Linee cellulari tumorali circolanti: uno strumento innovativo per la ricerca fondamentale e traslazionale

Riepilogo

La coltura di CTC consente una caratterizzazione funzionale più profonda del cancro, attraverso l'analisi dell'espressione di marcatori specifici e la valutazione della resistenza ai farmaci e della capacità di colonizzare il fegato tra le altre possibilità. Nel complesso, la cultura CTC potrebbe essere uno strumento clinico promettente per la medicina personalizzata per migliorare l'esito del paziente.

Abstract

Le metastasi sono una delle principali cause di morte per cancro. Nonostante i miglioramenti nelle strategie di trattamento, il cancro metastatico ha una prognosi sfavorevole. Ci troviamo quindi di fronte a un urgente bisogno di comprendere i meccanismi alla base dello sviluppo delle metastasi e quindi di proporre trattamenti efficaci per il cancro avanzato. I tumori metastatici sono difficili da trattare, poiché le biopsie sono invasive e inaccessibili. Recentemente, c'è stato un notevole interesse per le biopsie liquide che includono sia l'acido desossiribonucleico circolante privo di cellule (DNA) che le cellule tumorali circolanti dal sangue periferico e abbiamo stabilito diverse linee cellulari tumorali circolanti da pazienti con carcinoma colorettale metastatico per partecipare alla loro caratterizzazione. Infatti, per caratterizzare funzionalmente queste cellule rare e mal descritte, il passo cruciale è quello di espanderle. Una volta stabilite, le linee di cellule tumorali circolanti (CTC) possono quindi essere coltivate in condizioni di sospensione o aderenza. A livello molecolare, le linee CTC possono essere ulteriormente utilizzate per valutare l'espressione di specifici marcatori di interesse (come il differenziamento, le cellule staminali epiteliali o tumorali) mediante immunofluorescenza o analisi citometrica. Inoltre, le linee CTC possono essere utilizzate per valutare la sensibilità ai farmaci alle chemioterapie gold standard e alle terapie mirate. La capacità delle linee CTC di avviare i tumori può anche essere testata mediante iniezione sottocutanea di CTC in topi immunodeficienti.

Infine, è possibile testare il ruolo di specifici geni di interesse che potrebbero essere coinvolti nella disseminazione del cancro modificando i geni CTC, l'acido ribonucleico a forcina corta (shRNA) o Crispr/Cas9. Le CTC modificate possono quindi essere iniettate in milze di topo immunodeficienti, per imitare sperimentalmente parte del processo di sviluppo metastatico in vivo.

In conclusione, le linee CTC sono uno strumento prezioso per la ricerca futura e per la medicina personalizzata, dove permetteranno di prevedere l'efficienza del trattamento utilizzando proprio le cellule originariamente responsabili delle metastasi.

Introduzione

Nonostante i recenti miglioramenti nella diagnosi precoce del cancro e nella strategia terapeutica, oltre il novanta per cento della morbilità del cancro è ancora dovuto alle metastasi¹. Il processo metastatico è una cascata a più fasi che inizia con il distacco locale delle cellule dal tumore primario e il loro ingresso nel flusso sanguigno dove diventano cellule tumorali circolanti (CTC) per colonizzare infine siti distanti come fegato e polmoni, nel caso del cancro del colon-retto (CRC)². Recentemente, c'è stata una crescente attenzione alle biopsie liquide, che sono uno strumento non invasivo per rilevare ed enumerare in particolare le CTC dai campioni di sangue dei pazienti. L'eterogeneità genetica intratumorale è una delle principali cause di resistenza ai farmaci; pertanto, isolare le cellule rappresentative dal materiale tumorale costituisce uno strumento promettente per la medicina personalizzata³.

Nonostante la bassa frequenza di CTC nel sangue (1 CTC per 10⁶ - 10⁷ leucociti)⁴, sono state sviluppate diverse tecniche di rilevamento e isolamento basate sulle differenze di proprietà tra CTC e altri componenti del sangue⁵. Il numero di CTC nei campioni di sangue dei pazienti, da solo, può fornire informazioni sullo stadio della malignità, sulla risposta al trattamento e sulla progressione della malattia^6,7. Pertanto, l'isolamento CTC è uno strumento cruciale per gli studi traslazionali per valutare l'eterogeneità genetica o eseguire lo screening farmacologico, nonché per gli studi fondamentali per caratterizzare queste cellule invasive, in quanto sono gli attori chiave dell'induzione metastatica^8,9. Infatti, rispetto alle linee cellulari tumorali commercialmente stabilite che hanno accumulato migliaia di mutazioni nel tempo, le CTC fresche condividono le caratteristiche principali del tumore primario originale, inclusa una potente capacità di metastatizzare e sono un riflesso migliore della malattia. Queste caratteristiche li rendono uno strumento robusto per studi fondamentali, specialmente negli esperimenti knockout di fattori chiave previsti coinvolti nelle metastasi. L'esito di questi esperimenti può essere validato in vivo,sui topi, come descritto di seguito.

Una volta isolati i CTC, possono essere espansi in condizioni di coltura non aderenti e quindi possono essere manipolati proprio come qualsiasi linea cellulare tumorale disponibile, cioè possono ugualmente essere coltivati in condizioni aderenti o incorporati in Matrigel, a seconda della domanda scientifica¹⁰. Ad esempio, per testare l'espressione e la localizzazione di una proteina di interesse, le sfere CTC possono essere coltivate in condizioni di sospensione ed essere incorporate in Histogel per eseguire immunofluorescenza su sezioni di sfera. Inoltre, se la proteina è membranosa, la sua espressione sulle cellule viventi può essere misurata mediante citometria.

Per gli studi funzionali, per testare il ruolo di una proteina di interesse che può svolgere un ruolo nella colonizzazione epatica, le CTC con geni modificati, da shRNA o CRISPR / Cas9, possono essere iniettate nella milza di topi immunodeficienti. Quest'ultimo esperimento è un potente modello per imitare la colonizzazione delle metastasi^{epatiche 11}.

La capacità delle CTC di avviare tumori può essere valutata iniettando un numero molto piccolo di cellule in topi immuno-carenti. Poiché l'inizio del tumore è un segno distintivo delle cellule staminali tumorali (CSC), questo test indicherà la percentuale di CSC all'interno delle linee CTC. Questo fenotipo di cellule staminali rende le linee cellulari tumorali circolanti resistenti ad alcune terapie antitumorali gold standard. Le CTC espanse possono quindi essere utilizzate per lo screening dei farmaci e individuare il miglior trattamento potenzialmente efficiente per il paziente; La risposta CTC al trattamento può essere testata in vitro utilizzando, ad esempio, un test di vitalità a luminescenza.

In una prospettiva a lungo termine, lo screening farmacologico su CTC appena isolate e amplificate potrebbe essere utilizzato come nuovo strumento per la medicina personalizzata per aiutare a scegliere il trattamento più efficiente e adattato per i pazienti.

Nel presente articolo, i protocolli per la coltura di linee CTC, per colorare proteine specifiche tramite immunocolorazione e citometria, per eseguire saggi di citotossicità e esperimenti di xenotrapianto in vivo con CTC sono dettagliati.

Protocollo

Tutti i protocolli in vivo sono stati approvati dalle agenzie etiche animali.

1. Amplificazione CTC in condizioni di coltura 3D

1. Per coltivare CTC in sospensione, prima CTC di seme in pozzetti di una piastra ultra-low attachment (ULA) a 24 pozzetti alla concentrazione massima di 5 cellule / μL e in 1 mL di mezzo M12 (cioè DMEM-F12 avanzato integrato con 2 mM l-glutammina, 100 unità / mL di penicillina e streptomicina, supplemento N2, fattore di crescita epidermico 20 ng / mL e fattore di crescita fibroblasti 10 ng / mL¹⁰).
2. Per consentire la formazione della sfera e l'espansione cellulare, incubare le cellule in condizioni ipossiche (2% O₂₎tra 6 e 10 giorni.
3. Una volta che le sfere sono abbastanza grandi (100 μm), per prevenire la necrosi, dissociarle per l'amplificazione.
   1. Posizionare la sospensione cellulare in un tubo da 2 ml o in un tubo da 15 ml e centrifugare a 300 x g per 5 minuti.
   2. Rimuovere il surnatante e aggiungere 500 μL di reagente di dissociazione delicato (ad esempio, Accumax) al pellet.
   3. Vorticare delicatamente e incubare la sospensione cellulare con un delicato reagente di dissociazione per 20-30 minuti a 37 °C.
      NOTA: Il superamento del tempo di incubazione nel reagente di dissociazione delicato (Accumax) può causare un aumento anomalo della mortalità cellulare.
   4. Aggiungere 1,5 mL di Soluzione Salina Tamponata con Fosfato (PBS) e centrifugare il tubo per 5 minuti a 300 x g.
   5. Versare il surnatante e risospesare il pellet in un mezzo M12 fresco per raggiungere la densità di 1-5 cellule per μL.
   6. Seminare la sospensione cellulare in nuovi pozzetti di una piastra di fissaggio Ultra-Low: 10 mL per i palloni T75, 2 mL per 6 piastre del pozzo e 100 μL per 96 piastre del pozzo

2. Colorazione immuno-fluorescenza (IF) su sezioni di sfera CTC

1. Centrifugare le sfere CTC in un tubo da 15 ml a 300 x g per 5 minuti, aspirare il surnatante e lavare il pellet due volte con PBS.
2. Sospendere il pellet con 500 μL di paraformaldeide al 4% (PFA) e incubare per 20 minuti sul ghiaccio. Centrifugare la sospensione a 300 x g e lavare due volte con 5 ml di PBS.
3. Risospesare il pellet con (cioè da 15 a 20 μL) Histogel caldo e liquido. Con una pipetta, prendere tutta la sospensione e fare una goccia su una superficie preraffreddata a 4 °C e lasciarla polimerizzare per 5-10 minuti.
   NOTA: Lavorare velocemente per evitare la polimerizzazione della sospensione nella punta.
4. Staccare la goccia solida con la lama di un bisturi e inserirla in una cassetta di incorporamento compartimentata.
5. Eseguire i seguenti passaggi: inclusione di paraffina, sezionamento di paraffina, reidratazione della sezione, recupero dell'antigene e incubazione degli anticorpi. Questi passaggi sono gli stessi di qualsiasi tumore o organo incorporato nella paraffina ed elaborato per la colorazione di immunofluorescenza¹².
   NOTA: La cassetta può essere conservata in etanolo al 70% a 4 °C fino all'incorporamento della paraffina.

3. Analisi citometrica

1. Centrifugare le sfere CTC in un tubo da 15 ml a 300 x g per 5 minuti e lavare il pellet due volte con PBS.
2. Aspirare il surnatante e aggiungere 500 μL del reagente di dissociazione delicato al pellet.
3. Vorticare delicatamente e incubare la sospensione cellulare con il delicato reagente di dissociazione per 20-30 minuti a 37 °C.
   NOTA: Il superamento di 40 minuti di incubazione nel reagente di dissociazione delicato (Accumax) può comportare un aumento anormale della mortalità cellulare.
4. Centrifugare la sospensione cellulare per 5 minuti a 300 x g, eliminare il surnatante e risospese il pellet in 5 mL di tampone bloccante (cioè PBS con albumina sierica bovina all'1% (BSA)).
5. Passare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 40 μm per eliminare le sfere rimanenti.
6. Dopo il conteggio, mettere 200.000 cellule in tre tubi di selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS), centrifugare a 300 x g per 5 minuti e rimuovere il surnatante. Utilizzare uno dei tre tubi FACS come controllo che non riceverà alcun reagente di colorazione.
7. Secondo la scheda tecnica, aggiungere l'anticorpo appropriato nei due tubi FACS rimanenti (cioè, un anticorpo coniugato contro la proteina di interesse, un controllo isotipico coniugato).
8. Dopo il tempo di incubazione consigliato, aggiungere 300 μL del tampone bloccante per lavare le cellule, centrifugare i 3 tubi a 300 x g e aspirare il surnatante. Ripetere questo passaggio due volte. Quindi, risospesare il pellet con il tampone di blocco con un reagente di colorazione della vitalità cellulare (ad eccezione del controllo del tubo FACS senza alcuna colorazione).
9. Tenere i tubi sul ghiaccio fino all'analisi FACS. Utilizzare prima il tubo senza macchia per identificare il cancello per la vitalità cellulare e la colorazione anticorpale. Quindi analizzare il tubo FACS con l'anticorpo coniugato contro la proteina di interesse, per quantificare la percentuale di CTC che esprime la proteina di interesse. Il tubo FACS con il controllo dell'isotipo coniugato non deve indicare uno spostamento. Ciò conferma che lo spostamento è specifico per la proteina mirata di interesse.
   NOTA: Se possibile, utilizzare una linea cellulare che esprima un alto livello di proteine di interesse come controllo positivo e una linea cellulare che non esprima la proteina come controllo negativo.

4. Saggio di vitalità di luminescenza (CellTiter-Glo)

1. Risospese le CTC dissociate (come descritto al paragrafo 1.4.5) nel mezzo M12. Contare le cellule e adattare la concentrazione cellulare a 200.000 cellule / ml.
2. In una piastra ULA a 96 pozzetti, seminare 10.000 CTC dissociati per pozzetto, in 50 μL, e incubare la piastra in ipossia (2% O₂₎per 24 ore.
3. Il giorno seguente, aggiungere 50 μL del farmaco testato ai CTC. In precedenza si raccomanda di eseguire una titolazione della concentrazione del farmaco, per determinare la concentrazione inibitoria semi-massima (IC50). Trattare alcuni pozzetti con veicolo solo per determinare la vitalità delle cellule basali.
   NOTA: il numero di celle seminate può variare tra le linee CTC, a seconda del tempo di raddoppio. Inoltre, le cellule dovrebbero essere seminate in tripliceti per ridurre al minimo la variabilità dei risultati.
4. Incubare le piastre in ipossia per altre 48 ore.
5. Al giorno 3, posizionare le piastre coltivate e il tampone di vitalità della cella di luminescenza e il substrato a temperatura ambiente e ricostituire il substrato con un volume appropriato di tampone, secondo il protocollo del produttore.
6. Aggiungere 70 μL della miscela di vitalità a luminescenza in ogni piastra coltivata. Mettere le piastre su uno shaker orbitale per 20 minuti per indurre la lisi cellulare e quindi trasferire 100 μL della miscela in una piastra multi-pozzo a parete opaca, compatibile con il luminometro.
7. Lasciare riposare la piastra a temperatura ambiente, coprirla con un foglio di alluminio per stabilizzare il segnale luminescente.
   NOTA: il segnale luminescente è stabile fino a 3 ore.
8. Registra la luminescenza utilizzando un lettore di micropiastre (ad esempio, Tecan Infinite 200 Pro).
9. Per l'analisi dei dati, calcolare la media dell'unità di luce relativa triplicata RLU per condizione. Per valutare la percentuale di vitalità in base a ciascuna concentrazione di farmaco necessaria: (RLU di cellule trattate/RLU di cellule non trattate) x 100.

5. Iniezioni sottocutanee

1. In un tubo microcentrifuga, risospese le cellule in 100 μL di PBS sterile. Se il numero di cellule iniettate è basso, risospese le cellule in 1: 1 PBS / Matrigel, ridotto nei fattori di crescita, per concentrare le cellule insieme e promuovere l'inizio del tumore.
   NOTA: La densità cellulare può variare da 10 cellule (per sfidare la capacità di inizio del tumore) a 1 milione di cellule a seconda della domanda scientifica e dello scopo dell'esperimento.
2. Tirare su l'intero volume in una siringa da insulina.
3. Su un topo immunodeficente, pizzicare la pelle del fianco tra l'indice e l'anulare e inserire delicatamente l'ago alla base della pelle.
   NOTA: Questa procedura non è dolorosa e viene eseguita su topi coscienti.
4. Iniettare lentamente il volume nello stesso punto per prevenire la diffusione delle cellule. Questo creerà un piccolo bleb sotto la pelle.
5. Applicare una leggera pressione sul sito di iniezione per impedire il riflusso del volume.
6. Monitorare la crescita del tumore, a giorni alterni, utilizzando una pinza.
7. Sacrificare l'animale se il tumore supera i 1500 mm³. A seconda della disponibilità di materiale, eutanasizzare i topi per inalazione di anidride carbonica o gas anestetici o per lussazione cervicale.

6. Iniezione intrasplenica

1. Prima di iniziare, autoclave gli strumenti chirurgici (forbici e pinze) a 124 °C per 15 minuti e pulire tutte le superfici dello spazio di lavoro con il 70% di etanolo.
2. In un tubo di microcentrifuga, risospese le cellule in 50 μL di PBS sterile e conservarle sul ghiaccio. La densità cellulare può variare da 0,5 a 1 milione di cellule. Un numero maggiore di cellule può causare lo sviluppo di coaguli nella circolazione sanguigna.
3. Prima di iniettare le cellule, iniettare 100 μL di 0,015 mg/mL di buprenorfina per via sottocutanea, per alleviare il dolore.
4. Posizionare il mouse in una camera di induzione, dove l'isoflurano viene mantenuto al 3%, per 2-3 minuti. Quando l'animale non è più reattivo al movimento, mettilo sul lato destro su una piastra riscaldante e mantieni l'anestesia usando una maschera facciale a circuito respiratorio che eroga una miscela di gas di O₂ e isoflurano.
5. Applicare lubrificante per gli occhi su ciascun occhio per evitare l'asciugatura degli occhi durante l'intervento chirurgico. Disinfettare l'area toracica con la soluzione di Povidone-iodio (cioè Betadine).
6. Sul lato dorsoventrale, fare una piccola incisione di 0,5 cm usando le forbici sotto la 10a costola falsa.
7. Sollevare delicatamente la milza e adagiarla su una garza sterile. Utilizzando una siringa da insulina, iniettare i 50 μL di CTC nella punta della milza. Assicurarsi di mantenere la siringa in posizione verticale e attendere 3-5 minuti per evitare il riflusso, quindi rimuovere l'ago.
8. Ligatare i vasi splenici dai due lati (arterie e vene) e rimuovere la milza tagliando direttamente sopra le due legature. La milza viene rimossa per prevenire la formazione di tumori indesiderati in questo organo.
9. Cucire il peritoneo addominale e poi la pelle usando suture sterili degradabili 5.0.
10. Tenere il mouse caldo fino al suo completo recupero dall'anestesia.
11. Monitorare il mouse 3 giorni alla settimana per la funzione corporea anormale, il movimento anormale e la postura e per la perdita di peso.
12. Sacrificare l'animale quando i punti finali umani raggiungono (circa 6 settimane dopo l'intervento chirurgico) per analizzare le metastasi epatiche.

Risultati

Entrambe le espressioni EpCAM e CD26 osservate rispettivamente da IF (Figura 1A pannello di destra) e FACS ( Figura1B) indicano che la linea CTC è epiteliale e mostrano uno dei segni distintivi CSC¹⁰. Questo tratto epiteliale può essere ulteriormente caratterizzato dalla colorazione con anticorpi diretti contro altri marcatori epiteliali e mesenchimali. In tal modo, potrebbe essere possibile sapere approssimativamente d...

Discussione

Il protocollo sopra descritto è stato utilizzato inizialmente per la caratterizzazione funzionale del CTC del colon-retto, ma può essere utilizzato per altri tipi di cancro come il cancro al seno e può essere adattato per modelli murini.

Il vero fattore limitante è il numero di CTC presenti nel campione di sangue e l'efficienza della tecnica utilizzata per isolarle ed espanderle. Sono state descritte diverse tecniche di isolamento CTC basate su specifiche proprietà CTC come il Parsortix, ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accumax solution	Sigma-Aldrich	A7089
Advanced DMEM/F-12	Gibco	12634028
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay	Promega	G7570
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix	Corning	354230
Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates,	Corning	3473
Histiogel Specimen Medium	LabStorage	HG-4000
Human EGF, premium grade	Miltenyi Biotec	130-097-751
Human FGF-2, premium grade	Miltenyi Biotec	130-093-564
L-Glutamine (200 mM)	Gibco	25030081
N-2 Supplement	Gibco	17502048
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL)	Gibco	15070063