一种从人类多能干细胞中生成肾类器官的简化方法

摘要

在这里，我们描述了一种从人类多能干细胞（hPSCs）生成肾类器官的方案。该方案在两周内产生肾脏类器官。所得的类肾类器官可以在大型旋转瓶或多孔磁力搅拌板中培养，以进行平行的药物测试方法。

摘要

由hPSCs产生的肾类器官提供了无限的肾组织来源。人肾类器官是研究肾脏疾病和损伤，开发基于细胞的疗法以及测试新疗法的宝贵工具。对于此类应用，需要大量均匀的类器官和高度可重复的测定。我们以之前发布的类肾类器官方案为基础，以改善类器官的整体健康状况。这种简单，强大的3D方案涉及在含有脂质，胰岛素 - 转铁蛋白 - 硒 - 乙醇胺补充剂和聚乙烯醇的最小组分培养基中形成均匀的胚体，使用GSK3抑制剂（CHIR99021）3天，然后在含有敲除血清置换（KOSR）的培养基中培养。此外，搅拌测定可以减少胚体的结块并保持均匀的大小，这对于减少类器官之间的变异性非常重要。总体而言，该协议为产生大量肾类器官提供了一种快速，高效且具有成本效益的方法。

引言

近年来，已经开发了许多将人类多能干细胞分化为肾类器官的方案^{1，2，3，4，5}。类肾类化合物为研究新的再生医学方法，模拟肾脏相关疾病，进行毒性研究和治疗药物开发提供了重要工具。尽管它们具有广泛的适用性，但肾脏类器官具有局限性，例如缺乏成熟，体外长期培养能力有限，以及缺乏在人肾中发现的几种细胞类型^6，7，8。最近的工作重点是通过修改现有方案⁹，^10，11，¹²来提高类器官成熟水平^，延长培养期并扩大肾细胞群的复杂性。在我们已建立的方案^5，13的当前迭代中，我们将方案第一阶段的培养基组分修改为补充胰岛素 - 转铁蛋白 - 硒 - 乙醇胺（ITSE），脂质，聚乙烯醇（E5-ILP）和CHIR99021的无血清基础培养基（图1）。这些变化提供了一种完全定义的、无血清的低蛋白培养基，其成分比我们以前的培养基组成^5，13少，并且没有额外的生长因子。因此，与我们之前发布的版本相比，第一阶段培养基的制备劳动强度较低，并且可以减少批次之间的差异⁵。先前的研究表明，胰岛素和转铁蛋白在无血清培养^14，15中都很重要，然而，高水平的胰岛素可以抑制中胚层分化¹⁶。我们保持了原始方案中规定的低胰岛素水平，并在测定的第二阶段进一步降低了KOSR（含胰岛素）的水平。根据肾类器官形成的其他方案，较低水平的KOSR有利于维持肾组织增殖和分化之间的平衡¹⁷。此外，我们还降低了II期培养基¹³中的葡萄糖浓度。

我们的方法描述了一种用于肾类器官悬浮测定的设置，从^{原始出版物5}，13中所述的初始〜60%融合hPSC 100mm培养板中产生多达^约1，000个类器官。该协议可以很容易地扩展到从多个100 mm或150 mm板开始，以进一步增加类器官的数量。

研究方案

所有使用hPSC的实验均按照机构指南进行，并在II类生物安全罩中进行，并配有适当的个人防护装备。除非另有说明，否则所有试剂均为细胞培养级。将所有培养物在37°C，5%CO₂ 空气气氛中孵育。在测定的所有阶段，可以收集胚体或肾类器官，并固定或准备用于分析。用于生成此数据的hPSC线已经过完全表征并已发布¹⁸。

1. 制备培养板

注意:在分裂hPSCs之前约1小时，用干细胞合格的基底膜基质提取物（BME）涂覆2 x 100mm组织培养板。可以预先涂覆板，用石蜡膜密封它们，并根据制造商的说明储存在4°C。

1. 在II类生物安全罩中制备2 x 100 mm组织培养处理的板（1个用于肾脏类器官测定，1个用于维持细胞系）和15 mL锥形管。
2. 将 8 mL 冷的、无血清的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM） 等分试样放入 15 mL 锥形管中，将约 4 mL 放入每个 100 mm 板中，足以用培养基覆盖每个板的底部。
3. 从冰箱（-20°C）中取出100μL等分试样的BME。使用 2 mL 血清移液器，从 15 mL 锥形管中取出约 1 mL 冷 DMEM。通过用冷的DMEM轻轻上下移液来慢慢解冻BME等分试样，避免产生气泡。
   注意:不要让BME等分试样在室温下放置。立即使用。
4. 将解冻的 DMEM/BME 与剩余的 DMEM 一起移回 15 mL 锥形管中。使用10 mL血清学移液器，通过上下移液至少8次来轻轻混合稀释的BME，以均匀分散BME，避免产生气泡。
5. 用DMEM将4mL稀释的BME转移到每个板中，并轻轻旋转板，使BME均匀分布。将包覆板在室温下孵育1小时或在37°C下孵育30分钟。
   注意:每100毫米板使用50μL BME。使用其他hPSC培养基和细胞系可能需要不同浓度的BME。

2. 传代 hPSC

注意:对于常规hPSC培养，以70-80%汇合度传代细胞系。

1. 从hPSC板中抽出要传代的培养基。向hPSC板中加入约8 mL Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（DPBS），轻轻旋转以洗涤细胞。
2. 吸出DBPS，并向100 mm平板中加入2 mL温和细胞解离试剂（GCDR），逐滴滴在顶部以覆盖细胞。
   注:也可以使用其他解离试剂。相应地进行调整。
3. 在室温下孵育约6-8分钟，直到菌落破裂并且细胞在相差下屈光（图2A）。
   注意:不同细胞系的时间可能有所不同。相应地进行调整。
4. 孵育时，准备50 mL锥形管。加入16 mL hPSC培养基（每100mm板8mL），并加入Rho相关激酶抑制剂（ROCKi）至终浓度为5μM。
5. 从 BME 包被的板中吸出 DMEM，并向每个板中加入 8 mL hPSC 培养基和 ROCKi。
6. 当细胞准备就绪时（如图2A第2.3点 所述），吸出GCDR并将板向实验者倾斜约45°，并用细胞提升器刮擦细胞。
   注意:如果细胞正在脱模，请省略吸气GCDR并继续。
7. 将板旋转约90°并再次刮擦以抬起剩余的细胞。保持平板〜45°，并使用10mL血清学移液管用3mL hPSC培养基冲洗细胞。
8. 轻轻地上下移液以破碎大团块（不超过2-3次），并将细胞以适当的比例接种感兴趣的细胞系到制备的平板上。将板与细胞一起放入培养箱中，并以数字8运动轻轻移动板以均匀分布细胞。
   注意:在该实验中，hPSC细胞系以1:5的比例分裂，这对于其他细胞系和条件可能会有所不同。让盘子在一夜之间不受干扰。
9. 〜24小时后，检查细胞的附着。寻找附着的小个体菌落。吸出用过的培养基，并用8毫升新鲜hPSC培养基补充（不添加ROCKi）。
10. 继续每天观察和进食，直到细胞达到~60%汇合度以开始肾类器官测定（通常在传代后达到48至72小时）。理想情况下，菌落将是离散的，而不是合并的（图2B）。
    注意:将细胞限制在不超过80%的汇合度以保持其多能性状态非常重要。融合培养、粗暴处理或更高通道可能导致不必要的自发分化或肾类器官形成的低效率。

3. 第0天 - 设置肾脏类器官测定

1. 在开始之前，根据配方准备E5-ILP和Stage II培养基（表1 和 表2）。
   注意:介质可在 4 °C 下储存长达 14 天。
2. 对于一个肾脏类器官测定（一个6孔板需要一个100mm培养板），在50mL锥形管中制备完整的E5-ILP培养基:18mL E5-ILP，补充8μM CHIR99021（14.4μL），3.3μM ROCKi（6μL），0.1mM β-巯基乙醇（32.7μL）。
3. 将2 mL完整的E5-ILP培养基放入6孔超低附着板的每个孔中。
4. 用~8 mL的DPBS以〜60%汇合度洗涤hPSCs（图2B）两次。然后吸出DPBS然后每100mm板加入2mL分散酶，逐滴滴以覆盖细胞并在37°C下孵育6分钟。
   注意:6分钟后，菌落的边缘将开始卷曲（图2C，红色箭头），而菌落的其余部分仍然附着。如果在6分钟后未获得，则将细胞放回培养箱中再放置30秒。其它 hPSC 介质和基质可能与此时序不兼容。层粘连蛋白基BME涂层与分散酶不相容。如果基于层粘连蛋白的BME是标准的hPSC基质，则用该方法中描述的BME涂覆第1节中的一个板，以用于肾脏类器官测定。
5. 用约10毫升DPBS洗涤细胞3次。然后吸出DPBS，然后将板倾斜约45°并用细胞提升器刮下。
   注意:分散酶未失活，因此需要彻底冲洗掉。不要减少洗涤次数。
6. 使用10 mL血清学移液管用6 mL完整的E5-ILP培养基从顶部冲洗菌落。轻轻地上下移液以分解任何大菌落（2或3次通常就足够了）。
7. 通过将每孔1mL加入6孔板中来均匀分布菌落簇。将板放在放置在37°C培养箱中的轨道振荡器（设置:轨道= 30，倒数= 330°，振动= 5° - 2 s）上（图2D）。
   注意:振动特性对于类器官的充分分布和防止结块非常重要。

4. 第2天 - 半换介质喂养

注意:在48小时内，菌落簇将形成胚体。

1. 制备完整的培养基:对于一个6孔板，在15 mL锥形管中制备12 mL E5-ILP培养基+ 8μM CHIR99021。
   注意:不需要β-巯基乙醇和ROCKi。
2. 让胚体沉降在板的底部，将板倾斜〜45°，然后从顶部缓慢吸出培养基，每孔留下〜1mL。
   注意:这个阶段的胚体迅速结块。不要让它们安顿>5分钟。
3. 每孔加入2mL制备的完全培养基（第4.1节）。将盘子放回摇摇杯上。

5. 第3天 - 将胚胎体移植到II期培养基

1. 准备50 mL锥形管和DMEM（低葡萄糖）。让胚体沉淀在板的底部。将板倾斜〜45°，然后从顶部缓慢吸出培养基，每孔留下〜1mL。
2. 使用10mL血清学移液管从每个孔中仔细收集所有胚体，并将其转移到50mL锥形管中。
3. 洗涤每个孔以收集任何剩余的胚胎体与〜1mL DMEM（低葡萄糖）并将它们添加到相同的50mL锥形管中。
4. 离开胚体沉降到管的底部，〜5分钟。在等待期间，向6孔板的每个孔中加入2 mL II期培养基。使用200μm细胞过滤器切出大的胚体（>300μm）（图2E）。
   1. 使用新的50 mL锥形管，并将200 μm细胞过滤器放在顶部。使用10 mL血清学移液管在细胞过滤器上小心地移取所有胚体。
   2. 用额外的约5毫升DMEM（低葡萄糖）冲洗细胞过滤器，以收集卡在细胞过滤器中的任何胚状体。让胚体沉降到锥形管的底部。
5. 当胚体沉降时，吸出上清液并用〜10mL DMEM（低葡萄糖）洗涤。
6. 抽吸DMEM并将胚体重新悬浮在6 mL II期培养基中。
7. 将胚体移回6孔超低附着板中，将它们均匀地分布在6孔中。
8. 每隔一天按照步骤4.2和4.3中所述进行一半的介质更换。
   注意:从第3天开始，胚状体将具有"金色"和光滑的球形外观（图2F）。从〜第6天开始，单个胚体中的小管形成将变得明显，在接下来的几天中，数量增加，达到最佳数量并在第14天生长（图2G，H））。为了消除偶尔的结块形成，在目视观察肾脏类器官或没有小管的非常小的胚状体时，用步骤5.4.1和5.4.2中所述的500和200μm细胞过滤器筛出<200和大的>500μm类器官。

6. 转移到旋转瓶和喂食

注意:从第3天开始，旋转瓶可用于需要大量类器官的实验。类器官的常规转移发生在我们的实验室6-8天之间。如果没有设备，请参阅 讨论 部分，了解替代方案。

1. 将胚体转移到带有45 mL II期培养基的125 mL旋转瓶中。将磁力搅拌器速度设置为120 rpm并放入培养箱中（图2I）。
2. 为了喂养胚状体或肾脏类器官，让肾脏类器官短暂地沉降到旋转瓶的底部。从烧瓶的一侧臂上提起盖子，将吸气移液器放在里面，尖端接触对面的内壁。
3. 慢慢地将吸出移液器向下倾斜，并吸出大约一半的培养基。通过同一开口移液，用20 mL新鲜II期培养基补充。

7. 设置6孔磁力搅拌板（6MSP）

注意:如果需要测试多种条件，可以使用6MSP格式代替微调瓶。使用6MSP进行复合或肾毒素治疗。这节省了第二阶段使用的培养基量，同时通过扩散保持养分的可用性。

1. 在50mL锥形管中清洁椭圆形磁力搅拌棒，方法是在组织培养物中短暂洗涤合适的洗涤剂（如果从未使用过）或浸泡>1小时（如果以前使用过）。
2. 在无菌 DPBS 中短暂洗涤 3 次。
3. 在70%乙醇中洗涤1次5分钟，在无菌DPBS中洗涤1次。
4. 用抗粘附溶液冲洗，并在无菌DPBS和吸出物中洗涤1次。
5. 小心地，使用长无菌镊子将一个磁力搅拌棒放入具有胚体或肾类器官的6孔板的每个孔中。
6. 将板放在6MSP上，并将速度设置为120 rpm（图2J）。根据第4.2和4.3节，维持具有一半培养基变化的肾类器官。
   注意:为了使磁力搅拌棒卡入到位并开始旋转，您可能需要首先将功率水平短暂地放入100，然后在它们全部旋转后，将功率水平降低到25。

结果

在我们方案的最新版本中，肾脏类器官分化是在定义的低蛋白培养基中启动的。该测定完全在悬浮液中进行，并依赖于hPSCs分化和组织启动微管生成的先天能力。来自100mm〜60%融合hPSC培养板的单次测定通常产生500-1，000个肾脏类器官，如我们之前的出版物⁵所示。由于产生如此大量的类器官，该方案非常适合化合物测试。我们通常使用6孔格式进行化合物测试，但是，该协议可以在?...

讨论

先前的研究表明，初始方案步骤对于中间中胚层分化^5，19，20 至关重要，因此，在此阶段实施严格的培养基组成至关重要。从方案的第一阶段去除未定义的组分，例如血清，白蛋白，无蛋白杂交瘤培养基II，可能有助于提高测定²¹之间的一致分化效率。

肾细胞的代谢状态对其功能至关重要...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol	Thermo Fisher	21-985-023
Anti-adherence rinsing solution	STEMCELL Technologies	7010
CHIR99021	STEMCELL Technologies	72054	10 mM stock in DMSO
Corning disposable spinner flasks	Fisher Scientific	07-201-152
Corning Ultra-Low Attachment 6-well plates	Fisher Scientific	07-200-601
Corning Slow-Speed Stirrers	Fisher Scientific	11-495-03	Multi plate magnetic stirrer for spinner flask culture
Dispase	STEMCELL Technologies	7923	Aliquot and freeze
DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red	Thermo Fisher	11054020
DPBS 1x, no calcium, no magnesium	Thermo Fisher	14-190-250
Egg / Oval Stirring Bars	2mag	PI20106
Excelta General-Purpose Tweezers	Fisher Scientific	17-456-103	Keep sterile in the cell culture hood
EZBio Single Use Media Bottle, 250mL	Foxx Life Sciences	138-3211-FLS	Used to make PVA 10%
Falcon Standard Tissue Culture Dishes (100 mm)	Thermo Fisher	08-772E
Fisherbrand Sterile Aspirating Pipet 2mL	Fisher Scientific	14-955-135
Fisherbrand  Cell Lifters - Cell lifter	Fisher Scientific	08-100-240
Fisherbrand Multi Function 3D Rotators	Fisher Scientific	88-861-047	Orbital shaker
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix	Thermo Fisher	A1413302	BME. Aliquot on ice and freeze. Another suitable matrix alternative is Matrigel or Cultrex.
Gentle Cell Dissociation Reagent	STEMCELL Technologies	7174	GCDR
GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher	35-050-061	L-glutamine supplement.
HEPES (1M)	Thermo Fisher	15-630-080
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine	Thermo Fisher	51-500-056	ITSE
KnockOut  Serum Replacement - Multi-Species	Thermo Fisher	A3181502	KOSR. Aliquot and freeze
Lipid Mixture 1, Chemically Defined	Millipore-Sigma	L0288-100ML
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Thermo Fisher	11140-050
MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 500mL	Fisher Scientific	S2GPU05RE
MilliporeSigma  Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 250mL	Fisher Scientific	S2GPU02RE
MIXcontrol MTP / Variomag TELEcontrol MTP Control Unit	2mag	VMF 90250 U
MIXdrive 6 MTP / Variomag TELEdrive 6 MTP Microplate Stirring Drive	2mag	VMF 40600	6MSP
MP Biomedicals  7X Cleaning Solution	Fisher Scientific	MP0976670A4	Tissue culture suitable detergent. Make a 5% solution in water
mTeSR1	STEMCELL Technologies	85850	hPSC medium.TeSR-E8, NutriStem XF, and mTeSR Plus medium have also been tested and are suitable alternatives.
Nunc 50 mL Conical, Sterile Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	12-565-270
Nunc 15mL Conical Sterile Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	12-565-268
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher	15-140-122	Aliquot and freeze
Plasmocin	Invivogen	ant-mpt	Anti-mycoplasma reagent. Aliquot and freeze
pluriStrainer® 200 µm	Fisher Scientific	NC0776417	Cell strainer
pluriStrainer® 500 µm	Fisher Scientific	NC0822591	Cell strainer
Poly(vinyl alcohol) 87-90% hydrolyzed  (PVA)	Millipore-Sigma	P8136-250G	10% in DPBS stirring at 98 degrees C until disolves, make in 138-3211-FLS
ROCK inhibitor Y-27632 (ROCKi)	STEMCELL Technologies	72304	10 mM stock in DPBS
Sterile Disposable Serological Pipets  - 10mL	Fisher Scientific	13-678-11E
Sterile Disposable Serological Pipets - 25mL	Fisher Scientific	13-678-11
Sterile Disposable Serological pipette - 5 mL	Fisher Scientific	13-678-12D
TeSR-E5	STEMCELL Technologies	5916	Serum-free, low protein base medium for E5-ILP
Variomag distriBOX 2 Distributor	2mag	VMF 90512	If you use more than one MIXdrive