循環腫瘍細胞株:基礎的・翻訳的研究のための革新的なツール

要約

CTCを培養することで、特定のマーカー発現をアッセリングし、薬剤耐性や肝臓を植民地化する能力を評価することによって、癌のより深い機能的特徴付けが可能になります。全体的に、CTC培養は、患者の転帰を改善するためのパーソナライズされた医療のための有望な臨床ツールである可能性があります。

要約

転移は癌死の主な原因である。治療戦略の改善にもかかわらず、転移性癌は予後が悪い。そこで、転移のメカニズムを理解し、進行癌に対して効率的な治療法を提案することが急務に直面する。転移性癌は、生検が侵襲的でアクセス不能であるため、治療が困難である。近年、末梢血から細胞を含まない循環性デオキシリボ核酸(DNA)と循環腫瘍細胞の両方を含む液体生検に大きな関心があり、転移性大腸癌患者からいくつかの循環腫瘍細胞株を確立し、その特性評価に参加しています。確かに、これらの稀で十分に記述されていない細胞を機能的に特徴付けるためには、重要なステップはそれらを拡大することです。一旦確立されると、循環腫瘍細胞(CTC)株は、懸濁または付着状態で培養することができる。分子レベルでは、CTCラインは、免疫蛍光または細胞測定分析による関心のある特定のマーカー(分化、上皮、癌幹細胞など)の発現を評価するためにさらに使用することができる。さらに、CTCラインは、ゴールドスタンダード化学療法および標的療法に対する薬物感受性を評価するために使用することができる。腫瘍を開始するCTCラインの能力は、免疫不全マウスにおけるCTCの皮下注射によっても試験することができる。

最後に、短いヘアピンリボ核酸(shRNA)またはCrispr/Cas9によってCTC遺伝子を編集することによって、癌の播種に関与する可能性のある特定の関心遺伝子の役割をテストすることが可能である。このようにして修飾CTCを免疫不全マウス脾臓に注入することができ、 インビボにおける転移開発プロセスの一部を実験的に模倣することができる。

結論として、CTCラインは、将来の研究とパーソナライズされた医療のための貴重なツールであり、もともと転移を担っている細胞を使用して治療効率を予測することができます。

概要

早期癌診断および治療戦略における最近の改善にもかかわらず、癌罹患率の90%以上は転移^{によるものである。}転移過程は、原発腫瘍からの細胞の局所剥離と、それらが循環腫瘍細胞(CTC)となる血流への入り口から始まり、最終的に肝臓および肺などの遠方部位を植民地化する多段階カスケードである、大腸癌(CRC)2の場合。最近では、患者の血液サンプルからCTCを検出して列挙するための非侵襲的なツールである液体生検への注目が高まっています。腫瘍内の遺伝的不均一性は薬剤耐性の主要な原因である;したがって、代表的な細胞を腫瘍材料から分離することは、個別化医療³のための有望なツールを構成する。

血液中のCTCの低頻度(106-10 ⁷白血球あたり1CTC)4にもかかわらず、CTCと血液⁵の他の成分との間の特性の違いに基づいていくつかの検出および分離技術が開発された。患者の血液サンプル中のCTCの数は、単独で、悪性腫瘍の段階、治療応答および疾患進行に関する情報^を提供することができる^6、7。したがって、CTC単離は、遺伝的不均一性を評価したり、薬物スクリーニングを行ったりするための翻訳研究や、転移誘導^8,9の主要なアクターであるこれらの侵襲性細胞を特徴付けるための基礎的研究にとって重要なツールである。実際、時間の経過とともに何千もの突然変異を蓄積した商業的に確立された癌細胞株と比較して、新鮮なCTCは転移する強力な能力を含む元の原発性腫瘍の主な特徴を共有し、疾患のより良い反映である。これらの特徴は、特に転移に関与する予測された重要な要因のノックアウト実験において、基礎研究のための堅牢なツールです。これらの実験の結果は、以下に説明されるように、マウス上でインビボで検証することができる。

CTCが単離されると、それらは非接着性培養条件で拡大することができ、その後、それらは利用可能な癌細胞株と同じように操作することができ、すなわち、科学的な質問¹⁰に応じて、同じように接着状態で培養またはマトリゲルに埋め込むことができる。例えば、目的のタンパク質の発現および局在を試験するために、CTC球体を懸濁状態で増殖させ、ヒストゲルに埋め込んで球部に免疫蛍光を行うことができる。また、タンパク質が膜状であれば、生細胞に対するその発現は細胞測定によって測定することができる。

機能研究のために、肝コロニー形成に役割を果たす可能性のある目的のタンパク質の役割を試験するために、遺伝子を編集したCTCは、shRNAまたはCRISPR/Cas9によって、免疫不全マウスの脾臓に注入することができる。この後者の実験は、肝転移コロニー形成¹¹を模倣する強力なモデルである。

CTCが腫瘍を開始する能力は、非常に少数の細胞を免疫欠損マウスに注入することによって評価することができる。腫瘍開始は癌幹細胞(CSC)の特徴であるため、このアッセイはCTCライン内のCSCの割合を示す。この幹細胞表現型は、循環腫瘍細胞株をいくつかのゴールドスタンダード癌療法に耐性にする。拡張されたCTCは、したがって、薬物をスクリーニングし、患者のための最良の潜在的な効率的な治療を特定するために使用することができます。治療に対するCTC応答は、例えば発光生存アッセイを用いてインビトロで試験することができる。

長期的な観点から、新たに単離され増幅されたCTCの薬物スクリーニングは、患者のための最も効率的で適応された治療法を選択するのに役立つパーソナライズされた医療のための新しいツールとして使用することができます。

本論文では、CTCラインを培養するためのプロトコル、免疫染色および細胞測定を介して特定のタンパク質を染色し、CTCを用いた生体内異種移植実験と同様に細胞傷害アッセイを行う方法が詳述されている。

プロトコル

すべての生体内プロトコルは、動物倫理機関によって承認されました。

1. 3D培養条件におけるCTC増幅

1. 懸濁液中のCTCを培養するには、超低添付着物(ULA)24ウェルプレートのウェル内の第1シードCTCを5細胞/μLの最大濃度で、M12培地の1mL(すなわち、 高度なDMEM-F12は、2 mM l-グルタミン、100単位/mLペニシリンおよびストレプトマイシン、N2サプリメント、20 ng/mL表皮成長因子および10 ng/mL芽線維増殖因子¹⁰を添加した。
2. 球体形成と細胞増殖を可能にするために、細胞を低酸素状態(2%O2)で6~10日間インキュベートする。
3. 球体が十分な大きさ(100 μm)になったら、壊死を防ぐために、増幅のためにそれらを解約する。
   1. 細胞懸濁液を2mLチューブまたは15mLチューブに入れ、遠心分離機を300xgで5分間置きます。
   2. 上清を取り除き、ペレットに500μLの穏やかな解離試薬(例えば、Accumax)を加えます。
   3. 37°Cで20~30分間穏やかな解離試薬で細胞懸濁液を穏やかにインキュベートします。
      注:穏やかな解離試薬(Accumax)でインキュベーション時間を超えると、細胞死亡率が異常に増加する可能性があります。
   4. リン酸緩衝生理食塩水(PBS)1.5mLを加え、300 x gで5分間チューブを遠心分離します。
   5. 上清を注ぎ、新鮮なM12培地でペレットを再懸濁して、μL当たり1〜5細胞の密度に達します。
   6. 超低い付着プレートの新しいウェルに細胞懸濁液をシード:T75フラスコ用10mL、6ウェルプレート用2mL、96ウェルプレートの場合は100 μL

2. CTC球部における免疫蛍光(IF)染色

1. CTCの遠心分離機は、300 x gで15 mLチューブに5分間、上清を吸引し、ペレットをPBSで2回洗浄します。
2. 4%パラホルムアルデヒド(PFA)の500 μLでペレットを再懸濁し、氷上で20分間インキュベートします。懸濁液を300xgで遠心分離し、5mLのPBSで2回洗浄する。
3. ペレットを熱く液体ヒストゲル(すなわち、15~20 μL)で再懸濁します。ピペットで、すべての懸濁液を取り、4°Cで予冷した表面に液滴を作り、5〜10分間重合させます。
   注:先端に懸濁液の重合を避けるために速く働きます。
4. メスの刃で固体液滴を取り外し、コンパートメント埋め込みカセットに挿入します。
5. パラフィン含有、パラフィン切裂、切除、抗原検索および抗体インキュベーションの手順を実行します。これらのステップは、パラフィンに埋め込まれた任意の腫瘍または器官と同様であり、免疫蛍光染色¹²のために処理される。
   注:カセットは、パラフィン埋め込みまで4°Cで70%エタノールに保存することができます。

3. 細胞測定分析

1. 遠心CTCは300 x gで15mLチューブに5分間球を入れ、ペレットをPBSで2回洗浄します。
2. 上清を吸引し、ペレットに穏やかな解離試薬の500 μLを加えます。
3. 37°Cで20~30分間穏やかな解離試薬で細胞懸濁液を穏やかにインキュベートします。
   注:穏やかな解離試薬(Accumax)のインキュベーションの40分を超えると、異常な細胞死亡率の増加をもたらす可能性があります。
4. 遠心分離細胞懸濁液を300xgで5分間、上清を除去し、ブロック緩衝液の5mL(すなわち、1%ウシ血清アルブミン(BSA)を有するPBS)の中にペレットを再懸濁させる。
5. 40 μmのセルストレーナーを通して細胞懸濁液を通過し、残りの球を除去します。
6. 計数後、200,000個の細胞を3つの蛍光活性化細胞選別(FACS)チューブに入れ、遠心分離機を300xgで5分間入れ、上清を取り除きます。3つのFACSチューブのうちの1つを、染色試薬を受け取らないコントロールとして使用してください。
7. データシートによれば、残りの2つのFACSチューブに適切な抗体を加える(すなわち、目的のタンパク質に対する1つの共役抗体、1つの共役アイソタイプ対照)。
8. 推奨インキュベーション時間の後、ブロッキングバッファーの300 μLを加えて細胞を洗浄し、3管を300 x gで遠心分離し、上清を吸引します。この手順を 2 回繰り返します。次いで、細胞生存性染色試薬を用いてブロッキング緩衝液を用いてペレットを再懸濁する(染色を行わないFACSチューブ制御を除く)。
9. FACS分析までチューブを氷の上に置いてください。細胞生存率と抗体染色のためのゲートを識別するために、染色せずに最初のチューブを使用してください。次に、FACSチューブを対象のタンパク質に対して共役抗体で分析し、目的のタンパク質を発現するCTCの割合を定量化する。共役アイソタイプ制御を有するFACSチューブは、シフトを示すべきではない。これは、シフトが対象の標的タンパク質に特異的であることを確認します。
   注:可能であれば、目的のタンパク質の高レベルを発現する細胞株を陽性対照として使用し、陰性対照としてタンパク質を発現しない細胞株を使用してください。

4. 発光の生存率アッセイ(セルテイヤーグロ)

1. M12 メディアで解離された CTC (セクション 1.4.5 で説明) を再中断します。細胞を数え、細胞濃度を200,000細胞/mLに適応させます。
2. ULA 96ウェルプレートでは、種子10,000の解約CTC(1ウェルあたり50μL)で、低酸素(2%O2)でプレートを24時間インキュベートします。
3. 翌日、CTCに50μLの試験薬を添加する。薬物濃度の滴定を行い、半最大阻害濃度(IC50)を決定することが推奨される。基礎細胞の生存率を決定するためだけに車両でいくつかの井戸を扱います。
   注: シードされるセルの数は、CTC ラインの間で、倍の時間によって異なる場合があります。また、結果の変動を最小限に抑えるために、細胞を三量体で播種する必要があります。
4. さらに48時間低酸素下のプレートをインキュベートする。
5. 3日目に、培養プレートと発光細胞の生存率バッファーと基板を室温に置き、メーカーのプロトコルに従って、適切な量のバッファーで基板を再構成する。
6. 各培養プレートに70μLの発光生用混合を加えます。プレートを軌道シェーカーに20分間置いて細胞のリシスを誘導し、100 μLの混合を不透明な壁面のマルチウェルプレートに移し、照明メーターと互換性があります。
7. プレートを室温で休ませ、発光信号を安定させるためにアルミホイルで覆います。
   注:発光信号は3時間まで安定しています。
8. マイクロプレートリーダー(テカン無限200 Pro)を使用して発光を記録します。
9. データ解析では、条件ごとに相対光単位 RLU の三重化の平均を計算します。必要な各薬剤濃度に応じた生存率の割合を評価するには:(未処理細胞の処理細胞/RLUのRLU)x 100。

5. 皮下注射

1. マイクロ遠心チューブで、100 μLの無菌PBSで細胞を再懸濁します。注入された細胞の数が少ない場合、細胞を1:1 PBS/Matrigelで再懸濁し、増殖因子で減少させ、細胞を一緒に濃縮し、腫瘍開始を促進する。
   注:細胞密度は、科学的な質問と実験の目的に応じて、10個の細胞(腫瘍開始能力に挑戦する)から100万個の細胞までであり得る。
2. インスリン注射器でフルボリュームを引き上げる。
3. 免疫欠乏マウスで、インデックスと薬指の間の側面の皮膚をつまみ、皮膚の基部に針をそっと挿入します。
   注:この手順は痛みがなく、意識的なマウスで行われます。
4. 細胞の広がりを防ぐために、同じ場所にゆっくりとボリュームを注入します。これは、皮膚の下に小さなブレブを作成します。
5. 注入部位に穏やかな圧力をかけ、体積の逆流を防ぎます。
6. 1日おきに、キャリパーを使用して腫瘍の成長を監視する。
7. 腫瘍が1500mm3を超える場合は、動物を犠牲^にする。材料の可用性に応じて、二酸化炭素または麻酔ガス吸入または頸部脱臼によってマウスを安楽死させる。

6. 脾臓内注射

1. 開始する前に、手術器具(はさみと鉗子)を124°Cで15分間オートクレーブし、70%エタノールで作業スペースのすべての表面を清掃してください。
2. マイクロ遠心チューブでは、50 μLの無菌PBSで細胞を再懸濁し、氷の上に保管します。細胞密度は0.5から100万の細胞に行くことができます。より多くの細胞が血行に血栓の発達を引き起こす可能性があります。
3. 細胞を注入する前に、痛みを軽減するために、0.015 mg/mLブプレノルフィンを皮下に100μL注入します。
4. イオブルランが3%で維持される誘導室にマウスを2〜3分間置きます。動物が動きに反応しなくなったら、加熱パッドの右側に置き_、O2 とイソフルランのガス混合物を送達する呼吸回路フェイスマスクを使用して麻酔を維持します。
5. 手術中の眼の乾燥を避けるために、各目の上に目の潤滑剤を塗布してください。ポビドネ-ヨウ素溶液(すなわちベタジン)で胸部領域を消毒する。
6. ドーソベントラル側で、10番目の偽の肋骨の下のはさみを使用して0.5cmの小さな切開を行います。
7. 脾臓をそっと持ち上げ、滅菌ガーゼの上に置きます。インスリン注射器を使用して、脾臓の先端に50μLのCTCを注入する。シリンジを直立状態に保ち、3~5分待って逆流を防ぎ、針を外します。
8. 両側(動脈と静脈)から脾臓の血管をリゲートし、2つの合字の真上を切断することによって脾臓を取り除きます。脾臓は、この器官の不要な腫瘍形成を防ぐために除去される。
9. 腹部腹膜を縫い合わせ、5.0分解性の無菌縫合糸を使用して皮膚をステッチします。
10. 麻酔から完全に回復するまで、マウスを暖かく保ちます。
11. 異常な身体機能、異常な動きや姿勢、体重減少のために週3日マウスを監視します。
12. ヒトの終点が到達したときに動物を犠牲にする (手術後約 6 週間) 肝臓転移を分析します。.

結果

IF(図1A右パネル)およびFACS(図1B)で観察されたEpCAMおよびCD26の両方の式は、CTC線が上皮であることを示し、CSCの特徴¹⁰の1つを表示する。この上皮形質は、他の上皮および間葉系マーカーに対する抗体による染色によってさらに特徴付けることができる。それにより、上皮間葉軸に沿ってCTC線がどこであるかをほぼ知るこ...

ディスカッション

上述のプロトコルは、最初は大腸CTC機能特性評価に使用されたが、乳癌などの他のタイプの癌に使用することができ、マウスモデルに適応することができる。

実際の制限要因は、血液サンプルに存在するCTCの数と、それらを分離および拡大するために使用される技術の効率です。いくつかのCTC分離技術は、Parsortixのような特定のCTC特性に基づいて記述されている、マイ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accumax solution	Sigma-Aldrich	A7089
Advanced DMEM/F-12	Gibco	12634028
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay	Promega	G7570
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix	Corning	354230
Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates,	Corning	3473
Histiogel Specimen Medium	LabStorage	HG-4000
Human EGF, premium grade	Miltenyi Biotec	130-097-751
Human FGF-2, premium grade	Miltenyi Biotec	130-093-564
L-Glutamine (200 mM)	Gibco	25030081
N-2 Supplement	Gibco	17502048
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL)	Gibco	15070063