Coleta de dados seriais de alvo fixo na fonte Diamond Light

Resumo

Apresentamos um guia abrangente para preparação fixa de amostras de alvo, coleta de dados e processamento de dados para cristalografia síncrotron serial na linha de feixe Diamond I24.

Resumo

A coleta de dados em série é uma técnica relativamente nova para usuários síncrotrons. Um manual de usuário para coleta de dados de destino fixo em I24, Diamond Light Source é apresentado com instruções detalhadas passo a passo, números e vídeos para coleta suave de dados.

Introdução

A cristalografia síncrotron serial (SSX) é um método emergente de coleta de dados que foi inspirado por lasers de elétrons livres de raios-X (XFEL)^1,2,3. Em um XFEL, um único padrão de difração é registrado a partir de um cristal de proteína geralmente muito pequeno, antes que o cristal seja destruído pelo pulso de raio-X extremamente brilhante. Isso significa, normalmente, que um novo cristal deve ser introduzido no feixe de raios-X para obter outro padrão de difração⁴. Essa necessidade de repor continuamente cristais tem impulsionado o desenvolvimento de muitas técnicas de entrega de amostras em série⁵.

Em síncrotrons, métodos clássicos de cristalografia de rotação (não-serial) são amplamente aplicados, explorando um único cristal grande que é girado em um feixe de raios-X usando um goniômetro para coletar um conjunto de dados completo para a solução de estrutura⁶. A fim de aumentar a vida útil dos cristais para que um conjunto de dados completo possa ser coletado^7,8, e também para facilitar o envio e transferência automatizada de amostras, os cristais são criocoolados para ~100 K para coleta de dados. Em linhas de feixes de microfoco intensos, estratégias multi-cristais são frequentemente empregadas, pois danos causados por radiação podem proibir a coleta de um conjunto de dados completo a partir de um único cristal^9,10,11. Apesar dos limites impostos pelos danos causados pela radiação, o número de cristais usados permanece relativamente modesto e a abordagem utilizada é essencialmente idêntica ao único experimento de cristal.

O SSX, por outro lado, usa a entrega de amostras seriais para obter padrões únicos de difração ainda de milhares de cristais orientados aleatoriamente para gerar um conjunto de dados completo. Nota-se que as técnicas seriais que incorporam a rotação de cristais estão em desenvolvimento^12,13 embora nos concentremos em abordagens ainda, zero de rotação. Existem uma grande variedade de sistemas de entrega de amostras com diferentes vantagens e desvantagens¹⁴, que vão desde a entrega de um fluxo de cristais em um jato focado/viscoso de fluxo^15,16,17, chip microfluido^18,19, ou cristais em um alvo fixo, como um chip de silício gravado^20,21 . Normalmente, os cristais são mantidos à temperatura ambiente, permitindo maior diversidade conformacional e proporcionando um ambiente mais fisiologicamente relevante²². O SSX permite a coleta de conjuntos de dados de dose muito baixa^23,já que a dose total do conjunto de dados equivale a uma única exposição de raios-X curtos de um cristal. Outra grande vantagem que o SSX proporciona é o estudo da dinâmica proteica através de métodos resolvidos pelo tempo, com reações desencadeadas pela exposição à luz laser^24,25,26,27ou pela mistura de cristais e ligante/substrato^28,29. O uso de cristais menores significa que a luz laser pode penetrar a totalidade do cristal, iniciando uniformemente a reação sem absorção multifotilha para fornecer intermediários de reação bem definidos para dados de difração tomados em diferentes pontos de tempo²⁷. O uso de cristais maiores e métodos de coleta de dados baseados em rotação sofre de uma profundidade limitada de penetração a laser, ativação não uniforme ou multifotona, dano de radiação e tempo de sobrecarga mecânica dentro de varreduras de dados, resultando em uma mistura de intermediários de reação que podem ser difíceis ou impossíveis de interpretar a velocidades de reação mais rápidas. Cristais menores fornecem uma vantagem semelhante na mistura de experimentos, pois os ligantes podem se difundir rapidamente e de forma mais uniforme em todo o cristal, permitindo novamente que intermediários de reação definidos sejam registrados em diferentes atrasos de tempo^30,31,32.

No microfoco de Diamond, o I24, tanto a rotação convencional quanto os experimentos SSX, podem ser realizados. Aqui são apresentados um protocolo abrangente para preparação de amostras SSX e coleta de dados usando alvos fixos no I24 e protocolos para análise de dados de dados seriais na Diamond. Embora o manuscrito e os vídeos que acompanham devem permitir que os usuários realizem um experimento SSX bem sucedido no I24, deve-se notar que este é um campo em rápido desenvolvimento e as abordagens estão em constante evolução. Deve-se notar também que os métodos seriais estão disponíveis em outras fontes síncrotrons, incluindo, mas não se limitando a Petra III (P14-TREXX), MAX IV (BioMAX)^33,SLS (PXI e PXII)³⁴e NSLS (FMX)³⁵. Embora as especificidades da coleta e processamento de dados em série diferam entre as fontes, os princípios fundamentais permanecerão os mesmos. Os protocolos abaixo devem ser vistos para representar um ponto de partida e um caminho para o acampamento base, em vez do cume do que poderia ser alcançado.

Este protocolo pressupõe que os usuários tenham um sistema de cristal de proteínas ou pequenas moléculas, a partir do qual foi produzido um chorume microcristasta na ordem de 0,5-2,0 mL com uma boa densidade de microcristais por mL. Protocolos para obtenção de pastas de cristais foram descritos anteriormente ³⁶. Muitos tipos diferentes de alvo fixo estão disponíveis, os mais usados no I24 utilizam um chip de silício precisamente definido. A fim de diferenciar-se de outros layouts de chip, abaixo e na interface de linha de feixe, este é chamado de "chip Oxford". Como descrito anteriormente, o layout do chip oxford compreende 8×8 'blocos da cidade', cada um contendo 20×20 aberturas para um total de 25.600 aberturas^20,21.

Protocolo

1. Preparar e carregar um chip

NOTA: O processo ocorre dentro de um ambiente controlado pela umidade (Figura 1),tipicamente entre 80% e 90% ou umidade relativa mais alta, para evitar que cristais proteicos sequem. Uma vez carregados e selados, os cristais podem sobreviver por mais de 24 horas. No entanto, isso pode variar muito entre sistemas de cristal. Dentro da câmara é necessária uma bomba de vácuo de baixa potência presa a um estágio de carga para segurar um chip desilício (Figura 1),um chip de silício, um suporte de chip com papel alumínio(Figura 2),uma pipeta p200, 200 pontas de pipeta de μL, pinças, papel filtro e o chorume de cristal proteico.

1. Prepare um suporte de chip.
   1. Corte duas folhas de papel alumínio de poliéster em quadrados de aproximadamente 6 cm x 6 cm.
   2. Coloque as folhas de poliéster sobre as duas placas base (grandes e pequenas).
   3. Fixar as folhas de poliéster no lugar usando os anéis de vedação de metal.
   4. Puxe cuidadosamente o excesso de papel alumínio de poliéster para remover quaisquer vincos para facilitar a visualização e o centro das amostras mais tarde.
2. Selecione um chip de silício com aberturas de tamanho adequado (7-30 μm) em relação ao tamanho dos cristais.
3. Glow descarreza o chip por 25 segundos a 0,39 mBar e usando uma corrente de 15 mA para permitir a fácil disseminação de micro cristais no chip.
4. Coloque o chip de silicone no estágio de carregamento do chip usando pinças com as barras levantadas viradas para baixo.
5. Aplique 200 μL do chorume microcrista no lado plano do chip usando uma pipeta.
6. Espalhe o chorume de cristal para cobrir todos os "blocos da cidade" do chip.
7. Se o chip estiver danificado, cubra qualquer orifício com um pequeno pedaço de papel alumínio de poliéster ou ponta de pipeta de filtro para garantir que um vácuo uniforme possa ser aplicado.
8. Aplique um vácuo suave até que todo o excesso de líquido tenha sido sugado através do chip.
9. Remova o chip do estágio de carregamento do chip com pinças.
10. Limpe cuidadosamente a parte inferior do chip com papel filtro para remover o excesso de líquido.
11. Coloque o chip carregado na metade maior do suporte do chip entre as marcas do guia lado plano para baixo.
12. Sele o chip colocando a pequena metade do suporte do chip por cima.
    1. As duas metades do suporte do chip entrarão no lugar. Se a segunda metade não estiver alinhada, gire o suporte 180° para alinhar corretamente os ímãs.
13. Enrosque o suporte do chip fechado com parafusos hexais para fixar o chip com segurança no lugar.
    NOTA: Alternativamente, um chip "sem chip" pode ser carregado de forma semelhante, com um volume menor de chorume de cristal (~15 μL) sanduíche entre as duas camadas de papel alumínio de poliéster no suporte do chip ³⁷, ou um volume menor pode ser carregado usando um espaçador de tdah de 50 μm de espessura dupla lateral aplicado diretamente ao papel alumínio de poliéster como descrito anteriormente ³⁸ . O uso de espaçadores adesivos também permite que várias amostras (ou variantes de amostras como molhos de ligantes) sejam carregadas em cada chip sem chip. Uma abordagem complementar de carregamento que explora a ejeção de gota acústica (ADE) para carregar chips de silício também pode ser usada no Diamond³⁹. O ADE permite que os chips sejam carregados usando volumes menores de chorume de cristal do que o carregamento de pipetas. É uma técnica particularmente útil quando as amostras são escassas, embora a composição química e a viscosidade do chorume devem ser levadas em consideração.

2. GUI e configuração na linha de feixe

1. Execute todo o alinhamento e configuração do chip para coleta de dados através de uma interface de usuário gráfica (edm) (edm)(Figura 3a) (Figura 3a). Isso fornece uma interface de ponto e clique para instrumentação de feixe e fornece parâmetros de entrada para coleta de dados baseada em Python. Sub janelas fornecem controle adicional para coleta de sub-regiões de um suporte de amostra(Figura 3b) ou experimentos de sonda de bomba laser/LED(Figura 3c).

3. Alinhando o chip

1. Coloque o chip carregado no estágio XYZ na linha de feixe (mostrado na Figura 4a) usando as montagens cinemáticas.
   1. Tome cuidado para evitar puxar os estágios ao longo de sua direção de viagem. Os ímãs nas montagens cinemáticas são bastante fortes, então isso pode ser feito facilmente por acidente.
   2. Ao se aproximar da montagem, o suporte do chip deve ser mantido em um ângulo leve (±30°). Quando os ímãs fizerem contato, permita que o suporte do chip gire paralelamente ao piso (0°) e o suporte do chip clicará no lugar(Figura 4b).
   3. Ao descarregar um chip siga um caminho inverso. Gire e gire o chip para longe das etapas antes de puxar o suporte do chip para longe.
2. Usando o sistema de visualização on-axis da linha de feixe e a GUI de alinhamento do chip, localize o fiducial superior esquerdo do chip. Os fiduciais são três quadrados, dois pequenos e um grande, em ângulos retos um ao outro(Figura 5a). O chip está iluminado de volta para que o chip pareça escuro com aberturas como quadrados brancos.
3. Centro em fiducial zero em X, Y e Z(Figura 5b). Alinhe X e Y movendo-se para a esquerda/direita e para cima/para baixo, respectivamente. Alinhe Z movendo o chip para dentro e para fora do foco.
4. Clique em Definir Zero Fiducial.
5. Repita o passo 3.2 para um fiducial (superior direito, Figura 5c) e fiducial dois (inferior esquerdo, Figura 5d) para alinhar todas as fiduciais com o feixe de raios-X.
6. Gere uma matriz coordenada pressionando o sistema de coordenaçãode make , isso calcula o deslocamento, o tom, o rolo e a guinada do chip em relação aos estágios permitindo que todos os movimentos subsequentes sejam feitos no quadro coordenado pelo chip.
7. Clique em Bloquear Verificar para mover o estágio XYZ para o primeiro poço de cada bloco da cidade para confirmação visual de que o chip está bem alinhado.
8. Se a mira de raios-X se alinhar com as aberturas, o chip está alinhado. Se não, repita os passos 3.2-3.3.
   NOTAs: Em caso de dificuldade de alinhamento (fiduciais quebrados), diferentes aberturas no chip podem ser usadas para alinhamento usando o menu de recuo "tipo de alinhamento". Muitos tipos diferentes de chip estão disponíveis para coleta de dados de destino fixo. Diferentes tipos de chip são acomodados através do uso do menu pull-down 'tipo chip'. Os tipos de chip mais comuns usados no I24 são chips 'Oxford' e 'personalizados'. O número e o espaçamento de aberturas e fiduciais no chip são lidos a partir de um dicionário de chip definido através do menu pull-down. O chip personalizado permite que o espaçamento de abertura seja definido em tempo real, o que é particularmente útil para folhas de filme fino na folha ou outros chips do tipo 'sem chip' onde os cristais estão localizados aleatoriamente em todo o suporte³⁷. Uma nova GUI Python, que oferece funcionalidade move-on-click e alinhamento automatizado de chips está atualmente em desenvolvimento, mas ainda não está pronta para uso rotineiro no momento da escrita deste manuscrito.

4. Configuração da coleta de dados

NOTA: A configuração da coleta de dados dependerá do sistema que está sendo estudado e do experimento a ser realizado. Isso pode variar desde o experimento SSX mais simples, coletando uma estrutura de baixa dose, até um experimento resolvido com o tempo usando lasers ou mistura rápida para iniciar uma reação que exigirá múltiplos conjuntos de dados completos em diferentes atrasos de tempo. Para configurar uma coleta de dados, os seguintes parâmetros precisam ser definidos.

1. Variáveis experimentais: Preencha a pasta, nome do arquivo, tempo de exposição, transmissão, distância do detector e número de tiros por abertura, conforme apropriado.
2. Tipo de chip: Como descrito acima, combine o tipo de chip com o chip em uso.
   1. Se um filme fino ou chip 'chipless' estiver sendo usado, então defina o tipo de chip para None.
   2. Defina o número de etapas e o tamanho da etapa tanto em x quanto no y na GUI.
3. Defina o tipo de mapa: isso permite que subseções de um chip sejam selecionadas para coleta de dados (Figura 3b). 'Nenhum' significa que os dados são coletados de cada abertura em um chip. 'Lite' significa que os dados são coletados de blocos selecionados da cidade no chip(Figura 3b). Isso pode ser útil se, por exemplo, uma região de um chip for conhecida por estar mal carregada ou vazia. 'Full' permite que aberturas individuais sejam selecionadas para coleta de dados. Neste caso, um arquivo de texto corretamente formatado deve ser fornecido. Detalhes e um modelo podem ser obtidos da equipe da linha de trave.
4. Teste de bomba: Selecione o tipo de experimento da sonda da bomba e o atraso de tempo desejado. O acionamento da bomba (geralmente um LED ou laser) é muitas vezes específico para um experimento específico, por isso não será descrito em detalhes aqui.
   1. Atrasos 'curtos' referem-se a experimentos quando há um habitante em cada abertura entre a bomba e a sonda (ou seja, bomba, sonda, 'mover-se para a próxima amostra.) Os atrasos são tipicamente na ordem de 1 segundo ou dezenas de milissegundos.
   2. Atrasos longos referem-se a uma estratégia de excitação e visitação novamente (EAVA), onde aberturas são visitadas duas vezes, com um tempo definido entre as visitas (ou seja, bomba, movimento, bomba, movimento, sonda, movimento, sonda, etc.). O atraso de tempo é calculado e os tempos de exposição de raios-X(Figura 3c)e é tipicamente ~1 segundo ou mais.

5. Métodos comuns de coleta de dados

NOTA: Os seguintes são os parâmetros-chave que definem o tipo de experimento que está sendo realizado. Esta seção pressupõe que as outras configurações do protocolo 3 "Configuração da Coleta de Dados" foram definidas.

1. Cenário 1: Coleta de dados de baixa dose. Coleta de uma única imagem de difração de cada abertura selecionada no suporte da amostra.
   1. Defina o número de tiros por abertura para 1.
   2. Defina a sonda da bomba para Nenhum.
2. Cenário 2: Uma série de doses, coletando n imagens sequencialmente de cada abertura selecionada no suporte da amostra. O chip está parado em cada abertura enquanto cada conjunto de imagens n é coletado.
   1. Defina o número de tiros por abertura para'n'. Observe que o processamento é simplificado se n=5, 10, 20 ou outro múltiplo de 10. É difícil estabelecer tendências se n < 5. É útil considerar o tempo total necessário para cobrir um chip e o número de arquivos de imagem produzidos quando n é aumentado.
   2. Defina a sonda da bomba para Nenhum.
3. Cenário 3: Métodos de sonda de bomba
   1. Selecione um método no menu pull-down da sonda de bomba para abrir o Centro de Controle de Excitação a Laser.
   2. Para um experimento de sonda de bomba, preencha o Laser Dwell em cada opção de abertura.
   3. Para EAVA preencha o Laser Dwell em cada abertura e exposição de raios-X e clique em Calcular.
   4. Selecione a opção Repetir apropriada no menu suspenso da bomba gui edm para o tempo de atraso desejado.
   5. Se o experimento exigir um passo de pré-iluminação, preencha a seção Laser 2 Dwell.
   6. Depois de todas as variáveis experimentais são definidos parâmetros de conjunto de prensa e criar lista curta. Isso carrega variáveis experimentais no controlador de geobrick. Depois que isso for feito pressionando o Start moverá o detector para dentro, a luz de fundo para fora e iniciará a coleta de dados. Em todos os pontos na configuração da coleta de dados é útil ter uma janela terminal aberta onde o feedback sobre o status e o resultado de cada uma das etapas é impresso.

6. Processamento de dados

NOTA: O processamento de dados em linhas gerais pode ser dividido em três grupos com base na urgência com que o feedback é necessário. Feedback rápido é necessário para mostrar se os cristais estão presentes e difratos, e se sim, em que números. Isso deve acompanhar a coleta de dados. A realização de indexação e integração de dados que podem ser mais lentas, mas ainda devem ser realizadas em escalas de tempo comparáveis com a coleta de dados. A fusão e o dimensionamento das intensidades de reflexão em um arquivo mtz para solução estrutural e a geração de mapas de densidade de elétrons representa o passo final e pode ser mais lento ainda. Aqui os pipelines de partida no I24 para as duas primeiras etapas serão discutidos apenas, pois eles são necessários para feedback em tempo real para orientar seu experimento, embora note que métricas como taxas de acerto e estatísticas de escala não são um substituto para inspecionar a densidade de elétrons, o que pode fornecer a única confirmação de que um ligante se vinculou, ou uma reação ocorreu, em crystallo.

1. Feedback rápido
   1. Para carregar os módulos de processamento de dados digite a carga i24-ssx no terminal em qualquer estação de trabalho de linha de vigas.
   2. Para executar o tipo de análise de achado de hits i24-ssx /path/to/visit/directory/ no terminal: i24-ssx /dls/i24/data/2020/mx12345-6/
      NOTA: Isso abre três janelas de terminal e, uma vez que os dados foram gravados em disco, uma representação gráfica de localização resultante da Integração difração para Fontes avançadas de luz (DIALS) ^40,41(Figura 6a).
      1. As configurações padrão marcam a cada 10^imagens e atualizam a cada poucos segundos para minimizar a carga computacional.
      2. Altere o padrão adicionando um argumento ao final do comando acima. Por exemplo, 'i24-ssx /dls/i24/data/2020/mx12345-6 2' i24-ssx seria executado em qualquer outra imagem. No entanto, isso pode colocar pressão indevida no cluster (um recurso compartilhado!) e diminuir os tempos de processamento. O gráfico é codificado por cores com base na probabilidade de indexação bem sucedida, o vermelho mostra que pelo menos 15 pontos de Bragg foram encontrados (boa chance de indexação), azul mostra pouca ou nenhuma difração útil.
      3. Exibir imagens de difração de interesse no visualizador de imagens DIALS clicando nos pontos na interface spot finder.
2. Feedback de indexação e integração
   NOTA: A indexação e integração dos dados de difração são realizadas com os DIALS utilizando a função dials.still_process ^40,41. Como tal, informações específicas relacionadas ao seu cristal (grupo espacial de cristal esperado, célula unitária e uma geometria de experimento) devem ser colocadas em um arquivo de texto .phil.
   1. Carregue os módulos DIALS digitando os mostradores de carga do módulo em um terminal.
   2. Para começar a processar um tipo de conjunto de dados dials.still_process /path/to/images/ /pathto/phil- file.phil. O progresso de todos os conjuntos de dados ainda em processamento pode ser monitorado executando o script stills_monitor digitando monitor_stills_process.py (após a execução do módulo de carga i24-ssx e mudando o diretório para a visita atual) ( Figura6b).
   3. A distribuição celular unitária de dados de difração indexada(Figura 7a) pode ser monitorada usando o comando ctbx.xfel.plot_uc_cloud_from_experiments/path/to/dials/output/*refinado.expt.expt combine_all_input=true Isso é particularmente útil para identificar e resolver polimorfos de células unitárias como discutido anteriormente ⁴².
   4. 'Visualzie' se, e como, essa distribuição varia entre um alvo fixo produzindo um plot 2D(Figura 7b) usando o comando python pacman.py /visit/processing/_hit_finding/chip.out.
   5. Produzir projeções estereográficas de todos os dados de difração indexados(Figura 7c) utilizando o comando DIALS dials.stereographic_projection hkl= 0,0,1 expand_to_P 1 =True /path/to/dials/output/*refined.expt.
      NOTA: É uma patologia comum ao processar dados de alambirecidos de cristais onde a simetria da rede Bravais é maior do que a simetria do grupo espacial que os dados mesclados aparecem como um gêmeo perfeito. Algoritmos de processamento de dados evoluíram para resolver essa patologia ^43,44,45,^46, mas os usuários devem estar atentos a isso durante o processamento de seus dados.

Resultados

Coleta e Série de Dados de Baixa Dose
Dados de baixa dose (Passo 5.1: Cenário 1) e série de doses (Passo 5.2: Cenário 2) foram coletados em micro cristais de nitrito de cobre em I24 e foram publicados anteriormente ⁴². Todas as amostras foram preparadas conforme descrito na etapa 1, dados coletados conforme as etapas 3, 4 e 5, e processadas utilizando métodos na etapa 6. Neste trabalho foi coletada uma série de doses rápidas com 20 imagens de difração tiradas em cada abertura (ou seja, n=20 na gui de coleta de dados mostrada acima) antes de passar para uma nova amostra. A partir desses dados foi identificada uma distribuição bimodal de células unitárias no grupo espacial P2₁₃(a = b = c = 97,25 Å, e a = b = c = 96,38 Å). A identificação e separação desses polimorfos unitários para processamento mostrou uma melhora acentuada nos indicadores de qualidade dos dados e revelou duas estruturas diferentes em um laço flexível entre os resíduos 189-193 em vez do estado misto observado ao processar todos os dados juntos. A identificação desses polimorfos poderia fazer toda a diferença em um estudo estrutural delicado resolvido pelo tempo, onde apenas pequenas mudanças estruturais são esperadas. Além disso, a série de doses coletadas revelou uma dose dependente da mudança celular da unidade no cristal, com aumento da dose deslocando a população em favor da célula unitária maior.

Trabalho semelhante foi realizado por Ebrahim et al (2019)⁴⁷, onde uma série de dose (Passo 5.2: Cenário 2) foi coletada a partir de uma heme peroxidase tipo corante de Streptomyces lividans (DtpAa) para comparar estruturas de baixa dose do SSX (Passo 5.1: Cenário 1) com as medidas no mesmo sistema de alvo fixo utilizando SFX. Os dados SFX foram coletados no SACLA Beamline BL2 EH3 com um comprimento de pulso de 10 femtosegundos e uma taxa de repetição de 30 Hz. A duração do pulso de 10 femtosegundos garante que os efeitos dependentes da dose não estejam presentes nos dados do SFX. Os dados do SFX foram comparados aos dados SSX coletados na linha de feixe I24, onde 10 exposições sequenciais de 10 milissegundos foram medidas em cada posição amostral (ou seja, n=10). Observou-se a migração dependente de dose de uma molécula de água coordenada por ferro heme para longe do ferro, bem como uma alteração conformacional em um dos grupos de propionato de heme na série de dose SSX. Embora não seja livre de danos como a estrutura SFX, a série de doses permitiu que o comprimento de ligação Fe-O de um conjunto de dados de dose zero (heme férrico) fosse extrapolado, com este concordando dentro de erro experimental com o valor obtido do SFX.

Os métodos de coleta de dados de cristalografia serial descritos aqui também podem ser facilmente adaptados para fornecer novos ambientes amostrais para, por exemplo, estudar estruturas de proteínas anaeróbicas à temperatura ambiente. Conforme descrito em Rabe et al 2020 ⁴⁸, carregar uma amostra "folha na folha", ou "chip sem chip", com diferentes filmes de vedação em uma câmara aneróbica permite a coleta de dados estruturais de temperatura ambiente de amostras sensíveis a dioxígenos.

Sonda de bomba
Embora os seguintes resultados representativos não tenham sido coletados no Diamond Beamline I24, esses métodos foram desenvolvidos em estreita colaboração entre as instalações do programa iNEXT para trabalhar em direção aos métodos padrão no desenvolvimento de métodos de cristalografia serial. A Beamline I24 oferece, ou em breve, oferecerá métodos de coleta equivalentes aos descritos abaixo para realizar tais experimentos usando os métodos descritos nos protocolos acima.

Sonda de bomba: Mistura rápida
A mistura rápida SSX foi realizada no feixe T-REXX em PETRA III por Mehrabi et al (2019) ²⁸ usando um injetor de gotículas orientada por piezo para iniciar reações em alvos fixos. Este trabalho apresenta uma prova de princípio sobre o experimento de mistura de chips que liga glcNac₃a microcristais de lysozyme, com a vinculação ocorrendo dentro de 50 ms de uma gota de 75 pL sendo aplicada à amostra. Este estudo foi acompanhado com uma série de 7 estruturas resolvidas com tempo de atividade de isomerase de xilose, demonstrando a ligação de glicose dentro de 15 ms e a formação de uma conformação de anel aberto na molécula de glicose após um atraso de 60 segundos. Uma configuração equivalente para injeção de gotícula está atualmente em desenvolvimento para uso no I24.

Bomba-sonda: Ativação da luz
Um experimento serial ativado por luz é apresentado em Schulz et al (2018) ⁴⁹. Fluoroacetato desidrogenase foi encharcado com fluoroacetato fotocaged e bombeado com luz laser de 320-360 nm para produzir estruturas em 4 pontos de tempo (t=0, 30, 752 e 2.052 ms). A estrutura do estado de repouso (0 ms) mostra um local ativo vazio, com exceção de algumas moléculas de água, e densidade equivalente entre os domínios da tampa de ambas as subunidades proteicas. 30 ms e 752 ms após a ativação da luz uma redução significativa na densidade eletrônica pode ser observada no domínio da tampa da subunidade B em relação à subunidade A. A redução da densidade eletrônica no domínio da tampa da subunidade B coincide com o aparecimento de fluoroacetato no local ativo da subunidade A a 752 ms. O conjunto de dados final em 2.052 ms mostra mais rearranjo estrutural do ligante, suspeito de facilitar a geometria correta para o ataque S_N2, e formação potencial de um estado intermediário na reação. No I24, um sistema de laser Pharos portátil que é incapaz de 210-2500 nm fornecendo pulsos femtosegundos pode ser usado para ativação de luz. Os experimentos iniciais mostraram a ativação bem sucedida de uma fotocagem usando excitação de 308 nm com vinculação do ligante liberado à proteína alvo observada. No momento da integração de escrita no sistema de segurança de pessoal da linha de vigas está em andamento e experimentos rotineiros de usuários são antecipados no início de 2021. Para experimentos quando pulsos menos intensos de luz são necessários, a ativação de luz com LEDs controlados por TTL foi realizada com sucesso.

Figura 1: Equipamento de carregamento de amostras no lugar na Fonte de Luz De Diamante. A configuração consiste em uma bomba de vácuo(a),porta-luvas(b)e umidificador(c). Dentro da caixa de luvas a pressão de vácuo é usada para agir em um chip carregado com chorume de cristal mantido em um bloco de amostra(d) preso a um frasco de Büchner(e, arqueiro verde), através de um regulador de pressão(f, seta amarela) ligado a uma torneira(g, seta azul). O ar úmido é bombeado para dentro da tenda através de tubos plásticos ligados ao umidificador(h),e medidos com um higrômetro(i). Os componentes são mantidos no lugar utilizando grampos(j). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Titulares de amostras. Eles utilizam um anel O de metal(a ) para fixar o filme de poliéster em uma parte superior(b) e inferior(c)metade, com a metade inferior ostentando montagens magnéticas(d)que são usadas para anexar o suporte da amostra aos estágios da amostra. O filme de poliéster (6 μm (e) ou 3 μm(f))bem como os anéis O de borracha (setas brancas) impedem que um chip carregado de cristal seque rapidamente em um suporte de amostra que é fechado apertado com parafusos hexaxais(g). Os chips são limpos usando banhos sequenciais de 15 minutos em dH₂O, 1 M HCl e dH₂O(h). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: A GUI de coleta de dados para coleta de dados de destino fixo em I24. (a) Mostra a interface principal usada para alinhar chips e definir parâmetros de coleta de dados, (b) é a interface de mapeamento lite usada para definir sub-regiões de um chip para coleta de dados e (c) é uma interface para definir parâmetros para iluminação a laser. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: O processo de montagem de um suporte de chip nas etapas como descrito na Etapa 3, ponto 1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Alinhamento do chip. Um chip é alinhado clicando em três marcadores fiduciais no chip mostrado em (a). As visualizações dos fiduciais 0, 1 e 2 através do sistema de visualização do feixe no eixo são mostradas em (b),(c) e(d). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Os resultados de processamento automático são lançados conforme descrito na etapa 6.1. Um plot de taxa de acerto atualizado é exibido(a, inset). Se um 'hit' for clicado na imagem de difração correspondente, será exibido no visualizador de imagem dials. A taxa de acerto para a coleta de dados atual é mostrada (29,6% neste exemplo). Painel (b) mostra um exemplo de uma janela mostrando as taxas atuais de indexação e integração para dados coletados até agora durante a visita que atualiza em tempo real. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Análise mais aprofundada dos dados. A visualização dos parâmetros celulares unitários pode revelar polimorfos(a). São calculados parâmetros unitários médios; no entanto, isso ainda não se estende às médias individuais para polimorfos. A visualização de um pequeno subconjunto de dados (dados mostrados são um subconjunto de 793 cristais de nitrito de cobre reductase dos dados descritos em Ebrahim et al 2019) é muitas vezes suficiente para revelar tendências. Parcelas 2D de parâmetros úteis também podem ser produzidas para revelar variações que surgem devido aos efeitos de carregamento ou desidratação que possam ser abordados para a próxima coleta de dados (b). Projeções estereógráficas podem revelar a presença, ou ausência, orientações preferenciais que remontam ao protocolo de carregamento(c). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

A coleta de dados síncrotrons em série é uma técnica relativamente nova nas linhas de luz MX, fazendo a ponte entre as coletas de dados ultrarrápidas atualmente sendo realizadas em XFELs e MX tradicional baseada em síncrotron. Este manuscrito tem como objetivo dar uma visão geral de como coletar com sucesso dados de série de destino fixos na linha de luz I24, Diamond Light Source para baixa dose, série de doses e experimentos resolvidos pelo tempo. Assim como na cristalografia padrão, a preparação da amostra é um grande pescoço de garrafa na solução de estrutura. O SSX não é diferente, e a preparação de um chorume de cristal homogêneo em quantidades suficientes ainda não se beneficiou de várias décadas de estudo e refinamento, como o crescimento de cristais de proteínas grandes. No entanto, a preparação desses chorumes está fora do escopo deste artigo e foi resumida em outros lugares³⁶. O passo crítico na abordagem descrita aqui envolve o uso cuidadoso da amostra disponível usando interfaces de GUI fáceis de usar (etapa 3) e pipelines automatizados de processamento de dados (etapa 6) para informar o carregamento do chip (etapa 1) e como um experimento deve proceder.

O pipeline de feedback rápido é uma ferramenta poderosa que permite que os usuários avaliem as taxas iniciais de sucesso durante a coleta de dados para informar protocolos subsequentes de carregamento de chips para coleta bem-sucedida de dados. Quando confrontados com uma baixa taxa de acerto (<5%), os usuários correm o risco de coletar dados incompletos e/ou desperdiçar tempo de vigas com coletas adicionais. Neste caso, a amostra pode ser agrupada, concentrada por centrifugação suave, e/ou volumes maiores poderiam ser carregados na etapa 1.5. Uma taxa de acerto mais alta é geralmente favorável, no entanto, há um ponto de retorno reduzido onde a sobrecarga leva a múltiplos cristais no mesmo poço. O DIALS é capaz de lidar com dados de difração multi-rede^50,mas uma preocupação maior do que indexação e integração é o efeito prejudicial que o agrupamento de cristais pode ter na ativação uniforme de cristais por luz laser ou mistura rápida para experimentos precisos resolvidos por tempo. Deve-se, portanto, tomar cuidado especial para evitar a sobrecarga de alvos fixos para experimentos resolvidos com o tempo.

A etapa de processamento de indexação e integração produz um enredo com a cruz central representando a direção do feixe, cada ponto representando a direção do reflexo hkl 001 de lattices individuais, e o anel externo do círculo representando uma rotação de 90° de distância do eixo do feixe. Isso mostrará se seus cristais têm uma orientação preferida, o que pode impactar a completude dos dados e indicar a necessidade de coletar mais dados ou variar o protocolo de carregamento. No painel à esquerda da Figura 7c,é mostrado o efeito da sobrecarga de um chip com cristais HEWL. À medida que as aberturas se enchem de mais cristais, elas grudam nas paredes angulares das aberturas em vez de se casarem na base em uma orientação aleatória. As duas elipses ortogonais são resultado de cristais deitados nas paredes internas do chip que estão a ~35° na direção do feixe. Isso reduz o volume de cristais carregados, reduz a taxa de acerto e reduz drasticamente a fração de cristais deitados nesses planos preferidos.

Deve-se notar que outras abordagens seriais estão disponíveis no I24, como extrusoras LCP e chips microfluídicos. Estes usam GUIs semelhantes e os mesmos pipelines de processamento, tanto que muitos dos acima permanecerão aplicáveis mesmo que uma técnica diferente seja usada. Existem várias abordagens seriais tanto para SSX quanto para SFX além da abordagem de destino fixo descrita aqui, cada uma tem certas vantagens sobre a outra, dependendo do experimento a ser realizado e da linha de feixe usada para o experimento. À medida que as abordagens serial estão evoluindo rapidamente, é aconselhável verificar as páginas da web de linha de feixe (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/I24.html) para atualizações recentes e conversar com a equipe de linha de trave o mais cedo possível ao planejar o tempo de feixe. O acesso ao I24 para experimentos padrão e serial é gratuito no ponto de uso. Para usuários do Reino Unido e da UE, os custos de viagem e acomodação são parcialmente cobertos pelo iNEXT Discovery.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chip Holders	Custom Built	N/A	In-house custom built metallic chip holders consisting of 2 magnetic base plates, 2 metal rings, and a kinematic mount.
Chipless Chip Spacers	SWISCII	N/A	LCP adhesive sheets available as part of the LCP modular range
Geobrick LV-IMS-II	Delta Tau	N/A	A multi-axis controller/amplifier with a custom Diamond Light Source hardware configuration
Kinematic Mounts	ThorLabs	KB25/M	Square bases with 3 magnets arranged in a triangle affixed to chip holders.
KNF Laboport Vacuum Pump	Merck	Z262285-1EA	Solid PTFE vauum pump, 10 l/min pumping speed.
Mylar Sheets 6 µm	Fisher Scientific	15360562	300 ft roll of 6 µm thick mylar XRF film by SPEX SamplePrep
Mylar Sheets 3 µm	Fisher Scientific	04-675-4	300 ft roll of 3 µm thick mylar XRF film by SPEX SamplePrep
Pelco easiGlow Glow Discharge System	Ted Pella, INC.	91000	A compact stand alone glow discharge system used to produce hydrophillic surfaces
Silicon Chips	University of Southampton	N/A	Custom etched silicon chips with 25,6000 apertures available in a variety of sizes.
Translation Stages	Smaract	N/A	XYZ sample stages are a collaborative design by Diamond Light Source and SmarAct, custom-built by SmarAct using three linear translation 50mm travel stages, precise crossed roller guideways, and an integrated sensor with up to 1 nm resolution
1byOne Humidifier (701UK-0003 )	1byOne	B01DENO0EQ	Commercially available 1.3 Litre ultrasonic humidifier