循环肿瘤细胞系:基础和转化研究的创新工具

摘要

培养CTC可以通过测定特异性标志物表达，评估耐药性和定植肝脏的能力以及其他可能性，对癌症进行更深层次的功能表征。总体而言，CTC培养可能是个性化医疗改善患者预后的良好临床工具。

摘要

转移是癌症死亡的主要原因。尽管治疗策略有所改善，但转移性癌症的预后较差。因此，我们迫切需要了解转移发展背后的机制，从而为晚期癌症提出有效的治疗方法。转移性癌症很难治疗，因为活检是侵入性的和不可接近的。最近，人们对液体活检产生了相当大的兴趣，包括无细胞循环脱氧核糖核酸（DNA）和来自外周血的循环肿瘤细胞，我们已经建立了来自转移性结直肠癌患者的几种循环肿瘤细胞系，以参与其表征。事实上，为了在功能上表征这些罕见且描述不佳的细胞，关键步骤是扩增它们。一旦建立，循环肿瘤细胞（CTC）系就可以在悬浮或粘附条件下培养。在分子水平上，CTC谱系可以进一步用于通过免疫荧光或细胞术分析评估感兴趣的特定标志物（如分化，上皮或癌症干细胞）的表达。此外，CTC线可用于评估药物对金标准化疗以及靶向治疗的敏感性。CTC系启动肿瘤的能力也可以通过在免疫缺陷小鼠中皮下注射CTC来测试。

最后，可以通过编辑CTC基因，通过短发夹核糖核酸（shRNA）或Crispr / Cas9来测试可能参与癌症传播的特定基因的作用。因此，可以将修饰的CTC注射到免疫缺陷小鼠脾脏中，以实验方式模拟 体内转移发育过程的一部分。

总之，CTC线是未来研究和个性化医疗的宝贵工具，它们将允许使用最初负责转移的细胞来预测治疗效率。

引言

尽管最近在早期癌症诊断和治疗策略方面有所改善，但超过90%的癌症发病率仍然是由于转移¹。转移过程是一个多步骤级联反应，从细胞从原发肿瘤的局部脱离开始，并进入血液，在那里它们成为循环肿瘤细胞（CTC），最终定植于远处的部位，如肝脏和肺部，在结直肠癌（CRC）^{的情况下2。}最近，人们越来越关注液体活检，液体活检是一种非侵入性工具，可以显着检测和枚举患者血液样本中的CTC。肿瘤内遗传异质性是耐药性的主要原因;因此，从肿瘤材料中分离代表性细胞构成了个性化医疗的有前途的工具^3。

尽管血液中CTC的频率较低（1 CTC/10⁶ -^{10 7}白细胞^）4，但基于CTC与血液其他成分之间的性质差异，开发了几种检测和分离技术^5。单独使用患者血液样本中的CTC数量可以提供有关恶性肿瘤分期，治疗反应和疾病进展^{的信息6，7。}因此，CTC分离是转化研究评估遗传异质性或进行药物筛选的重要工具，也是表征这些侵入性细胞的基础研究的重要工具，因为它们是转移诱导的关键参与者^8，9。事实上，与随着时间的推移积累了数千个突变的商业建立的癌细胞系相比，新鲜的CTC具有原始原发性肿瘤的主要特征，包括强大的转移能力，并且它们更好地反映了这种疾病。这些特征使它们成为基础研究的有力工具，特别是在转移所涉及的预测关键因素的敲除实验中。这些实验的结果可以在体内验证，在小鼠身上，如下所述。

一旦 CTC 被分离出来，它们就可以在非粘附培养条件下扩增，然后，它们可以像任何可用的癌细胞系一样纵，即它们同样可以在粘附条件下培养或嵌入在 Matrigel 中，这取决于科学问题¹⁰。例如，为了测试目标蛋白质的表达和定位，CTC球可以在悬浮状态下生长并嵌入组织凝胶中以对球体切片进行免疫荧光。此外，如果蛋白质是膜性的，则可以通过细胞术测量其在活细胞上的表达。

对于功能研究，为了测试可能在肝脏定植中起作用的感兴趣蛋白质的作用，可以将具有由shRNA或CRISPR / Cas9编辑的基因的CTC注射到免疫缺陷小鼠的脾脏中。后一个实验是模拟肝转移定植^{的强大模型11。}

CTC启动肿瘤的能力可以通过将非常少量的细胞注射到免疫缺陷小鼠中来评估。由于肿瘤起始是癌症干细胞（CSCs）的标志，因此该测定将指示CTC系内CSC的百分比。这种干细胞表型使循环肿瘤细胞系对一些金标准癌症疗法具有抗药性。因此，扩展的CTC可用于筛查药物并为患者确定最佳的潜在有效治疗;例如，CTC对治疗的反应可以使用发光活力测定法在体外进行测试。

从长远来看，对新鲜分离和扩增的CTC进行药物筛选可以用作个性化医疗的新工具，以帮助为患者选择最有效和最合适的治疗方法。

在本文中，详细介绍了培养CTC系，通过免疫染色和细胞术染色特定蛋白质，进行细胞毒性测定以及CTC体内异种移植实验的方案。

研究方案

所有体内方案均由动物伦理机构批准。

1. CTC在3D培养条件下的扩增

1. 为了在悬浮液中培养CTC，首先将CTC以5个细胞/μL的最大浓度接种在超低依附（ULA）24孔板的孔中，并接种到1mL的M12培养基中（即，补充有2mM l-谷氨酰胺，100单位/ mL青霉素和链霉素，N2补充剂，20ng / mL表皮生长因子和10ng / mL成纤维细胞生长因子^{10的高级DMEM-F12）。}
2. 为了允许球体形成和细胞扩增，在缺氧条件下（2%O_2）孵育细胞6至10天。
3. 一旦球体足够大（100μm），以防止坏死，将它们解离以进行扩增。
   1. 将细胞悬浮液置于2 mL管或15 mL管中，并以300×g离心5分钟。
   2. 除去上清液并向沉淀中加入500μL温和解离试剂（例如Accumax）。
   3. 轻轻涡旋并用温和的解离试剂在37°C下孵育细胞悬浮液20至30分钟。
      注意:超过温和解离试剂（Accumax）的孵育时间可能导致细胞死亡率异常增加。
   4. 加入1.5mL磷酸盐缓冲盐水（PBS），并在300×g下离心管5分钟。
   5. 倒出上清液并将沉淀重悬于新鲜的M12培养基中，以达到每μL1-5个细胞的密度。
   6. 将细胞悬浮液接种在超低连接板的新孔中:T75培养瓶为10 mL，6孔板为2 mL，96孔板为100μL

2. CTC球体切片的免疫荧光（IF）染色

1. 将CTC球体以300×g离心到15mL管中5分钟，吸出上清液，并用PBS洗涤沉淀两次。
2. 用500μL4%多聚甲醛（PFA）重悬沉淀，并在冰上孵育20分钟。以300×g离心悬浮液，并用5mL PBS洗涤两次。
3. 用（即15至20μL）热和液体组织凝胶重悬沉淀。用移液器取出所有悬浮液，在4°C的预冷表面上形成一滴，让它聚合5到10分钟。
   注意:快速工作以避免悬浮液聚合到尖端。
4. 用手术刀的刀片分离固体液滴，然后将其插入分隔的嵌入盒中。
5. 执行以下步骤:石蜡包涵体、石蜡切片、切片补液、抗原检索和抗体孵育。这些步骤与嵌入石蜡中并处理用于免疫荧光染色的任何肿瘤或器官相同¹²。
   注意:盒可以在4°C下储存在70%乙醇中，直到石蜡包埋。

3. 细胞术分析

1. 将CTC球体以300×g离心到15mL管中5分钟，并用PBS洗涤沉淀两次。
2. 吸出上清液并将500μL温和解离试剂加入沉淀中。
3. 轻轻涡旋并用温和的解离试剂在37°C下孵育细胞悬浮液20至30分钟。
   注意:在温和解离试剂（Accumax）中孵育超过40分钟可能导致细胞死亡率异常增加。
4. 以300×g离心细胞悬浮液5分钟，除去上清液并将沉淀重悬于5mL封闭缓冲液（即PBS与1%牛血清白蛋白（BSA））中。
5. 将细胞悬浮液通过40μm细胞过滤器以消除剩余的球体。
6. 计数后，将200，000个细胞放入三个荧光激活的细胞分选（FACS）管中，以300×g离心5分钟并除去上清液。使用三个FACS管中的一个作为对照，不会接受任何染色试剂。
7. 根据数据表，将适当的抗体添加到剩余的两个FACS管中（即，一个针对目标蛋白质的偶联抗体，一个偶联同种型对照）。
8. 在推荐的孵育时间后，加入300μL封闭缓冲液以洗涤细胞，以300×g离心3管并吸出上清液。重复此步骤两次。然后，用细胞活力染色试剂（除了FACS管对照，没有任何染色）用封闭缓冲液重悬沉沉淀。
9. 将管子放在冰上，直到FACS分析。首先使用不染色的管子来鉴定细胞活力和抗体染色的门。然后用针对目标蛋白的偶联抗体分析FACS管，以量化表达目标蛋白的CTC的百分比。具有共轭同种型对照的FACS管不应指示偏移。这证实了这种转变是针对目标蛋白的特异性的。
   注意:如果可能，使用表达高水平目标蛋白的细胞系作为阳性对照，使用不表达蛋白质的细胞系作为阴性对照。

4. 发光活力测定（细胞滴定-Glo）

1. 在M12培养基中重悬解解的CTC（如第1.4.5节所述）。计数细胞并使细胞浓度调整为200，000个细胞/ mL。
2. 在ULA 96孔板中，每孔接种10，000个解离的CTC，在50μL中，并将板在缺氧（2%O_2）中孵育24小时。
3. 第二天，将50μL测试药物加入CTC中。以前建议对药物浓度进行滴定，以确定最大抑制浓度的一半（IC50）。仅用载体处理一些孔以确定基底细胞活力。
   注意:接种的细胞数量在CTC系之间可能有所不同，具体取决于它们的倍增时间。此外，细胞应一式三份接种，以尽量减少结果的变异性。
4. 将板在缺氧中再孵育48小时。
5. 在第3天，将培养的板和发光细胞活力缓冲液和底物置于室温下，并根据制造商协议用适当体积的缓冲液重建底物。
6. 将70μL发光活力混合物加入每个培养板孔中。将板放在轨道振荡器上20分钟以诱导细胞裂解，然后将100μL混合物转移到与光度计兼容的不透明壁多孔板中。
7. 让板在室温下静止，用铝箔覆盖，以稳定发光信号。
   注:发光信号稳定长达3小时。
8. 使用酶标仪（即 Tecan Infinite 200 Pro）记录发光。
9. 对于数据分析，计算每个条件一式三份的相对光单位 RLU 的平均值。根据所需的每种药物浓度评估活力百分比:（处理细胞的RLU / 未处理细胞的RLU）x 100。

5. 皮下注射

1. 在微量离心管中，将细胞重悬于100μL无菌PBS中。如果注射的细胞数量低，则将细胞重悬在1:1 PBS / Matrigel中，减少生长因子，以将细胞聚集在一起并促进肿瘤发生。
   注意:细胞密度可以从10个细胞（挑战肿瘤起始能力）到100万个细胞，具体取决于科学问题和实验目的。
2. 在胰岛素注射器中拉起全部体积。
3. 在免疫缺陷小鼠身上，捏住食指和无名指之间侧翼的皮肤，并将针头轻轻插入皮肤根部。
   注意:这个过程并不痛苦，是在有意识的老鼠身上完成的。
4. 将体积缓慢注入同一位置，以防止细胞扩散。这将在皮肤下产生一个小的气泡。
5. 在注射部位施加轻柔的压力，以防止体积回流。
6. 每隔一天使用卡尺监测肿瘤生长。
7. 如果肿瘤超过1500毫米^3，则处死动物。根据材料的可用性，通过二氧化碳或麻醉气体吸入或宫颈脱位对小鼠实施安乐死。

6. 脾内注射

1. 在开始之前，将手术器械（剪刀和镊子）在124°C下高压灭菌15分钟，并用70%乙醇清洁工作空间的所有表面。
2. 在微量离心管中，将细胞重悬于50μL无菌PBS中并将其储存在冰上。细胞密度可以从0.5到1百万个细胞。大量细胞可导致血栓发展到血液循环中。
3. 在注射细胞之前，皮下注射100μL0.015mg / mL丁丙诺啡，以缓解疼痛。
4. 将小鼠置于诱导室中，其中异氟醚保持在3%，持续2-3分钟。当动物不再对运动有反应时，将其放在加热垫的右侧，并使用呼吸回路面罩保持麻醉，该面罩提供O₂ 和异氟醚的气体混合物。
5. 在每只眼睛上涂抹眼部润滑剂，以避免在手术过程中眼睛干燥。用聚维酮碘溶液（即倍他丁）消毒胸部区域。
6. 在背侧，在第10根假肋骨下方用剪刀做一个0.5厘米的小切口。
7. 轻轻地将脾脏抬起，放在无菌纱布上。使用胰岛素注射器，将50μLC注射到脾脏尖端。确保注射器保持直立，等待3-5分钟以避免回流，然后取出针头。
8. 从两侧（动脉和静脉）固定脾脏血管，并通过直接在两个结扎体上方切割来切除脾脏。切除脾脏以防止该器官中不必要的肿瘤形成。
9. 缝合腹膜，然后使用5.0可降解的无菌缝合线缝合皮肤。
10. 保持小鼠温暖，直到从麻醉中完全恢复。
11. 每周监测小鼠3天的身体功能异常，运动和姿势异常以及体重减轻。
12. 当人道终点达到（手术后约6周）时牺牲动物以分析肝转移。

结果

分别由IF（图1A右图）和FACS（图1B）观察到的EpCAM和CD26表达都表明CTC线是上皮性的，并显示出CSC标志之一^10。这种上皮性状可以通过用针对其他上皮和间充质标志物的抗体染色来进一步表征。因此，可以大致知道CTC线沿着上皮 - 间充质轴的位置。其他CSC标志物的表达也可以通过免疫染色和细胞术进行测试。否则，作为耐药?...

讨论

上述方案最初用于结直肠CTC功能表征，但它可用于其他类型的癌症，如乳腺癌，并且可以适用于小鼠模型。

真正的限制因素是血液样本中存在的CTC的数量以及用于分离和扩增它们的技术的效率。已经根据特定的CTC特性描述了几种CTC分离技术，例如Parsortix，一种微流体装置，它允许根据细胞大小及其可压缩性分离CTC¹³。此外，还有CellSearch，这是一种基于免疫?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accumax solution	Sigma-Aldrich	A7089
Advanced DMEM/F-12	Gibco	12634028
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay	Promega	G7570
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix	Corning	354230
Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates,	Corning	3473
Histiogel Specimen Medium	LabStorage	HG-4000
Human EGF, premium grade	Miltenyi Biotec	130-097-751
Human FGF-2, premium grade	Miltenyi Biotec	130-093-564
L-Glutamine (200 mM)	Gibco	25030081
N-2 Supplement	Gibco	17502048
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL)	Gibco	15070063