异构酶活性，证明葡萄糖在15 ms内结合，并在60秒延迟后在葡萄糖分子中形成开环构象。目前正在开发用于液滴注射的等效设置，用于I24。

泵浦探头:轻度激活
在Schulz等人（2018）中提出了一种光激活泵浦探针系列实验^49。用光胶囊氟乙酸酯浸泡氟乙酸脱氢酶，并用320-360nm激光泵浦，在4个时间点（t=0，30，752和2，052 ms）产生结构。静息状态结构（0 ms）显示一个空的活性位点，除了少数水分子，以及两个蛋白质亚基的帽结构域之间的等效密度。光激活后30 ms和752 ms，可以观察到亚基B的上限域相对于亚基A的电子密度显着降低。亚基B帽畴中电子密度的降低与亚基A活性位点中氟乙酸盐在752 ms处的出现相吻合。2，052 ms处的最终数据集显示了配体的进一步结构重排，怀疑有助于S_N2攻击的正确几何形状，以及反应中中间状态的潜在形成。在I24上，便携式Pharos激光系统可在210-2500nm范围内进行调节，提供飞秒脉冲，可用于光激活。初步实验表明，使用308nm激发成功激活光盒，释放的配体与观察到的目标蛋白结合。在撰写本文时，集成到光束线人员安全系统中正在进行中，预计在2021年初进行常规用户实验。对于需要较弱强度的光脉冲的实验，已成功使用TTL控制LED进行光激活。

图 1:金刚石光源处的样品装载设备。该装置由真空泵（a），手套箱（b）和加湿器（c）组成。在手套箱内，真空压力用于作用于装载有晶体浆料的芯片，该晶体浆料保存在样品块（d）中，通过连接到旋塞阀（g，蓝色箭头）的压力调节器（f，黄色箭头）连接到Büchner烧瓶（e，绿色箭头）。潮湿的空气通过连接到加湿器（h）的塑料管泵入帐篷，并使用湿度计（i）进行测量。使用夹具支架（j）将组件固定到位。请点击此处查看此图的放大版本。

图2:样品架。它们利用金属O形圈（a）将聚酯薄膜夹在顶部（b）和底部（c）的一半上，下半部分带有磁性支架（d），用于将样品架连接到样品台上。聚酯薄膜（6μm（e）或3μm（f））以及橡胶O形圈（白色箭头）可防止晶体加载的芯片在用六角螺栓（g）紧密闭合的样品架中快速干燥。使用连续15分钟的浴在dH_{2 O，1}M HCl和dH₂O（h）中清洁芯片。请点击此处查看此图的放大版本。

图3:用于I24处固定目标数据收集的数据收集GUI（a）显示了用于对齐芯片和定义数据收集参数的主界面，（b）是用于定义用于数据收集的芯片子区域的映射精简界面，（c）是用于定义激光照明参数的接口。请点击此处查看此图的放大版本。

图 4:将芯片支架安装到载物台上的过程，如步骤 3 第 1 点所述。请单击此处查看此图的放大图。

图5:芯片对齐。 通过单击（a）中所示芯片上的三个基准标记来对齐芯片。通过光束线轴上观察系统的基准面 0、1 和 2 的视图如 （b）、（c） 和 （d） 所示。 请点击此处查看此图的放大版本。

图6:自动处理结果显示，如步骤6.1中所述。 将显示更新的命中率图（a，插图）。如果点击"命中"，则相应的衍射图像将显示在表盘图像查看器中。将显示当前数据收集的命中率（在此示例中为 29.6%）。面板 （b） 显示了一个窗口示例，该窗口显示访问期间到目前为止收集的数据的当前索引和积分率，这些数据会实时更新。 请点击此处查看此图的放大版本。

图7:更深入的数据分析。 晶胞参数的可视化可以揭示多晶型（a）。计算平均晶胞参数;但是，这尚未扩展到多晶型的单个平均值。可视化一小部分数据（显示的数据是来自Ebrahim et al 2019中描述的数据的793个亚硝酸铜还原酶晶体的子集）通常足以揭示趋势。还可以生成有用参数的二维图，以揭示由于加载或脱水效应而产生的变化，这些变化可以在即将到来的数据收集（b）中得到解决。立体投影可以揭示是否存在首选方向，反馈到加载协议（c）中。 请点击此处查看此图的放大版本。

讨论

串行同步加速器数据收集是MX光束线中一项相对较新的技术，它弥合了目前在XFEL上执行的超快速数据收集与传统的基于同步加速器的MX之间的差距。本手稿旨在概述如何在光束线I24，钻石光源成功收集固定目标串行数据，用于低剂量，剂量系列和时间分辨实验。与标准晶体学一样，样品制备是结构溶液中的主要瓶颈。SSX也不例外，制备足够数量的均质晶体浆料尚未像单个大蛋白质晶体的生长那样受益于几十年的研究和改进。然而，这些浆料的制备超出了本文的范围，并已在本文的其他地方进行了总结^36。这里描述的方法中的关键步骤涉及使用易于使用的GUI接口（步骤3）和自动数据处理管道（步骤6）仔细使用可用样品，以通知芯片加载（步骤1）以及实验应如何进行。

快速反馈管道是一个强大的工具，允许用户在数据收集期间评估初始命中率，以通知后续芯片加载协议以成功收集数据。当面临低命中率（<5%）时，用户可能会收集不完整的数据和/或浪费额外的收集时间。在这种情况下，样品可以汇集，通过温和的离心浓缩，和/或可以在步骤1.5中加载更大体积的样品。较高的命中率通常是有利的，但是，存在一个收益递减点，其中过载会导致同一孔中有多个晶体。DIALS能够处理多晶格衍射数据^50，但比分度和积分更令人担忧的是晶体分组对激光或快速混合的晶体的均匀活化可能产生的不利影响，以进行精确的时间分辨实验。因此，应特别注意避免时间分辨实验的固定目标过载。

分度和积分处理步骤产生一个图，其中中央十字代表光束方向，每个点代表单个晶格的hkl 001反射方向，圆的外环表示距光束轴90°的旋转。这将显示您的晶体是否具有首选方向，这可能会影响数据的完整性，并表明需要收集更多数据或改变加载协议。在 图7c的左侧面板中，显示了用HEWL晶体过载芯片的效果。当光圈充满更多的晶体时，它们会粘附在孔径的角度壁上，而不是以随机方向楔入底部。两个正交椭圆是位于芯片内壁上的晶体的结果，这些晶体与光束方向成约35°。这减少了加载的晶体体积，降低了命中率，并显着降低了位于这些优选平面中的晶体的比例。

应该注意的是，I24还有其他串行方法，例如LCP挤出机和微流控芯片。它们使用类似的 GUI 和相同的处理管道，因此即使使用不同的技术，上述大部分内容仍然适用。除了这里描述的固定目标方法之外，SSX和SFX还存在许多串行方法，每种方法都比另一种方法具有一定的优势，具体取决于要执行的实验和用于实验的光束线。由于串行方法正在迅速发展，建议在规划光束时间时尽早查看光束线网页（https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/I24.html）以获取最近的更新，并与光束线工作人员交谈。在使用时，免费访问 I24 进行标准和串行实验。对于英国和欧盟用户，旅行和住宿费用部分由iNEXT Discovery支付。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chip Holders	Custom Built	N/A	In-house custom built metallic chip holders consisting of 2 magnetic base plates, 2 metal rings, and a kinematic mount.
Chipless Chip Spacers	SWISCII	N/A	LCP adhesive sheets available as part of the LCP modular range
Geobrick LV-IMS-II	Delta Tau	N/A	A multi-axis controller/amplifier with a custom Diamond Light Source hardware configuration
Kinematic Mounts	ThorLabs	KB25/M	Square bases with 3 magnets arranged in a triangle affixed to chip holders.
KNF Laboport Vacuum Pump	Merck	Z262285-1EA	Solid PTFE vauum pump, 10 l/min pumping speed.
Mylar Sheets 6 µm	Fisher Scientific	15360562	300 ft roll of 6 µm thick mylar XRF film by SPEX SamplePrep
Mylar Sheets 3 µm	Fisher Scientific	04-675-4	300 ft roll of 3 µm thick mylar XRF film by SPEX SamplePrep
Pelco easiGlow Glow Discharge System	Ted Pella, INC.	91000	A compact stand alone glow discharge system used to produce hydrophillic surfaces
Silicon Chips	University of Southampton	N/A	Custom etched silicon chips with 25,6000 apertures available in a variety of sizes.
Translation Stages	Smaract	N/A	XYZ sample stages are a collaborative design by Diamond Light Source and SmarAct, custom-built by SmarAct using three linear translation 50mm travel stages, precise crossed roller guideways, and an integrated sensor with up to 1 nm resolution
1byOne Humidifier (701UK-0003 )	1byOne	B01DENO0EQ	Commercially available 1.3 Litre ultrasonic humidifier