Un método simplificado para generar organoides renales a partir de células madre pluripotentes humanas

Resumen

Aquí describimos un protocolo para generar organoides renales a partir de células madre pluripotentes humanas (hPSCs). Este protocolo genera organoides renales en dos semanas. Los organoides renales resultantes se pueden cultivar en matraces giratorios a gran escala o placas de agitación magnética de múltiples pozos para enfoques paralelos de prueba de drogas.

Resumen

Los organoides renales generados a partir de hPSC han proporcionado una fuente ilimitada de tejido renal. Los organoides renales humanos son una herramienta invaluable para estudiar la enfermedad y las lesiones renales, desarrollar terapias basadas en células y probar nuevas terapias. Para tales aplicaciones, se necesita un gran número de organoides uniformes y ensayos altamente reproducibles. Nos hemos basado en nuestro protocolo de organoides renales publicado anteriormente para mejorar la salud general de los organoides. Este protocolo 3D simple y robusto implica la formación de cuerpos embrionarios uniformes en un medio de componente mínimo que contiene lípidos, suplemento de insulina-transferrina-selenio-etanolamina y alcohol polivinílico con inhibidor de GSK3 (CHIR99021) durante 3 días, seguido de cultivo en medio que contiene reemplazo sérico knock-out (KOSR). Además, los ensayos de agitación permiten reducir la aglomeración de los cuerpos embrionarios y mantener un tamaño uniforme, lo cual es importante para reducir la variabilidad entre los organoides. En general, el protocolo proporciona un método rápido, eficiente y rentable para generar grandes cantidades de organoides renales.

Introducción

En los últimos años, se han desarrollado una serie de protocolos para diferenciar las células madre pluripotentes humanas en organoides renales ^1,2,3,4,5. Los organoides renales han proporcionado una herramienta importante para ayudar a la investigación en nuevos enfoques de medicina regenerativa, modelar enfermedades relacionadas con los riñones, realizar estudios de toxicidad y desarrollo de fármacos terapéuticos. A pesar de su amplia aplicabilidad, los organoides renales tienen limitaciones como la falta de maduración, la capacidad limitada de cultivo a largo plazo in vitro y la escasez de varios tipos de células que se encuentran en el riñón humano ^6,7,8. Trabajos recientes se han centrado en mejorar el nivel de maduración organoide, alargar los periodos de cultivo y ampliar la complejidad de las poblaciones de células renales^modificando los protocolos existentes 9,10,11,12. En esta iteración actual de nuestro protocolo establecido ^5,13, hemos modificado los componentes del medio en la primera etapa del protocolo a un medio base libre de suero suplementado con insulina-transferrina-selenio-etanolamina (ITSE), lípidos, alcohol polivinílico (E5-ILP) y CHIR99021 (Figura 1). Estos cambios proporcionan un medio totalmente definido, libre de suero, bajo en proteínas, con menos componentes que nuestra composición media anterior ^5,13 y sin factores de crecimiento adicionales. Como resultado, el medio de la primera etapa requiere menos mano de obra para preparar que nuestra versión publicada anteriormente, y puede reducir la variabilidad de lote a lote⁵. Estudios previos han demostrado que tanto la insulina como la transferrina son importantes en el cultivo sin suero^14,15, sin embargo, los altos niveles de insulina pueden ser inhibitorios a la diferenciación del mesodermo¹⁶. Hemos mantenido los niveles bajos de insulina según lo dispuesto en el protocolo original, y hemos reducido aún más los niveles de KOSR (que contiene insulina) en la segunda etapa del ensayo. En línea con otros protocolos para la formación de organoides renales, los niveles más bajos de KOSR son beneficiosos para mantener un equilibrio entre la proliferación y la diferenciación del tejido renal¹⁷. Además, hemos bajado la concentración de glucosa en nuestro medio Estadio II¹³.

Nuestro método describe una configuración para el ensayo de suspensión de organoides renales, produciendo hasta ~ 1,000 organoides de una placa de cultivo inicial de ~ 60% confluente hPSC 100 mm como se describe en la publicación original ^5,13. Este protocolo se puede escalar fácilmente hasta comenzar con múltiples placas de 100 mm o 150 mm para aumentar aún más el número de organoides.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

Todos los experimentos con hPSC se realizaron de conformidad con las directrices institucionales y se llevaron a cabo en una campana de bioseguridad de Clase II con el equipo de protección personal adecuado. Todos los reactivos son de grado de cultivo celular a menos que se indique lo contrario. Todos los cultivos se incuban a 37 °C, 5% CO₂ atmósfera aireada. En todas las etapas del ensayo, se pueden recolectar cuerpos embrioides u organoides renales, y fijarlos o prepararlos para su análisis. Las líneas hPSC utilizadas para generar estos datos han sido completamente caracterizadas y publicadas¹⁸.

1. Preparación de placas de cultivo

NOTA: Aproximadamente 1 h antes de dividir las hPSC, cubra 2 placas de cultivo de tejidos de 100 mm con un extracto de matriz de membrana basal (BME) calificado para células madre. Se pueden recubrir previamente las placas, sellarlas con una película de parafina y almacenarlas a 4 °C de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

1. Preparar 2 placas tratadas con cultivo de tejidos de 100 mm (1 para ensayo de organoides renales, 1 para mantener la línea celular) y un tubo cónico de 15 ml en la campana de bioseguridad clase II.
2. Alícuota 8 ml de medio águila modificada (DMEM) de Dulbecco frío y sin suero en un tubo cónico de 15 ml y ~ 4 ml en cada una de las placas de 100 mm, suficiente para cubrir la parte inferior de cada placa con medio.
3. Sacar una alícuota de 100 μL de BME del congelador (-20 °C). Usando una pipeta serológica de 2 ml, tome ~ 1 ml de DMEM frío del tubo cónico de 15 ml. Descongele lentamente la alícuota BME canalizando suavemente hacia arriba y hacia abajo con el DMEM frío, evitando hacer burbujas.
   NOTA: No deje que la alícuota de BME se asiente a temperatura ambiente. Úselo inmediatamente.
4. Transfiera el DMEM/BME descongelado de nuevo al tubo cónico de 15 ml con el DMEM restante. Con una pipeta serológica de 10 ml, mezcle suavemente el BME diluido mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo al menos 8 veces para dispersar uniformemente el BME, evitando hacer burbujas.
5. Transfiera 4 ml de la BME diluida a cada placa con DMEM y gire suavemente la placa para que la BME se distribuya uniformemente. Incubar la placa recubierta durante 1 h a temperatura ambiente o 30 min a 37 °C.
   NOTA: Utilice 50 μL de BME por placa de 100 mm. El uso de otros medios de cultivo y líneas celulares de hPSC puede requerir diferentes concentraciones de BME.

2. HPSC de paso

NOTA: Para el cultivo rutinario de hPSC, las líneas celulares de paso al 70-80% de confluencia.

1. Aspirar el medio de cultivo de la placa hPSC a pasar. Agregue ~ 8 ml de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco a la placa hPSC y gire suavemente para lavar las células.
2. Aspire DBPS y agregue 2 ml de reactivo de disociación celular suave (GCDR) a la placa de 100 mm, gota a gota en la parte superior para cubrir las células.
   NOTA: También se pueden utilizar otros reactivos de disociación. Ajuste en consecuencia.
3. Incubar a temperatura ambiente durante ~6-8 min hasta que las colonias se rompan y las células sean refractivas bajo contraste de fase (Figura 2A).
   NOTA: El tiempo puede variar entre líneas celulares. Ajuste en consecuencia.
4. Durante la incubación, prepare un tubo cónico de 50 ml. Añadir 16 ml de medio hPSC (8 ml por placa de 100 mm) y añadir el inhibidor de la quinasa asociado a Rho (ROCKi) a una concentración final de 5 μM.
5. Aspire DMEM de las placas recubiertas de BME y agregue 8 ml de medio hPSC más ROCKi a cada placa.
6. Cuando las células estén listas (como se describe en el punto 2.3, Figura 2A), aspire el GCDR e incline la placa ~ 45 ° hacia el experimentador y raspe las células con un elevador de células.
   NOTA: Si las celdas se están desconchando, omita la aspiración de GCDR y continúe.
7. Gire la placa ~ 90 ° y raspe nuevamente para levantar las celdas restantes. Mantenga la placa ~ 45 ° y lave las células con 3 ml de medio hPSC con una pipeta serológica de 10 ml.
8. Pipete suavemente hacia arriba y hacia abajo para romper grupos grandes (no más de 2-3 veces) y sembra las células en la proporción adecuada para la línea celular de interés en las placas preparadas. Coloque la placa con las células en la incubadora y mueva la placa suavemente en la figura ocho movimientos para distribuir las células de manera uniforme.
   NOTA: En este experimento, las líneas hPSC se dividieron en una proporción de 1: 5, esto puede variar para otras líneas celulares y condiciones. Deje el plato sin molestar durante la noche.
9. Después de ~ 24 h, examine las celdas para la unión. Busque pequeñas colonias individuales adjuntas. Aspire el medio gastado y reponga con 8 ml de medio hPSC fresco (sin ROCKi añadido).
10. Continúe observando y alimentándose diariamente hasta que las células alcancen ~ 60% de confluencia para comenzar el ensayo de organoides renales (generalmente alcanzó de 48 a 72 h después del pasaje). Las colonias idealmente serán discretas y no se fusionarán (Figura 2B).
    NOTA: Es muy importante limitar las células a no más del 80% de confluencia para mantener su estado de pluripotencia. Los cultivos confluentes, el manejo brusco o los pasajes más altos pueden conducir a una diferenciación espontánea no deseada o a una baja eficiencia de la formación de organoides renales.

3. Día 0 - Configuración del ensayo de organoides renales

1. Antes de comenzar, prepare tanto el medio E5-ILP como el Stage II según las formulaciones (Tabla 1 y Tabla 2).
   NOTA: El medio se puede almacenar hasta 14 días a 4 °C.
2. Para un ensayo organoide renal (se necesita una placa de cultivo de 100 mm para una placa de 6 pocillos), prepare un medio E5-ILP completo en un tubo cónico de 50 ml: 18 ml de E5-ILP suplementado con 8 μM CHIR99021 (14,4 μL), 3,3 μM ROCKi (6 μL), 0,1 mM de beta-mercaptoetanol (32,7 μL).
3. Coloque 2 ml de medio E5-ILP completo en cada pozo de una placa de fijación ultra baja de 6 pocillos.
4. Lave las hPSC a ~60 % de confluencia (Figura 2B) dos veces con ~ 8 ml de DPBS. Aspire DPBS luego agregue 2 ml de dispasa por placa de 100 mm, gota a gota para cubrir las células e incube durante 6 minutos a 37 ° C.
   NOTA: Después de 6 min, los bordes de las colonias comenzarán a curvarse (Figura 2C, flechas rojas) mientras que el resto de la colonia permanece unida. Si esto no se obtiene después de 6 minutos, coloque las células de nuevo en la incubadora durante 30 s adicionales. Es posible que otros medios y matrices de hPSC no sean compatibles con este tiempo. El recubrimiento BME a base de laminina no es compatible con la dispasa. Si la BME a base de laminina es la matriz hPSC estándar, cubra una de las placas de la sección 1 con la BME descrita en este método que se utilizará para el ensayo organoide renal.
5. Lave las celdas 3x con ~10 mL de DPBS. Aspire DPBS luego incline la placa ~ 45 ° y raspe hacia abajo con un elevador de celdas.
   NOTA: Dispase no está desactivado, por lo tanto, debe lavarse a fondo. No reduzca el número de lavados.
6. Lave las colonias desde la parte superior con 6 ml de medio E5-ILP completo utilizando una pipeta serológica de 10 ml. Pipete hacia arriba y hacia abajo suavemente para romper cualquier colonia grande (2 o 3 veces suele ser suficiente).
7. Distribuya los racimos de colonias de manera uniforme agregando 1 ml por pozo en la placa de 6 pocillos. Coloque la placa en un agitador orbital (ajustes: orbital = 30, recíproco = 330°, vibración = 5° - 2 s) que se coloca en la incubadora de 37 °C (Figura 2D).
   NOTA: La característica de vibración es importante para la distribución adecuada de los organoides y para evitar la aglomeración.

4. Día 2 - Alimentación por medio de cambio

NOTA: Dentro de las 48 h, los grupos de colonias formarán cuerpos embrioides.

1. Preparar el medio completo: Para una placa de 6 pocillos preparar 12 mL de medio E5-ILP + 8 μM CHIR99021 en un tubo cónico de 15 mL.
   NOTA: No se requiere beta-mercaptoetanol ni ROCKi.
2. Deje que los cuerpos embrionarios se asienten en la parte inferior de la placa, incline la placa ~ 45 ° y luego aspire el medio lentamente desde la parte superior, deje ~ 1 ml por pozo.
   NOTA: Los cuerpos embrídicos en esta etapa se agrupan rápidamente. No los dejes conformarte con > 5 min.
3. Añadir 2 ml de medio completo preparado (sección 4.1) por pozo. Devuelva el plato de nuevo a la coctelera.

5. Día 3 - Transferencia de cuerpos embrionarios al medio estadio II

1. Preparar un tubo cónico de 50 ml y DMEM (glucosa baja). Deje que los cuerpos embrionarios se asienten en el fondo de la placa. Incline la placa ~ 45 ° y aspire el medio desde la parte superior lentamente, deje ~ 1 ml por pozo.
2. Recoger todos los cuerpos embrionarios cuidadosamente de cada pozo utilizando una pipeta serológica de 10 ml y transferirlos al tubo cónico de 50 ml.
3. Lave cada pocillo para recolectar cualquier cuerpo embrionario restante con ~ 1 ml de DMEM (glucosa baja) y agréguelos al mismo tubo cónico de 50 ml.
4. Deje que los cuerpos embrionarios se asienten en el fondo del tubo, ~ 5 min. Mientras espera, agregue 2 ml de medio de etapa II a cada pozo de la placa de 6 pocillos. Extraer cuerpos embrionarios grandes (>300 μm) utilizando un colador de células de 200 μm (Figura 2E).
   1. Utilice un nuevo tubo cónico de 50 ml y coloque el colador de células de 200 μm en la parte superior. Pipetear todos los cuerpos embrionarios usando una pipeta serológica de 10 ml cuidadosamente sobre el colador celular.
   2. Enjuague el colador celular con ~ 5 ml adicionales de DMEM (glucosa baja) para recolectar cualquier cuerpo embrioide atascado en el colador celular. Permita que los cuerpos embrioides se asienten en el fondo del tubo cónico.
5. Cuando los cuerpos embrionarios estén asentados, aspire el sobrenadante y lávese con ~ 10 ml de DMEM (glucosa baja).
6. Aspirar DMEM y volver a suspender los cuerpos embrioides en 6 mL de medio Estadio II.
7. Transfiera los cuerpos embrionarios de nuevo a la placa de fijación ultra baja de 6 pozos, distribuyéndolos uniformemente entre los 6 pozos.
8. Realice cambios a medias como se describe en los pasos 4.2 y 4.3 cada dos días.
   NOTA: A partir del día 3, los cuerpos embrioides tendrán un aspecto esférico "dorado" y liso (Figura 2F). A partir del ~ día 6, la formación de túbulos en cuerpos embrionarios individuales se hará evidente, con un número creciente en los días siguientes alcanzando números óptimos y crecimiento para el día 14 (Figura 2G, H).. Para eliminar la formación ocasional de aglomeraciones, al observar visualmente los organoides renales, o cuerpos embrionarios muy pequeños sin túbulos, tamice los <200 y los organoides grandes >500 μm con un colador de células de 500 y 200 μm como se describe en los pasos 5.4.1 y 5.4.2.

6. Transferencia al matraz giratorio y alimentación

NOTA: Un matraz giratorio se puede utilizar en cualquier momento a partir del día 3 en adelante para experimentos que requieren un gran número de organoides. La transferencia rutinaria de organoides ocurre en nuestro laboratorio entre los días 6-8. Consulte la sección Discusión para conocer las alternativas si el equipo no está disponible.

1. Transfiera cuerpos embrionarios a un matraz giratorio de 125 ml con 45 ml de medio en estadio II. Ajuste la velocidad del agitador magnético a 120 rpm y colóquelo en la incubadora (Figura 2I).
2. Para alimentar cuerpos embrioides u organoides renales, deje que los organoides renales se asienten brevemente en el fondo del matraz giratorio. Levante la tapa de un brazo lateral del matraz y coloque la pipeta aspiradora en el interior, con la punta tocando la pared interior opuesta.
3. Incline lentamente la pipeta aspiradora hacia abajo y aspire aproximadamente la mitad del medio. Reponga con 20 ml de medio fresco de Etapa II pipeteándolo a través de la misma abertura.

7. Configuración de la placa de agitación magnética de 6 pocillos (6MSP)

NOTA: El formato 6MSP se puede utilizar en lugar de matraces giratorios si es necesario probar varias condiciones. Use el 6MSP para tratamientos compuestos o nefrotoxinas. Esto ahorra la cantidad de medio utilizado en la segunda etapa mientras mantiene la disponibilidad de nutrientes a través de la difusión.

1. Limpie las barras de agitación magnéticas ovaladas en un tubo cónico de 50 ml lavando en un cultivo de tejidos el detergente adecuado brevemente (si nunca se usa) o remoje durante > 1 h si se usa anteriormente.
2. Lavar brevemente 3x en DPBS estéril.
3. Lavar 1x durante 5 min en etanol al 70%, 1x en DPBS estéril.
4. Enjuague con solución antiadherente y lave 1x en DPBS estéril y aspire.
5. Con cuidado, usando fórceps estériles largos, coloque una barra de agitación magnética en cada pozo de la placa de 6 pocillos con cuerpos embrioides u organoides renales.
6. Coloque la placa en el 6MSP y ajuste la velocidad a 120 rpm (Figura 2J). Mantener los organoides renales con medio cambio según las secciones 4.2 y 4.3.
   NOTA: Para que las barras de agitación magnéticas encajen en su posición y comiencen a girar, es posible que primero deba poner el nivel de potencia a 100 brevemente, luego, una vez que todas estén girando, baje el nivel de potencia a 25.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

En esta versión más reciente de nuestro protocolo, la diferenciación organoide renal se inicia en un medio definido y bajo en proteínas. Los ensayos se realizan completamente en suspensión y se basan en la capacidad innata de la diferenciación y organización de hPSCs para el inicio de la tubulogénesis. Un solo ensayo que se origina a partir de una placa de cultivo hPSC confluente de 100 mm ~ 60% produce rutinariamente 500-1,000 organoides renales, como se muestra en nuestra publicación anterior^...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discusión

Estudios previos han demostrado que los pasos iniciales del protocolo son críticos para la diferenciación del mesodermo intermedio ^5,19,20 y, por lo tanto, es esencial implementar una composición media estricta en esta etapa. La eliminación de componentes indefinidos como suero, albúmina, híbrido libre de proteínas medio II de la primera etapa del protocolo puede ayudar a mejorar la eficiencia de diferenciación consisten...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol	Thermo Fisher	21-985-023
Anti-adherence rinsing solution	STEMCELL Technologies	7010
CHIR99021	STEMCELL Technologies	72054	10 mM stock in DMSO
Corning disposable spinner flasks	Fisher Scientific	07-201-152
Corning Ultra-Low Attachment 6-well plates	Fisher Scientific	07-200-601
Corning Slow-Speed Stirrers	Fisher Scientific	11-495-03	Multi plate magnetic stirrer for spinner flask culture
Dispase	STEMCELL Technologies	7923	Aliquot and freeze
DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red	Thermo Fisher	11054020
DPBS 1x, no calcium, no magnesium	Thermo Fisher	14-190-250
Egg / Oval Stirring Bars	2mag	PI20106
Excelta General-Purpose Tweezers	Fisher Scientific	17-456-103	Keep sterile in the cell culture hood
EZBio Single Use Media Bottle, 250mL	Foxx Life Sciences	138-3211-FLS	Used to make PVA 10%
Falcon Standard Tissue Culture Dishes (100 mm)	Thermo Fisher	08-772E
Fisherbrand Sterile Aspirating Pipet 2mL	Fisher Scientific	14-955-135
Fisherbrand  Cell Lifters - Cell lifter	Fisher Scientific	08-100-240
Fisherbrand Multi Function 3D Rotators	Fisher Scientific	88-861-047	Orbital shaker
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix	Thermo Fisher	A1413302	BME. Aliquot on ice and freeze. Another suitable matrix alternative is Matrigel or Cultrex.
Gentle Cell Dissociation Reagent	STEMCELL Technologies	7174	GCDR
GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher	35-050-061	L-glutamine supplement.
HEPES (1M)	Thermo Fisher	15-630-080
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine	Thermo Fisher	51-500-056	ITSE
KnockOut  Serum Replacement - Multi-Species	Thermo Fisher	A3181502	KOSR. Aliquot and freeze
Lipid Mixture 1, Chemically Defined	Millipore-Sigma	L0288-100ML
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Thermo Fisher	11140-050
MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 500mL	Fisher Scientific	S2GPU05RE
MilliporeSigma  Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 250mL	Fisher Scientific	S2GPU02RE
MIXcontrol MTP / Variomag TELEcontrol MTP Control Unit	2mag	VMF 90250 U
MIXdrive 6 MTP / Variomag TELEdrive 6 MTP Microplate Stirring Drive	2mag	VMF 40600	6MSP
MP Biomedicals  7X Cleaning Solution	Fisher Scientific	MP0976670A4	Tissue culture suitable detergent. Make a 5% solution in water
mTeSR1	STEMCELL Technologies	85850	hPSC medium.TeSR-E8, NutriStem XF, and mTeSR Plus medium have also been tested and are suitable alternatives.
Nunc 50 mL Conical, Sterile Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	12-565-270
Nunc 15mL Conical Sterile Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	12-565-268
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher	15-140-122	Aliquot and freeze
Plasmocin	Invivogen	ant-mpt	Anti-mycoplasma reagent. Aliquot and freeze
pluriStrainer® 200 µm	Fisher Scientific	NC0776417	Cell strainer
pluriStrainer® 500 µm	Fisher Scientific	NC0822591	Cell strainer
Poly(vinyl alcohol) 87-90% hydrolyzed  (PVA)	Millipore-Sigma	P8136-250G	10% in DPBS stirring at 98 degrees C until disolves, make in 138-3211-FLS
ROCK inhibitor Y-27632 (ROCKi)	STEMCELL Technologies	72304	10 mM stock in DPBS
Sterile Disposable Serological Pipets  - 10mL	Fisher Scientific	13-678-11E
Sterile Disposable Serological Pipets - 25mL	Fisher Scientific	13-678-11
Sterile Disposable Serological pipette - 5 mL	Fisher Scientific	13-678-12D
TeSR-E5	STEMCELL Technologies	5916	Serum-free, low protein base medium for E5-ILP
Variomag distriBOX 2 Distributor	2mag	VMF 90512	If you use more than one MIXdrive