Une méthode simplifiée pour générer des organoïdes rénaux à partir de cellules souches pluripotentes humaines

Résumé

Nous décrivons ici un protocole pour générer des organoïdes rénaux à partir de cellules souches pluripotentes humaines (CSEh). Ce protocole génère des organoïdes rénaux en deux semaines. Les organoïdes rénaux qui en résultent peuvent être cultivés dans des flacons de spinner à grande échelle ou des plaques d’agitation magnétiques multi-puits pour des approches parallèles de test de drogues.

Résumé

Les organoïdes rénaux générés par les CSEh ont fourni une source illimitée de tissu rénal. Les organoïdes rénaux humains sont un outil inestimable pour étudier les maladies et les lésions rénales, développer des thérapies cellulaires et tester de nouvelles thérapies. Pour de telles applications, un grand nombre d’organoïdes uniformes et des tests hautement reproductibles sont nécessaires. Nous nous sommes appuyés sur notre protocole organoïde rénal publié précédemment pour améliorer la santé globale des organoïdes. Ce protocole 3D simple et robuste implique la formation de corps embryoïdes uniformes dans un milieu de composant minimum contenant des lipides, un supplément d’insuline-transferrine-sélénium-éthanolamine et de l’alcool polyvinylique avec inhibiteur de GSK3 (CHIR99021) pendant 3 jours, suivi d’une culture dans un milieu contenant un substitut sérique knock-out (KOSR). En outre, les essais d’agitation permettent de réduire l’agglutination des corps embryoïdes et de maintenir une taille uniforme, ce qui est important pour réduire la variabilité entre les organoïdes. Dans l’ensemble, le protocole fournit une méthode rapide, efficace et rentable pour générer de grandes quantités d’organoïdes rénaux.

Introduction

Au cours des dernières années, un certain nombre de protocoles visant à différencier les cellules souches pluripotentes humaines en organoïdes rénaux ont été développés ^1,2,3,4,5. Les organoïdes rénaux ont fourni un outil important pour aider la recherche sur de nouvelles approches de médecine régénérative, modéliser les maladies rénales, effectuer des études de toxicité et le développement de médicaments thérapeutiques. Malgré leur large applicabilité, les organoïdes rénaux ont des limites telles que le manque de maturation, la capacité de culture limitée à long terme in vitro et une pénurie de plusieurs types de cellules trouvées dans le rein humain ^6,7,8. Des travaux récents se sont concentrés sur l’amélioration du niveau de maturation organoïde, l’extension des périodes de culture et l’expansion de la complexité des populations de cellules rénales en modifiant les protocoles existants 9,10,11,12. Dans cette itération de notre protocole établi ^5,13, nous avons modifié les composants du milieu dans la première étape du protocole en un milieu de base sans sérum complété par insuline-transferrine-sélénium-éthanolamine (ITSE), lipides, alcool polyvinylique (E5-ILP) et CHIR99021 (Figure 1). Ces changements fournissent un milieu entièrement défini, sans sérum, à faible teneur en protéines, avec moins de composants que notre composition moyenne précédente ^5,13 et sans facteurs de croissance supplémentaires. En conséquence, le support de première étape est moins laborieux à préparer que notre version précédemment publiée, et peut réduire la variabilité d’un lot à^{l’autre 5}. Des études antérieures ont montré que l’insuline et la transferrine sont importantes dans la culture sans sérum^14,15, cependant, des niveaux élevés d’insuline peuvent être inhibiteurs de la différenciation du mésoderme¹⁶. Nous avons maintenu les faibles niveaux d’insuline prévus dans le protocole original, et réduit davantage les niveaux de KOSR (contenant de l’insuline) dans la deuxième étape du test. Conformément à d’autres protocoles pour la formation d’organoïdes rénaux, des niveaux inférieurs de KOSR sont bénéfiques pour maintenir un équilibre entre la prolifération et la différenciation du tissu rénal¹⁷. De plus, nous avons abaissé la concentration de glucose dans notre milieu de stade II¹³.

Notre méthode décrit une configuration pour le dosage en suspension d’organoïdes rénaux, donnant jusqu’à ~ 1 000 organoïdes à partir d’une plaque de culture initiale hPSC 100 mm confluente à ~ 60% comme décrit dans la publication originale ^5,13. Ce protocole peut être facilement mis à l’échelle jusqu’à commencer avec plusieurs plaques de 100 mm ou 150 mm pour augmenter encore le nombre d’organoïdes.

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Protocole

Toutes les expériences utilisant des CSEh ont été réalisées conformément aux directives de l’établissement et ont été réalisées dans une hotte de biosécurité de classe II avec un équipement de protection individuelle approprié. Tous les réactifs sont de qualité de culture cellulaire, sauf indication contraire. Toutes les cultures sont incubées à 37 °C, 5 % de CO₂ dans l’atmosphère. À toutes les étapes du test, des corps embryoïques ou des organoïdes rénaux peuvent être collectés et fixés ou préparés pour analyse. Les lignes hPSC utilisées pour générer ces données ont été entièrement caractérisées et publiées¹⁸.

1. Préparation des plaques de culture

REMARQUE: Environ 1 h avant de diviser les CSEh, recouvrir 2 plaques de culture tissulaire de 100 mm avec un extrait de matrice de membrane basale (BME) qualifié de cellules souches. On peut pré-enduire les plaques, les sceller avec un film de paraffine et les conserver à 4 °C selon les instructions du fabricant.

1. Préparer 2 plaques de culture tissulaire de 100 mm (1 pour le dosage des organoïdes rénaux, 1 pour maintenir la lignée cellulaire) et un tube conique de 15 mL dans la hotte de biosécurité de classe II.
2. Aliquote 8 mL de milieu Eagle modifié (DMEM) froid et sans sérum de Dulbecco dans un tube conique de 15 mL et environ 4 mL dans chacune des plaques de 100 mm, assez pour recouvrir le fond de chaque plaque de milieu.
3. Sortez une aliquote de 100 μL de BME du congélateur (-20 °C). À l’aide d’une pipette sérologique de 2 mL, prélever environ 1 mL de DMEM froid dans le tube conique de 15 mL. Décongelez lentement l’aliquote de BME en pipetant doucement de haut en bas avec le DMEM froid, en évitant de faire des bulles.
   REMARQUE: Ne laissez pas l’aliquote BME reposer à température ambiante. Utilisez immédiatement.
4. Transférer le DMEM/BME décongelé dans le tube conique de 15 mL avec le DMEM restant. À l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL, mélanger doucement le BME dilué en pipetant de haut en bas au moins 8 fois pour disperser uniformément le BME, en évitant de faire des bulles.
5. Transférer 4 mL de BME dilué dans chaque plaque avec du DMEM et faire tourbillonner doucement la plaque afin que le BME soit réparti uniformément. Incuber la plaque enduite pendant 1 h à température ambiante ou 30 min à 37 °C.
   REMARQUE: Utilisez 50 μL de BME par plaque de 100 mm. L’utilisation d’autres milieux de culture hPSC et de lignées cellulaires peut nécessiter différentes concentrations d’EMB.

2. Passaging des CSEh

REMARQUE: Pour la culture de routine de cSEh, passage de lignées cellulaires à une confluence de 70 à 80%.

1. Aspirer le milieu de culture de la plaque hPSC à passer. Ajouter ~ 8 mL de solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco à la plaque hPSC et tourbillonner doucement pour laver les cellules.
2. Aspirer le DBPS et ajouter 2 mL de réactif de dissociation cellulaire douce (GCDR) à la plaque de 100 mm, goutte à goutte sur le dessus pour couvrir les cellules.
   REMARQUE: D’autres réactifs de dissociation peuvent également être utilisés. Ajustez en conséquence.
3. Incuber à température ambiante pendant environ 6 à 8 minutes jusqu’à ce que les colonies se brisent et que les cellules soient réfractives sous contraste de phase (Figure 2A).
   REMARQUE: Le moment peut varier d’une lignée cellulaire à l’autre. Ajustez en conséquence.
4. Pendant l’incubation, préparez un tube conique de 50 mL. Ajouter 16 mL de milieu hPSC (8 mL par plaque de 100 mm) et ajouter l’inhibiteur de kinase rho-associé (ROCKi) à une concentration finale de 5 μM.
5. Aspirer le DMEM à partir des plaques revêtues de BME et ajouter 8 mL de milieu hPSC plus ROCKi à chaque plaque.
6. Lorsque les cellules sont prêtes (comme décrit au point 2.3, figure 2A), aspirez le GCDR et inclinez la plaque d’environ 45° vers l’expérimentateur et grattez les cellules avec un élévateur de cellules.
   REMARQUE: Si les cellules sont en train de se détacher, omettez d’aspirer GCDR et continuez.
7. Tournez la plaque ~ 90 ° et grattez à nouveau pour soulever les cellules restantes. Gardez la plaque ~45° et lavez les cellules avec 3 mL de milieu hPSC à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL.
8. Pipeter doucement de haut en bas pour briser les gros amas (pas plus de 2-3 fois) et ensemencer les cellules au rapport approprié pour la lignée cellulaire d’intérêt sur les plaques préparées. Placez la plaque avec les cellules dans l’incubateur et déplacez doucement la plaque en huit mouvements pour répartir les cellules uniformément.
   REMARQUE: Dans cette expérience, les lignées hPSC ont été divisées dans un rapport de 1: 5, cela peut varier pour d’autres lignées cellulaires et conditions. Laissez l’assiette intacte pendant la nuit.
9. Après ~ 24 h, examinez les cellules pour la fixation. Recherchez de petites colonies individuelles attachées. Aspirer le milieu usé et reconstituer avec 8 mL de milieu hPSC frais (aucun ROCKi ajouté).
10. Continuez à observer et à nourrir quotidiennement jusqu’à ce que les cellules atteignent ~ 60% de confluence pour commencer le test organoïde rénal (généralement atteint 48 à 72 h après le passage). Idéalement, les colonies seront discrètes et ne fusionneront pas (figure 2B).
    REMARQUE: Il est très important de limiter les cellules à pas plus de 80% de confluence afin de maintenir leur état de pluripotence. Les cultures confluentes, la manipulation brutale ou des passages plus élevés peuvent entraîner une différenciation spontanée indésirable ou une faible efficacité de la formation d’organoïdes rénaux.

3. Jour 0 - Mise en place du test organoïde rénal

1. Avant de commencer, préparez les milieux E5-ILP et de stade II selon les formulations (tableau 1 et tableau 2).
   REMARQUE: Le support peut être stocké jusqu’à 14 jours à 4 ° C.
2. Pour un dosage organoïde rénal (une plaque de culture de 100 mm est nécessaire pour une plaque de 6 puits), préparer un milieu E5-ILP complet dans un tube conique de 50 mL : 18 mL d’E5-ILP complétés par 8 μM CHIR99021 (14,4 μL), 3,3 μM ROCKi (6 μL), 0,1 mM de bêta-mercaptoéthanol (32,7 μL).
3. Placer 2 mL de milieu E5-ILP complet dans chaque puits d’une plaque de fixation ultra-basse de 6 puits.
4. Laver les CSEh à ~60 % de confluence (Figure 2B) deux fois avec ~ 8 mL de DPBS. Aspirer le DPBS puis ajouter 2 mL de dispase par plaque de 100 mm, goutte à goutte pour recouvrir les cellules et incuber pendant 6 min à 37 °C.
   REMARQUE: Après 6 minutes, les bords des colonies commenceront à se recroqueviller (Figure 2C, flèches rouges) tandis que le reste de la colonie restera attaché. Si cela n’est pas obtenu après 6 minutes, replacez les cellules dans l’incubateur pendant 30 secondes supplémentaires. D’autres supports et matrices hPSC peuvent ne pas être compatibles avec ce timing. Le revêtement BME à base de laminine n’est pas compatible avec la dispase. Si l’EMB à base de laminine est la matrice hPSC standard, recouvrir l’une des plaques de la section 1 de l’EMB décrite dans cette méthode à utiliser pour le dosage des organoïdes rénaux.
5. Lavez les cellules 3x avec ~10 mL de DPBS. Aspirer le DPBS puis incliner la plaque ~45° et gratter avec un élévateur de cellules.
   REMARQUE: Dispase n’est pas désactivé, il doit donc être lavé soigneusement. Ne réduisez pas le nombre de lavages.
6. Laver les colonies par le haut avec 6 mL de milieu E5-ILP complet à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL. Pipettez doucement de haut en bas pour briser les grandes colonies (2 ou 3 fois suffisent généralement).
7. Répartir les grappes de colonies uniformément en ajoutant 1 mL par puits dans la plaque de 6 puits. Placez la plaque sur un agitateur orbital (réglages : orbital = 30, réciproque = 330°, vibration = 5° - 2 s) qui est placé dans l’incubateur à 37 °C (Figure 2D).
   REMARQUE: La fonction de vibration est importante pour une distribution adéquate des organoïdes et pour éviter l’agglutination.

4. Jour 2 - Alimentation par changement à moitié moyen

REMARQUE: Dans les 48 h, les grappes de colonies formeront des corps embryoïdes.

1. Préparer le milieu complet : Pour une plaque de 6 puits, préparer 12 mL de milieu E5-ILP + 8 μM CHIR99021 dans un tube conique de 15 mL.
   REMARQUE: Le bêta-mercaptoéthanol et le ROCKi ne sont pas nécessaires.
2. Laissez les corps embryides se déposer au bas de la plaque, inclinez la plaque ~ 45 ° puis aspirez le milieu lentement par le haut, laissez ~ 1 mL par puits.
   REMARQUE: Les corps embryoïdes à ce stade s’agglutinent rapidement. Ne les laissez pas se contenter de > 5 min.
3. Ajouter 2 mL de milieu complet préparé (section 4.1) par puits. Retournez la plaque sur le shaker.

5. Jour 3 - Transfert des corps embryoïdes vers un milieu de stade II

1. Préparez un tube conique de 50 mL et du DMEM (faible taux de glucose). Laissez les corps embryoïdes s’installer au fond de la plaque. Inclinez la plaque ~ 45 ° et aspirez le milieu par le haut lentement, laissez ~ 1 mL par puits.
2. Prélever soigneusement tous les corps ibéroïdes de chaque puits à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL et les transférer dans le tube conique de 50 mL.
3. Lavez chaque puits pour recueillir tous les corps embryoïdes restants avec ~ 1 mL de DMEM (faible teneur en glucose) et ajoutez-les au même tube conique de 50 mL.
4. Laissez les corps embryoïdes se déposer au fond du tube, ~ 5 min. En attendant, ajoutez 2 mL de milieu de stade II à chaque puits de la plaque de 6 puits. Extraire de grands corps embryoïdes (>300 μm) à l’aide d’une passoire cellulaire de 200 μm (figure 2E).
   1. Utilisez un nouveau tube conique de 50 mL et placez la passoire cellulaire de 200 μm sur le dessus. Pipettez soigneusement tous les corps embryoïdes à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL sur la passoire cellulaire.
   2. Rincez la passoire cellulaire avec environ 5 mL supplémentaires de DMEM (faible teneur en glucose) pour recueillir tous les corps embryoïques coincés dans la passoire cellulaire. Laissez les corps embryoïdes se déposer au fond du tube conique.
5. Lorsque les corps embryoïdes sont installés, aspirez le surnageant et lavez-le avec ~ 10 mL de DMEM (faible teneur en glucose).
6. Aspirer le DMEM et suspendre à nouveau les corps imbroïdes dans 6 mL de milieu de stade II.
7. Transférez les corps embryoïdes dans la plaque d’attachement ultra-basse de 6 puits, en les répartissant uniformément entre les 6 puits.
8. Effectuez des demi-changements de milieu comme décrit aux étapes 4.2 et 4.3 tous les deux jours.
   REMARQUE: À partir du jour 3, les corps embryoïdes auront un aspect sphérique « doré » et lisse (Figure 2F). À partir du ~ jour 6, la formation de tubules dans les corps embryoïdes individuels deviendra apparente, avec un nombre croissant au cours des jours suivants atteignant des nombres optimaux et une croissance au jour 14 (Figure 2G, H). Pour éliminer la formation occasionnelle d’agglutination, en observant visuellement les organoïdes rénaux, ou de très petits corps embryoïdes sans tubules, tamiser les organoïdes <200 et les grands organoïdes de >500 μm avec des passoires cellulaires de 500 et 200 μm comme décrit aux étapes 5.4.1 et 5.4.2.

6. Transférer dans la fiole de spinner et nourrir

REMARQUE: Une fiole de spinner peut être utilisée à tout moment à partir du jour 3 pour les expériences qui nécessitent un grand nombre d’organoïdes. Le transfert systématique d’organoïdes a lieu dans notre laboratoire entre les jours 6 à 8. Veuillez consulter la section Discussion pour connaître les solutions de rechange si l’équipement n’est pas disponible.

1. Transférer les corps d’embryides dans une fiole de 125 mL avec 45 mL de milieu de stade II. Réglez la vitesse de l’agitateur magnétique à 120 tr/min et placez-la dans l’incubateur (Figure 2I).
2. Pour nourrir les corps embryoïdes ou les organoïdes rénaux, laissez les organoïdes rénaux s’installer brièvement au fond de la fiole de spinner. Soulevez le couvercle d’un bras latéral de la fiole et placez la pipette aspirante à l’intérieur, la pointe touchant le mur intérieur opposé.
3. Inclinez lentement la pipette d’aspiration vers le bas et aspirez environ la moitié du milieu. Reconstituez avec 20 mL de milieu frais de phase II en le pipetant à travers la même ouverture.

7. Mise en place d’une plaque d’agitation magnétique à 6 puits (6MSP)

REMARQUE: Le format 6MSP peut être utilisé à la place des flacons de spinner si plusieurs conditions doivent être testées. Utilisez le 6MSP pour les traitements composés ou à la néphrotoxine. Cela permet d’économiser la quantité de milieu utilisée dans la deuxième étape tout en maintenant la disponibilité des nutriments par diffusion.

1. Nettoyez brièvement les barres d’agitation magnétiques ovales dans un tube conique de 50 mL en les lavant brièvement dans un détergent approprié à la culture tissulaire (si elles ne sont jamais utilisées) ou en les faisant tremper pendant > 1 h si elles sont déjà utilisées.
2. Lavez brièvement 3x dans du DPBS stérile.
3. Laver 1x pendant 5 min dans de l’éthanol à 70%, 1x dans du DPBS stérile.
4. Rincer avec une solution anti-adhérence et laver 1x dans du DPBS stérile et aspirer.
5. Soigneusement, à l’aide de longues pinces stériles, placez une barre d’agitation magnétique dans chaque puits de la plaque à 6 puits avec des corps embryoïdes ou des organoïdes rénaux.
6. Placez la plaque sur le 6MSP et réglez la vitesse à 120 tr/min (Figure 2J). Maintenir les organoïdes rénaux avec un changement de demi-milieu conformément aux rubriques 4.2 et 4.3.
   REMARQUE: Pour que les barres d’agitation magnétiques s’enclenchent et commencent à tourner, vous devrez peut-être d’abord mettre brièvement le niveau de puissance à 100, puis une fois qu’elles tournent toutes, ramener le niveau de puissance à 25.

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Résultats

Dans cette version la plus récente de notre protocole, la différenciation organoïde rénale est initiée dans un milieu défini à faible teneur en protéines. Les essais sont effectués entièrement en suspension et reposent sur la capacité innée de différenciation et d’organisation des CSEh pour l’initiation de la tubulogenèse. Un seul essai provenant d’une plaque de culture hPSC confluente de 100 mm ~ 60% donne régulièrement 500 à 1 000 organoïdes rénaux, comme indiqué dans notre publication précé...

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Discussion

Des études antérieures ont montré que les étapes initiales du protocole sont critiques pour la différenciation intermédiaire du mésoderme ^5,19,20 et, par conséquent, il est essentiel de mettre en œuvre une composition moyenne stricte à ce stade. L’élimination des composants non définis tels que le sérum, l’albumine, le milieu d’hybridome sans protéines II de la première étape du protocole peut aider à amé...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol	Thermo Fisher	21-985-023
Anti-adherence rinsing solution	STEMCELL Technologies	7010
CHIR99021	STEMCELL Technologies	72054	10 mM stock in DMSO
Corning disposable spinner flasks	Fisher Scientific	07-201-152
Corning Ultra-Low Attachment 6-well plates	Fisher Scientific	07-200-601
Corning Slow-Speed Stirrers	Fisher Scientific	11-495-03	Multi plate magnetic stirrer for spinner flask culture
Dispase	STEMCELL Technologies	7923	Aliquot and freeze
DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red	Thermo Fisher	11054020
DPBS 1x, no calcium, no magnesium	Thermo Fisher	14-190-250
Egg / Oval Stirring Bars	2mag	PI20106
Excelta General-Purpose Tweezers	Fisher Scientific	17-456-103	Keep sterile in the cell culture hood
EZBio Single Use Media Bottle, 250mL	Foxx Life Sciences	138-3211-FLS	Used to make PVA 10%
Falcon Standard Tissue Culture Dishes (100 mm)	Thermo Fisher	08-772E
Fisherbrand Sterile Aspirating Pipet 2mL	Fisher Scientific	14-955-135
Fisherbrand  Cell Lifters - Cell lifter	Fisher Scientific	08-100-240
Fisherbrand Multi Function 3D Rotators	Fisher Scientific	88-861-047	Orbital shaker
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix	Thermo Fisher	A1413302	BME. Aliquot on ice and freeze. Another suitable matrix alternative is Matrigel or Cultrex.
Gentle Cell Dissociation Reagent	STEMCELL Technologies	7174	GCDR
GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher	35-050-061	L-glutamine supplement.
HEPES (1M)	Thermo Fisher	15-630-080
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine	Thermo Fisher	51-500-056	ITSE
KnockOut  Serum Replacement - Multi-Species	Thermo Fisher	A3181502	KOSR. Aliquot and freeze
Lipid Mixture 1, Chemically Defined	Millipore-Sigma	L0288-100ML
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Thermo Fisher	11140-050
MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 500mL	Fisher Scientific	S2GPU05RE
MilliporeSigma  Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 250mL	Fisher Scientific	S2GPU02RE
MIXcontrol MTP / Variomag TELEcontrol MTP Control Unit	2mag	VMF 90250 U
MIXdrive 6 MTP / Variomag TELEdrive 6 MTP Microplate Stirring Drive	2mag	VMF 40600	6MSP
MP Biomedicals  7X Cleaning Solution	Fisher Scientific	MP0976670A4	Tissue culture suitable detergent. Make a 5% solution in water
mTeSR1	STEMCELL Technologies	85850	hPSC medium.TeSR-E8, NutriStem XF, and mTeSR Plus medium have also been tested and are suitable alternatives.
Nunc 50 mL Conical, Sterile Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	12-565-270
Nunc 15mL Conical Sterile Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	12-565-268
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher	15-140-122	Aliquot and freeze
Plasmocin	Invivogen	ant-mpt	Anti-mycoplasma reagent. Aliquot and freeze
pluriStrainer® 200 µm	Fisher Scientific	NC0776417	Cell strainer
pluriStrainer® 500 µm	Fisher Scientific	NC0822591	Cell strainer
Poly(vinyl alcohol) 87-90% hydrolyzed  (PVA)	Millipore-Sigma	P8136-250G	10% in DPBS stirring at 98 degrees C until disolves, make in 138-3211-FLS
ROCK inhibitor Y-27632 (ROCKi)	STEMCELL Technologies	72304	10 mM stock in DPBS
Sterile Disposable Serological Pipets  - 10mL	Fisher Scientific	13-678-11E
Sterile Disposable Serological Pipets - 25mL	Fisher Scientific	13-678-11
Sterile Disposable Serological pipette - 5 mL	Fisher Scientific	13-678-12D
TeSR-E5	STEMCELL Technologies	5916	Serum-free, low protein base medium for E5-ILP
Variomag distriBOX 2 Distributor	2mag	VMF 90512	If you use more than one MIXdrive