Líneas celulares tumorales circulantes: una herramienta innovadora para la investigación fundamental y traslacional

Resumen

El cultivo de CTC permite una caracterización funcional más profunda del cáncer, a través del ensayo de la expresión de marcadores específicos, y la evaluación de la resistencia a los medicamentos y la capacidad de colonizar el hígado, entre otras posibilidades. En general, el cultivo de CTC podría ser una herramienta clínica prometedora para la medicina personalizada para mejorar el resultado del paciente.

Resumen

La metástasis es una de las principales causas de muerte por cáncer. A pesar de las mejoras en las estrategias de tratamiento, el cáncer metastásico tiene un mal pronóstico. Por lo tanto, nos enfrentamos a una necesidad urgente de comprender los mecanismos detrás del desarrollo de la metástasis y, por lo tanto, de proponer tratamientos eficientes para el cáncer avanzado. Los cánceres metastásicos son difíciles de tratar, ya que las biopsias son invasivas e inaccesibles. Recientemente, ha habido un interés considerable en las biopsias líquidas que incluyen tanto el ácido desoxirribonucleico circulante (ADN) libre de células como las células tumorales circulantes de sangre periférica y hemos establecido varias líneas celulares tumorales circulantes de pacientes con cáncer colorrectal metastásico para participar en su caracterización. De hecho, para caracterizar funcionalmente estas células raras y mal descritas, el paso crucial es expandirlas. Una vez establecidas, las líneas de células tumorales circulantes (CTC) se pueden cultivar en condiciones de suspensión o adherentes. A nivel molecular, las líneas CTC se pueden utilizar para evaluar la expresión de marcadores específicos de interés (como la diferenciación, las células madre epiteliales o cancerosas) mediante análisis de inmunofluorescencia o citometría. Además, las líneas ctC se pueden usar para evaluar la sensibilidad a los medicamentos a las quimioterapias estándar de oro, así como a las terapias dirigidas. La capacidad de las líneas ctc para iniciar tumores también se puede probar mediante inyección subcutánea de CTC en ratones inmunodeficientes.

Finalmente, es posible probar el papel de genes específicos de interés que podrían estar involucrados en la diseminación del cáncer mediante la edición de genes CTC, mediante ácido ribonucleico de horquilla corta (shRNA) o Crispr / Cas9. Por lo tanto, los CTC modificados se pueden inyectar en bazos de ratón inmunodeficientes, para imitar experimentalmente parte del proceso de desarrollo metastásico in vivo.

En conclusión, las líneas CTC son una herramienta valiosa para futuras investigaciones y para la medicina personalizada, donde permitirán predecir la eficiencia del tratamiento utilizando las mismas células que originalmente son responsables de la metástasis.

Introducción

A pesar de las recientes mejoras en el diagnóstico precoz del cáncer y en la estrategia terapéutica, más del noventa por ciento de la morbilidad por cáncer todavía se debe a la metástasis¹. El proceso metastásico es una cascada de varios pasos que comienza con el desprendimiento local de las células del tumor primario y su entrada en el torrente sanguíneo donde se convierten en células tumorales circulantes (CTC) para finalmente colonizar sitios distantes como el hígado y los pulmones, en el caso del cáncer colorrectal (CCR)². Recientemente, ha habido una creciente atención a las biopsias líquidas, que son una herramienta no invasiva para detectar y enumerar notablemente los CTC a partir de muestras de sangre de pacientes. La heterogeneidad genética intratumoral es una de las principales causas de resistencia a los medicamentos; por lo tanto, aislar células representativas del material tumoral constituye una herramienta prometedora para la medicina personalizada³.

A pesar de la baja frecuencia de CTC en la sangre (1 CTC por 10⁶ - 10⁷ leucocitos)^4,se desarrollaron varias técnicas de detección y aislamiento basadas en diferencias de propiedad entre CTC y otros componentes de la sangre⁵. El número de CTC en las muestras de sangre de los pacientes, por sí solo, puede proporcionar información sobre la etapa de malignidad, la respuesta al tratamiento y la progresión de la enfermedad^6,7. Así, el aislamiento ctc es una herramienta crucial para los estudios traslacionales para evaluar la heterogeneidad genética o realizar el cribado farmacológico, así como para los estudios fundamentales para caracterizar estas células invasoras, ya que son los actores clave de la inducción metastásica^8,9. De hecho, en comparación con las líneas celulares de cáncer establecidas comercialmente que han acumulado miles de mutaciones a lo largo del tiempo, las CTC frescas comparten las características principales del tumor primario original, incluida una potente capacidad para hacer metástasis, y son un mejor reflejo de la enfermedad. Estas características los convierten en una herramienta robusta para estudios fundamentales, especialmente en experimentos knockout de factores clave predichos involucrados en la metástasis. El resultado de estos experimentos se puede validar in vivo, enratones, como se describe a continuación.

Una vez que los CTC están aislados, pueden expandirse en condiciones de cultivo no adherentes y luego, pueden manipularse como cualquier línea celular de cáncer disponible, es decir, pueden cultivarse igualmente en condiciones adherentes o incrustarse en Matrigel, dependiendo de la pregunta científica¹⁰. Por ejemplo, para probar la expresión y localización de una proteína de interés, las esferas ctc se pueden cultivar en condición de suspensión y se incrustan en Histogel para realizar inmunofluorescencia en secciones de esfera. Además, si la proteína es membranosa, su expresión en células vivas se puede medir por citometría.

Para estudios funcionales, para probar el papel de una proteína de interés que puede desempeñar un papel en la colonización hepática, se pueden inyectar CTC con genes editados, por shRNA o CRISPR / Cas9, en el bazo de ratones inmunodeficientes. Este último experimento es un modelo poderoso para imitar la colonización de metástasis^{hepáticas 11}.

La capacidad de los CTC para iniciar tumores se puede evaluar inyectando un número muy pequeño de células en ratones inmunodeficientes. Como la iniciación del tumor es un sello distintivo de las células madre cancerosas (CSC), este ensayo indicará el porcentaje de CSC dentro de las líneas de CTC. Este fenotipo de células madre hace que las líneas celulares tumorales circulantes sean resistentes a algunas terapias contra el cáncer estándar de oro. Por lo tanto, los CTC ampliados se pueden usar para detectar medicamentos e identificar el mejor tratamiento eficiente potencial para el paciente; La respuesta de CTC al tratamiento se puede probar in vitro utilizando un ensayo de viabilidad de luminiscencia, por ejemplo.

En una perspectiva a largo plazo, el cribado de fármacos en CTC recién aislados y amplificados podría utilizarse como una nueva herramienta para la medicina personalizada para ayudar a elegir el tratamiento más eficiente y adaptado para los pacientes.

En el presente trabajo se detallan protocolos para cultivar líneas ctc, para teñir proteínas específicas mediante inmunotinción y citometría, para realizar ensayos de citotoxicidad así como experimentos de xenoinjerto in vivo con CTC.

Protocolo

Todos los protocolos in vivo fueron aprobados por las agencias de ética animal.

1. Amplificación CTC en condiciones de cultivo 3D

1. Para cultivar CTCs en suspensión, primeros CTC de semilla en pocillos de una placa ultra-Low Attachment (ULA) de 24 pocillos a la concentración máxima de 5 células/μL y en 1 mL de medio M12 (es decir, DMEM-F12 avanzado suplementado con 2 mM l-glutamina, 100 Unit/mL de penicilina y estreptomicina, suplemento de N2, factor de crecimiento epidérmico de 20 ng/mL y factor de crecimiento de fibroblastos de 10 ng/mL^10).
2. Para permitir la formación de esferas y la expansión celular, incubar las células en condiciones hipóxicas (2% O₂₎entre 6 a 10 días.
3. Una vez que las esferas son lo suficientemente grandes (100 μm), para prevenir la necrosis, disociarlas para su amplificación.
   1. Coloque la suspensión celular en un tubo de 2 ml o un tubo de 15 ml y centrífuga a 300 x g durante 5 minutos.
   2. Retire el sobrenadante y agregue 500 μL de reactivo de disociación suave (por ejemplo, Accumax) al pellet.
   3. Vórtice suavemente e incube la suspensión celular con un reactivo de disociación suave durante 20 a 30 minutos a 37 °C.
      NOTA: Exceder el tiempo de incubación en el reactivo de disociación suave (Accumax) puede causar un aumento anormal de la mortalidad celular.
   4. Agregue 1.5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y centrifugue el tubo durante 5 minutos a 300 x g.
   5. Vierta el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en medio M12 fresco para alcanzar la densidad de 1-5 células por μL.
   6. Sembrar la suspensión celular en nuevos pocillos de una placa de fijación ultrabaja: 10 ml para matraces T75, 2 ml para placas de 6 pocillos y 100 μL para placas de 96 pocillos

2. Tinción de inmunofluorescencia (IF) en secciones de esferas de CTC

1. Centrifugue las esferas ctc en un tubo de 15 ml a 300 x g durante 5 minutos, aspire el sobrenadante y lave el gránulo dos veces con PBS.
2. Resuspend el pellet con 500 μL de paraformaldehído al 4% (PFA) e incubar durante 20 min sobre hielo. Centrifugar la suspensión a 300 x g y lavar dos veces con 5 mL de PBS.
3. Resuspend el pellet con (es decir, 15 a 20 μL) histogel caliente y líquido. Con una pipeta, tomar toda la suspensión y hacer una gota sobre una superficie preenfriada a 4 °C y dejar polimerizar durante 5 a 10 minutos.
   NOTA: Trabaje rápido para evitar la polimerización de la suspensión en la punta.
4. Separe la gota sólida con la cuchilla de un bisturí e insértela en un cassette de incrustación compartimentado.
5. Realice los siguientes pasos: inclusión de parafina, seccionamiento de parafina, rehidratación de sección, recuperación de antígenos e incubación de anticuerpos. Estos pasos son los mismos que para cualquier tumor u órgano incrustado en parafina y procesado para la tinción de inmunofluorescencia¹².
   NOTA: El cassette se puede almacenar en etanol al 70% a 4 °C hasta la incrustación de parafina.

3. Análisis de citometría

1. Centrifugar las esferas ctc de la centrífuga en un tubo de 15 ml a 300 x g durante 5 minutos y lavar el pellet dos veces con PBS.
2. Aspire el sobrenadante y agregue 500 μL del reactivo de disociación suave al pellet.
3. Vórtice suavemente e incube la suspensión celular con el reactivo de disociación suave durante 20 a 30 min a 37 °C.
   NOTA: Exceder los 40 min de incubación en el reactivo de disociación suave (Accumax) puede resultar en un aumento anormal de la mortalidad celular.
4. Centrifugar la suspensión celular durante 5 min a 300 x g, eliminar el sobrenadante y resuspendir el pellet en 5 mL de tampón de bloqueo (es decir, PBS con albúmina sérica bovina al 1% (BSA)).
5. Pase la suspensión celular a través de un colador celular de 40 μm para eliminar las esferas restantes.
6. Después de contar, coloque 200,000 células en tres tubos de clasificación celular activados por fluorescencia (FACS), centrífuga a 300 x g durante 5 minutos y retire el sobrenadante. Utilice uno de los tres tubos FACS como control que no recibirá ningún reactivo de tinción.
7. De acuerdo con la hoja de datos, agregue el anticuerpo apropiado en los dos tubos FACS restantes (es decir, un anticuerpo conjugado contra la proteína de interés, un control de isotipo conjugado).
8. Después del tiempo de incubación recomendado, agregue 300 μL del tampón de bloqueo para lavar las células, centrífuga los 3 tubos a 300 x g y aspire el sobrenadante. Repita este paso dos veces. Luego, vuelva a suspender el pellet con el tampón de bloqueo con un reactivo de tinción de viabilidad celular (excepto para el control del tubo FACS sin ninguna tinción).
9. Mantenga los tubos en hielo hasta el análisis FACS. Use primero el tubo sin manchas para identificar la puerta para la viabilidad celular y la tinción de anticuerpos. A continuación se analiza el tubo FACS con el anticuerpo conjugado frente a la proteína de interés, para cuantificar el porcentaje de CTC que expresa la proteína de interés. El tubo FACS con el control de isotipo conjugado no debe indicar un desplazamiento. Esto confirma que el cambio es específico de la proteína objetivo de interés.
   NOTA: Si es posible, utilice una línea celular que exprese un alto nivel de proteína de interés como control positivo y una línea celular que no exprese la proteína como control negativo.

4. Ensayo de viabilidad de luminiscencia (CellTiter-Glo)

1. CtC disociadas resuspendidas (como se describe en la sección 1.4.5) en medio M12. Contar las células y adaptar la concentración celular a 200.000 células/ml.
2. En una placa ULA de 96 pocillos, sembrar 10.000 CTC disociados por pozo, en 50 μL, e incubar la placa en hipoxia (2% O₂₎durante 24 h.
3. Al día siguiente, agregue 50 μL del medicamento probado a los CTC. Previamente se recomienda realizar una titulación de la concentración del fármaco, para determinar la concentración inhibitoria máxima media (IC50). Trate algunos pozos con vehículo solo para determinar la viabilidad de las células basales.
   NOTA: El número de células sembradas puede diferir entre las líneas ctC, dependiendo de su tiempo de duplicación. Además, las células deben sembrarse por triplicado para minimizar la variabilidad de los resultados.
4. Incubar placas en hipoxia durante otras 48 h.
5. En el día 3, coloque las placas cultivadas y el tampón de viabilidad de la célula de luminiscencia y el sustrato a temperatura ambiente y reconstituya el sustrato con un volumen adecuado de tampón, de acuerdo con el protocolo del fabricante.
6. Agregue 70 μL de la mezcla de viabilidad de luminiscencia en cada pozo de placa cultivada. Coloque las placas en un agitador orbital durante 20 minutos para inducir la lisis celular y luego transfiera 100 μL de la mezcla a una placa de múltiples pocillos de pared opaca, compatible con el luminómetro.
7. Deje que la placa descanse a temperatura ambiente, cúbrala con papel de aluminio para estabilizar la señal luminiscente.
   NOTA: La señal luminiscente es estable hasta por 3 horas.
8. Registre la luminiscencia utilizando un lector de microplacas (es decir, Tecan Infinite 200 Pro).
9. Para el análisis de los datos, calcule la media de la unidad de luz relativa triplicada RLU por condición. Evaluar el porcentaje de viabilidad según cada concentración de fármaco necesaria: (RLU de células tratadas/RLU de células no tratadas) x 100.

5. Inyecciones subcutáneas

1. En un tubo de microcentrífuga, resuspenda las células en 100 μL de PBS estéril. Si el número de células inyectadas es bajo, resuspenda las células en PBS/Matrigel 1:1, reducidas en factores de crecimiento, para concentrar las células juntas y promover la iniciación del tumor.
   NOTA: La densidad celular puede ser de 10 células (para desafiar la capacidad de iniciación del tumor) a 1 millón de células dependiendo de la pregunta científica y el objetivo del experimento.
2. Extraiga el volumen completo en una jeringa de insulina.
3. En un ratón inmunodeficiente, pellizque la piel del flanco entre el índice y el dedo anular e inserte suavemente la aguja en la base de la piel.
   NOTA: Este procedimiento no es doloroso y se realiza en ratones conscientes.
4. Inyecte lentamente el volumen en el mismo lugar para evitar la propagación de las células. Esto creará una pequeña ampolla debajo de la piel.
5. Aplique una presión suave en el sitio de inyección para evitar el reflujo del volumen.
6. Controle el crecimiento del tumor, cada dos días, usando una pinza.
7. Sacrificar al animal si el tumor supera los 1500 mm³. Dependiendo de la disponibilidad de material, sacrificar a los ratones por inhalación de dióxido de carbono o gases anestésicos o por luxación cervical.

6. Inyección intraesplénica

1. Antes de comenzar, autoclave los instrumentos quirúrgicos (tijeras y fórceps) a 124 °C durante 15 min y limpie todas las superficies del espacio de trabajo con etanol al 70%.
2. En un tubo de microcentrífuga, resuspender las células en 50 μL de PBS estéril y almacenarlas en hielo. La densidad celular puede ir de 0,5 a 1 millón de células. Un mayor número de células puede causar el desarrollo de coágulos en la circulación sanguínea.
3. Antes de inyectar las células, inyecte 100 μL de 0.015 mg / ml de buprenorfina por vía subcutánea, para aliviar el dolor.
4. Coloque el ratón en una cámara de inducción, donde el isoflurano se mantiene al 3%, durante 2-3 min. Cuando el animal ya no responda al movimiento, colóquelo en su lado derecho sobre una almohadilla térmica y mantenga la anestesia utilizando una máscara facial de circuito respiratorio que administra una mezcla de gases de O₂ e isoflurano.
5. Aplique lubricante para los ojos sobre cada ojo para evitar el secado de los ojos durante la cirugía. Desinfecte el área torácica con solución de povidona yodada (es decir, betadina).
6. En el lado dorsoventral, haga una pequeña incisión de 0,5 cm usando tijeras debajo de la 10ª costilla falsa.
7. Levante suavemente el bazo y colóquelo sobre una gasa estéril. Usando una jeringa de insulina, inyecte los 50 μL de CTC en la punta del bazo. Asegúrese de mantener la jeringa en posición vertical y espere de 3 a 5 minutos para evitar el reflujo y luego retire la aguja.
8. Ligar los vasos esplénicos de los dos lados (arterias y venas) y extirpar el bazo cortando directamente por encima de las dos ligaduras. El bazo se extirpa para prevenir la formación de tumores no deseados en este órgano.
9. Sutura el peritoneo abdominal y luego la piel usando suturas estériles degradables 5.0.
10. Mantenga al ratón caliente hasta su recuperación completa de la anestesia.
11. Controle al ratón 3 días a la semana para detectar funciones corporales anormales, movimientos y posturas anormales y para perder peso.
12. Sacrifique al animal cuando alcancen puntos finales humanitarios (aproximadamente 6 semanas después de la cirugía) para analizar la metástasis hepática.

Resultados

Tanto las expresiones EpCAM como CD26 observadas por IF (Panel derechode laFigura 1A) y FACS(Figura 1B)respectivamente, indican que la línea CTC es epitelial y muestran una de las características de CSC¹⁰. Este rasgo epitelial se puede caracterizar aún más por la tinción con anticuerpos dirigidos contra otros marcadores epiteliales y mesenquimales. De este modo, podría ser posible saber aproximadamente dónde está ...

Discusión

El protocolo descrito anteriormente se utilizó inicialmente para la caracterización funcional de ctC colorrectal, pero se puede usar para otros tipos de cáncer como el cáncer de mama y se puede adaptar para modelos de ratón.

El factor limitante real es el número de CTC presentes en la muestra de sangre y la eficiencia de la técnica utilizada para aislarlos y expandirlos. Se han descrito varias técnicas de aislamiento ctc basadas en propiedades específicas de CTC como el Parsortix, un ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accumax solution	Sigma-Aldrich	A7089
Advanced DMEM/F-12	Gibco	12634028
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay	Promega	G7570
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix	Corning	354230
Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates,	Corning	3473
Histiogel Specimen Medium	LabStorage	HG-4000
Human EGF, premium grade	Miltenyi Biotec	130-097-751
Human FGF-2, premium grade	Miltenyi Biotec	130-093-564
L-Glutamine (200 mM)	Gibco	25030081
N-2 Supplement	Gibco	17502048
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL)	Gibco	15070063