吸收荧光标记的小细胞外囊泡 在体外 和脊髓

摘要

我们描述了一个协议，用PKH染料标记大噬细胞衍生的小细胞外囊泡，并在体外和脊髓中观察它们 在体外 和脊髓内分娩后的吸收情况。

摘要

小细胞外囊泡（SEV）是50-150纳米囊泡分泌的所有细胞，存在于体液中。SEV将RNA、蛋白质和脂质等生物分子从供体转移到接受细胞，使它们成为细胞之间的关键信号介质。在中枢神经系统 （CNS） 中，SEV 可以调解细胞间信号，包括神经免疫相互作用。SEV功能可以通过跟踪在 体外 和体内接受细胞中标记的SEV 的吸收来研究。本文描述了使用PKH膜染料从RAW 264.7巨噬细胞的受条件介质中对SEV进行标记。它显示了不同浓度的标记SEV在多个时间点由神经-2a细胞和原发性星细胞 在体外吸收。同时显示的是小鼠脊髓神经元、星形细胞和通过共聚焦显微镜可视化的微胶质在细胞内提供的SEV的吸收。具有代表性的结果表明，不同细胞吸收SEV时存在时间依赖性变化，这有助于确认SEV成功输送到脊髓中。

引言

小细胞外囊泡 （SEV） 是纳米大小的膜衍生囊泡，尺寸范围为 50-150 nm。它们来自多车辆体（MVB），在MVB与等离子膜融合后从细胞中释放出来。SEV 含有 miRNA、mRNA、蛋白质和生物活性脂质，这些分子以细胞间通信的形式在细胞之间转移。SEV可以通过各种内分泌通路由受体细胞内化，而受体细胞对SEV的捕获则通过识别电动汽车和目标细胞¹上的表面分子进行介质。

SEV之所以引起人们的兴趣，是因为他们能够触发接受细胞的分子和表型变化，它们作为治疗剂的效用，以及它们作为货物分子或药理剂载体的潜力。由于其体积小，SEV 的成像和跟踪可能具有挑战性，尤其是在活体研究和临床环境中。因此，许多方法已经开发成标签和图像SEV，以帮助其生物分布和跟踪体外和体内^2。

研究SEV生物分布和靶向细胞相互作用的最常见技术是用荧光染料分子^{3、4、5、6、7}标记它们。电动汽车最初被标记为细胞膜染料，通常用于成像细胞。这些荧光染料通常会弄脏 SEV 上感兴趣的脂质双层或蛋白质。几种嗜脂染料在加入细胞溶胶时会显示强烈的荧光信号，包括 DiR （1，1+-二恶英-3，3，3+，3+-四甲基三氯氰胺碘化物），DiL （1，1+二恶英-3， 3， 3+， 3+ 四甲基丁二甲基高氯酸酯）， 和 DiD （1， 1 + 二恶英-3， 3， 3+， 3+ 四甲基因多碳氰酸酯 4-氯苯硫酸盐）^{8，9，10，11}.

其他嗜脂染料，如PKH67和PKH26，具有高荧光极性头组和长脂烃尾，容易相互扩展成任何脂质结构，并导致长期染料保留和稳定的荧光^12。PKH染料也可以标记EV，这允许在体内¹³的EV性能的研究。许多其他染料已被用来观察外显微镜和流动细胞学，包括脂质标签染料¹⁴和细胞渗透染料，如卡盒氟辛二甲酸酯（CFDA-SE）15，16和钙素乙酰乙酰（AM）酯^17。

CNS中不同细胞之间的SEV介质相声研究，为神经炎和神经退行^性疾病的发病机制提供了重要的见解。例如，来自神经元的SEV可以传播β-淀粉样肽和磷酸tau蛋白，并有助于阿尔茨海默病的发病机制^。此外，从红细胞衍生的EV含有大量的α-核素，可以跨越血脑屏障，并有助于帕金森病理学^20。SEV能够跨越生理障碍^21，并将他们的生物分子转移到靶向细胞，使他们方便的工具，提供治疗药物到CNS22。

将脊髓中无数CNS细胞的SEV吸收可视化，将使得机械研究和评估来自各种细胞来源的外源性管理SEV的治疗益处。本文描述了从巨噬细胞中提取的SEV标签的方法，并通过神经元、微胶质和星形细胞在腰椎间体 外 和 体内 成像，通过可视化定性地确认SEV交付。

研究方案

注:所有程序均符合《国家卫生研究院实验室动物护理和使用指南》，并经德雷塞尔大学医学院机构动物护理与使用委员会批准。定时怀孕的CD-1小鼠用于星体细胞培养，所有水坝在浸渍15天后收到。十二周大的C57BL/6小鼠用于 活体 吸收实验。

1. 从 RAW 264.7 巨噬细胞中分离 SEV

1. 培养 RAW 264.7 细胞在 75 厘米² 烧瓶在 DMEM 外体耗尽介质包含 10% 外体耗尽的胎儿牛血清 （FBS） 和 1% 青霉素链霉素 （笔链） 为 24-48 小时.
2. 在 300 × g 下收集 300 mL 的有条件介质和离心机，在 4 °C 下收集 10 分钟。
3. 以 2，000 × g 收集超纳特和离心机，在 4 °C 下收集 20 分钟。
4. 将超高离心剂转移到离心机管，离心机在 12，000 × g 在 4 °C 下离心 35 分钟。
5. 通过 0.22 μm 注射器过滤器收集超高纳特和过滤器。
6. 以 110，000 × 克 在 4 °C 下转移到超中心输液管和离心机 80 分钟。
7. 将超高分子（外脏耗尽介质）储存，将颗粒重新储存在 2 mL 的 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中，离心机在 110，000 × g 下以 4°C 为 1 小时。
8. 使用纳米粒子跟踪分析 （NTA） 和传输电子显微镜 （TEM） 或用于西式印迹的放射性免疫沉淀检测 （RIPA） 缓冲器，将颗粒重新沉降到 100 μL 的 PBS 中，以进一步进行定性。

2. SEV 的特征

1. 纳米粒子跟踪分析 （NTA）
   注:NTA测量了原始264.7细胞纯化SEV的大小分布和粒子数/浓度。
   1. 在过滤的 PBS 中稀释 SEV，以获得每个视场 20-60 个囊泡，以便进行最佳跟踪。
   2. 使用具有恒定流量的注射器泵将稀释的样品引入流细胞。
   3. 拍摄 3-5 个视频，每个视频 30s。设置快门速度和增益，并手动对焦相机设置，使最大数量的囊泡可见并能够被跟踪和分析。
   4. 在每个记录之间预录样本以执行复制测量。优化收购后的 NTA 设置，并保持样品之间的设置保持恒定。
   5. 使用 NTA 软件分析每个视频，以获得囊泡的平均大小和浓度。
   6. 执行所有具有相同系统设置的 NTA 测量，以实现一致性。
2. 西方污点
   1. 根据制造商的说明，使用蛋白质检测试剂盒，在 SEV、细胞解剖剂和外体耗尽介质中量化总蛋白质量。
   2. 对于细胞解冻制备，将 RAW 264.7 细胞培养成 75 厘米² 烧瓶，直到 80-90% 的汇合。分离细胞与0.25%的试金素10-15分钟，中和的试丁鱼与培养介质，并通过旋转400× 克 5分钟颗粒细胞。将细胞重新用于新鲜生长介质。
   3. 使用血细胞计计算细胞，并将 1 × 10⁶ 细胞转移到另一个管中。使用与上述相同的离心条件用 PBS 清洗细胞两次，并在细胞颗粒中加入 50 μL 裂解缓冲器（RIPA 缓冲器，加入蛋白酶抑制剂鸡尾酒）到细胞颗粒中。
   4. 将细胞旋涡，在冰上保存20分钟。将混合物置于 10，000 × g 的离心下，在 4 °C 下 30 分钟，在新鲜的微中心管中收集超高纳坦（即解剖剂），并保持在 +80 °C，直到使用。
   5. 在量化蛋白质量之前，使用 3 kDa 切口离心滤清器将 2 mL 的外体耗竭介质浓缩到 100 μL。将SEV与裂解缓冲器混合在1:1的比例，漩涡为30s，并在冰上孵育15分钟，以量化蛋白质的数量。
   6. 将等量的蛋白质（2微克）与减少样品缓冲混合，RAW 264.7细胞溶酶和外体耗尽介质。
   7. 将样品在 95 °C 下电 5 分钟，在冰上保存 5 分钟，在 10，000 × 克时旋转 2 分钟。将样品加载到 12% 的 Tris-glycine 蛋白凝胶上，以 125 V 的速度运行凝胶 45 分钟。
   8. 将蛋白质以 25 V 为 2 小时的二氟化物 （PVDF） 膜传输到聚氯乙烯二氟化物 （PVDF） 膜上。
   9. 转移后，在室温下用阻塞缓冲器（参见 材料表）阻隔 PVDF 膜 1 小时。
   10. 在 4 °C 的摇床上用原先抗体在一夜之间孵育污点。
       注:使用的主要抗体是抗CD81（1:1，000），抗α-1，3/1，6-曼诺西转移酶（ALG-2）相互作用蛋白X（阿利克斯）（1，3/1），6-曼诺西转移酶（ALG-2）相互作用蛋白X（阿利克斯）（1，3/1）1:1，000）、抗卡内辛（1:1，000）和抗甘油醛3-磷酸盐脱氢酶（GAPDH）（1:1，000）。
   11. 用 1x Tris 缓冲盐水清洗污点 3 x 15 分钟， 0.1% Tween 20 （TBST），并在室温下用山羊抗鼠伊格-马萝卜过氧化酶 （HRP） - 或驴抗兔IgG-HRP结合二级抗体（1:10，000）在摇床上孵育1小时。
   12. 用 1x TBST 清洗 3 x 15 分钟的污点，并使用 HRP 基板检测蛋白质。
   13. 使用西式斑点成像仪通过增强的化学发光来分析污点。
3. 传输电子显微镜 （TEM）
   1. 通过在 0.1 M 磷酸盐缓冲 （PB） 中的 2% 副甲醛 （PFA） 中重新悬浮来修复 SEV;漩涡为 2 x 15 s。
   2. 将 10 μL 的 SEV 悬架滴放在干净的准胶片上。将碳涂层的 Formvar 格子漂浮在掉落的上，其涂层侧面朝悬浮。让膜在干燥环境中吸收20分钟。
   3. 将网格（膜侧向下）放在一滴PB上洗3×2分钟。
   4. 将网格传输至 50 μL 的 1% 谷胱甘肽 5 分钟。
   5. 用 100 μL 蒸馏水清洗网格 8 x 2 分钟。
   6. 对比样品，将网格放在1%的醋酸尿素下降2分钟。
   7. 将样品与 50 微升 0.2% 的醋酸尿素结合 2% 甲基纤维素溶液，在覆盖的冰盘上 10 分钟。
   8. 使用不锈钢环保持网格，并用滤纸去除多余的液体。
   9. 在循环中仍对网格进行 10 分钟的空气干燥。
   10. 在80千伏的传输电子显微镜下观察。

3. SEV 标签

1. 在 1 mL 的稀释缓冲器中稀释 20 μg 的 SEV 或在 1 mL 的染料控制稀释缓冲器中稀释相同体积的 PBS。
2. 将 PKH67 或 PKH26 染料稀释 3 μL 在 1 mL 的稀释缓冲中，通过管道混合。
3. 将稀释的 PKH 染料添加到稀释的 SEV 中，然后通过管道混合。在室温下在黑暗中孵育5分钟。对于染料控制，将稀释的染料与第 3.1 步稀释的 PBS 混合。
4. 在 PBS 中加入 2 mL 1% 牛血清白蛋白 （BSA）到管中，用染料和 SEV 混合物以及染料控制管吸收多余的染料。
5. 离心机 1 小时，110，000 × g，4 °C。 丢弃超高纳特，在 2 mL 的 PBS 中重新使用颗粒，在 4 °C 下以 110，000 × g 离心机离心机 1 小时。 使用 PBS 重复洗涤，并以等量的 PBS 重新使用标记的 SEV 或染料控制。
6. 用布拉德福德方法量化总蛋白质的量。

4. 神经-2a细胞吸收SEV

1. 将 18 mm 盖片放在 12 井板和 10 × 10⁴ 神经-2a 细胞的每个井中，总共 1 mL 的完整 DMEM 介质中含有 10% FBS 和 1% 笔链。
2. 当细胞汇合为 80-90% 时，将介质更改为 DMEM 外耗竭介质。在每个井中加入 1、5 或 10 μg 的标签 SEV，用于 1、4 和 24 小时的剂量和时间依赖性吸收，或添加同等数量的染料控制。

5. 主要星体文化

1. 通过诱导体温过低，在出生后4天麻醉4只产后幼崽。
2. 收集大脑在一个60毫米的培养皿含有冰冷汉克的平衡盐溶液（HBSS），辅以10mM 4-（2-羟基乙基）-1-管道酸（HEPES）。
3. 解剖皮质叶和去除脑膜。用消毒刀片切碎纸巾。
4. 将组织转移到一个15mL圆锥管，其中含有帕明/脱氧核素酶I分离缓冲器，并在37°C下孵育20分钟。 每 5 分钟旋转一次。
   注:对于 4 个鼠标皮质，HBSS 中 9 mL 的 7.5 U/mL Papain 在 37 °C 下激活至少 30 分钟，通过 0.22 μm 注射器过滤器过滤，并与脱氧核素酶 I 混合，最终浓度为 0.1 毫克/毫升。
5. 吸气超纳坦，并添加5mL的完整DMEM，以灭活酶活性。小心地三重奏，用 5 毫升玻璃血清学移液器和火焰抛光巴斯德移液器分离组织。
6. 通过 40 μm 细胞过滤器传递细胞悬浮液，并在 250 × g 下离心 5 分钟，在 4 °C 下离心。 在 75 厘米² 的烧瓶中将介质吸气并播种 10 mL 的完整 DMEM 中的细胞。电镀后，用 15 mL 的新鲜 DMEM 介质 4 h 替换超高介质。
7. 在体外14天后，将烧瓶转移到轨道摇床，以320转时以6小时分离微胶质和寡头细胞。
8. 在37°C下使用5ml的细胞分离酶（材料表）尝试将剩余的星细胞消毒10分钟。 加入5mL的完整DMEM，以灭活酶作用，并在250×g下在4°C下将细胞颗粒5分钟。
9. 将细胞重新悬念在完整的 DMEM 中。种子 5 × 10⁴ 细胞在 12 毫米 #1.5 盖片在 24 井板.

6. 星细胞吸收SEV

1. 当星细胞达到 80-90% 的汇合时，将介质更改为 DMEM 外耗竭介质。
2. 在细胞中加入 1 μg 未标记、标记的 SEV、同等数量的染料控制或 PBS。使用细胞在 SEV 治疗后涂色 1 小时和 24 小时。

7. 免疫荧光

1. 用PBS 3x冲洗细胞，在室温下用PB中4%的PFA将其修复10分钟。
2. 用 PB 清洗固定单元 3 x 5 分钟，在 PB 中使用 0.1% Triton X-100 将其渗透 10-15 分钟，然后用 PB 3 x 5 分钟清洗。
3. 在室温下，用PB中5%的正常山羊血清（NGS）阻断细胞1小时。
4. 用原发性抗体孵育细胞:神经-2a细胞的微管相关蛋白质2（MAP2A，1:500），或在4°C的新鲜5%NGS/PB过夜时，在新鲜5%NGS/PB中对原发性纤维酸性蛋白（GFAP，1:500）进行轻度摇晃。
5. 用PB洗3 x 10分钟，加入荧光结合的二级抗体（山羊抗鼠格1，亚历克萨荧光594;或山羊抗鼠标IgG H&l，亚历克萨氟488）在5%的NGS和孵育2小时的室温在摇动器上。
6. 用PB洗3 x 10分钟，在室温下用1微克/mL的核污渍4'，6-二苯甲酸酯（DAPI）孵育10分钟。用 PB 再次清洗细胞 3 倍。
7. 使用防褪料安装介质将盖片安装在 #1 幻灯片上。让它们在黑暗中干燥过夜，并将准备好的玻璃滑梯存储在 4 °C 下，直到在共聚焦显微镜上成像。

8. 在体内 吸收 SEV

1. 将 5 μg 未贴标签或标记的 SEV 在 10 μL PBS 中重新使用，或将染料控制等量 （10 μL） 注射到 C57BL/6 小鼠体内（如第 3 节所准备）。
2. 注射SEV后6小时和18小时，通过腹内注射100毫克/千克的氯胺酮和10毫克/公斤的锡拉津体重，对小鼠进行深度麻醉。
3. 对有0.9%盐水的小鼠进行内敷，以冲出血液，然后是新鲜出泡的冰冷4%PFA/PB。
4. 解剖脊髓，在 4 °C 下固定 4% PFA/PB，24 小时。在 4 °C 的 PB 中，在 30% 蔗糖中冷冻保护组织，持续 24 小时，或直到组织下沉。将组织储存在 4 °C 下，直到免疫造血。

9. 免疫化学

1. 将L4-L5脊髓嵌入O.C.T化合物中。冻结在干冰上，直到完全凝固。
2. 使用低温统计器在 30 μm（脊髓横截面）处分割组织，并在含有 PB 的 24 井板中收集这些部分。用 PB 中的 0.3% Triton 清洗第 3 x 5 分钟。
3. 在室温下，在 2 小时的 2 小时中，用 5% NGS 在 0.3% Triton/PB 中阻止非特定的绑定站点。
4. 稀释原发抗体:抗MAP2A（1:500）、GFAP（1:1，000）、Iba1（1:2，000），5%NGS在0.3%的Triton/PB，并在摇床上以4°C孵育部分过夜。
5. 用 0.3% Triton/PB 清洗第 3 x 5 分钟，并在室温下 5% NGS/PB 中加入二级抗体（驴抗兔 IgG 亚历克萨氟 488、1:500 或山羊抗鼠 Igg Alexa Fluor 488、1:500），2 小时的 NGS/PB。
6. 用 PB 清洗 3 x 5 分钟，并在室温下将部分以 1 μg/mL 的 DAPI 中孵育 10 分钟。用 PB 清洗第 3 x 5 分钟。
7. 在清洁的胶粘剂幻灯片（材料表）上用细小的画笔在光显微镜下安装部分。
8. 用安装介质弄湿盖唇。在室温下在黑暗中过夜。
9. 与相关激光器在聚焦显微镜下的图像。

结果

通过离心将 SEV 与 RAW 264.7 条件介质隔离后，NTA 用于确定纯化 SEV 的浓度和大小分布。RAW 264.7 衍生 SEV 的平均平均尺寸为 140 nm，峰值粒子大小为 121.8 nm，确认光散射测量中大多数可检测到的粒子在 50-150 nm 的外显子或 SEV 大小范围内（图 1A）。正如在细胞外囊泡研究的最小信息2018（MISEV2018）23建议，我们分析了一组蛋白质，应该存在或排除在不同的EV种群。SE...

讨论

在此协议中，我们展示了带有 PKH 染料的 SEV 标签及其在脊髓中的吸收的可视化。PKH嗜红荧光染料被广泛用于通过流细胞学和荧光显微镜^{3，5，6，12，24，25}标记细胞。由于PKH染料的半衰岁和细胞毒性相对较低，可用于广泛的体内和体外?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters	MilliporeSigma	Z677094
Anti-Alix Antibody	Abcam	ab186429	1:1000
Anti-Calnexin Antibody	Abcam	Ab10286	1:1000
Anti-CD81 Antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-166029	1:1000
Anti-GAPDH Monoclonal Antibody (14C10)	Cell Signaling Technology	2118	1:1000
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody	Sigma-Aldrich	MAB360	1:500 for IF; 1:1000 for IHC
Anti-Iba1 Antibody	Wako	019-19741	1:2000
Anti-MAP2A Antibody	Sigma-Aldrich	MAB378	1:500
Bovine Serum Albumin (BSA)	VWR	0332
Cell Strainer, 40 μm	VWR	15-1040-1
Centrifuge Tubes	Thermo Scientific	3118-0050	12,000 x g
Coverslip, 12-mm, #1.5	Electron Microscopy Sciences	72230-01
Coverslip, 18-mm, #1.5	Electron Microscopy Sciences	72222-01
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542-1MG	1 µg/mL
DC Protein Assay	Bio-Rad	500-0116
Deoxyribonuclease I (DNAse I)	MilliporeSigma	D4513-1VL
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)	Abcam	ab16284	1:10000
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-21206	1:500
Double Frosted Microscope Slides, #1	Thermo Scientific	12-552-5
DPBS without Calcium and Magnesium	Corning	21-031-CV
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Corning	10-013-CV
Exosome-Depleted Fetal Bovine Serum	Gibco	A27208-01
Fetal Bovine Serum (FBS)	Corning	35-011-CV
FluorChem M imaging system	ProteinSimple
FV3000 Confocal Microscope	Olympus
Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP)	Abcam	ab6789	1:10000
Goat Anti-Mouse IgG H&L, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11001	1:500
Goat Anti-Mouse IgG1, Alexa Fluor 594	Invitrogen	A-21125
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	VWR	02-0121
HEPES	Gibco	15630080
HRP Substrate	Thermo Scientific	34094
Intercept blocking buffer, TBS	LI-COR Biosciences	927-60001
Laemmli SDS Sample Buffer	Alfa Aesar	AAJ61337AC
Micro Cover Glass, #1	VWR	48404-454
Microm HM550	Thermo Scientific
NanoSight NS300 system	Malvern Panalytical
NanoSight NTA 3.2 software	Malvern Panalytical
Neuro-2a Cell Line	ATCC	CCL-131
Normal Goat Serum	Vector Laboratories	S-1000
O.C.T Compound	Sakura Finetek	4583
Papain	Worthington Biochemical Corporation	NC9597281
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	19210
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
PKH26	Sigma-Aldrich	MINI26-1KT
PKH67	Sigma-Aldrich	MINI67-1KT
Protease Inhibitor Cocktail	Thermo Scientific	1862209
PVDF Transfer Membrane	MDI	SVFX8302XXXX101
RAW 267.4 Cell Line	ATCC	TIB-71
RIPA Buffer	Sigma-Aldrich	R0278
Sodium Chloride	AMRESCO	0241-2.5KG
Superfrost Plus Gold Slides	Thermo Scientific	15-188-48	adhesive slides
T-75 Flasks	Corning	431464U
Tecnai 12 Digital Transmission Electron Microscope	FEI Company
TEM Grids	Electron Microscopy Sciences	FSF300-cu
Tris-Glycine Protein Gel, 12%	Invitrogen	XP00120BOX
Tris-Glycine SDS Running Buffer	Invitrogen	LC26755
Tris-Glycine Transfer Buffer	Invitrogen	LC3675
TrypLE Express		cell dissociation enzyme
Triton X-100	Acros Organics	327371000
Trypsin, 0.25%	Corning	25-053-CL
Tween 20
Ultracentrifuge Tubes	Beckman	344058	110,000 x g