Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מתארים פרוטוקול לתיוג שלטי מקרופאג' קטנים חוץ-תאיים עם צבעי PKH ומתבוננים בקליטתם במבחנה ובחוט השדרה לאחר הלידה התוך-תאית.

Abstract

שלל חוץ-תאי קטן (sEVs) הם שלל 50-150 ננומטר המופרש על ידי כל התאים ונוכח בנוזלי גוף. sEVs מעבירים ביומולקולים כגון RNA, חלבונים ושומנים מתורם לתאים מקבלים, מה שהופך אותם למתווכים מרכזיים בין תאים. במערכת העצבים המרכזית (מערכת העצבים המרכזית), sEVs יכול לתווך איתות בין תאי, כולל אינטראקציות נוירואימוניות. פונקציות sEV ניתן ללמוד על ידי מעקב אחר ספיגת sEVs מסומן בתאי הנמען הן במבחנה והן ב- vivo. מאמר זה מתאר את התיוג של sEVs מהמדיה המותנית של תאי מקרופאגים RAW 264.7 באמצעות צבע קרום PKH. זה מראה את ספיגת ריכוזים שונים של sEVs מסומן בנקודות זמן מרובות על ידי תאי Neuro-2a אסטרוציטים ראשוניים במבחנה. כמו כן מוצגת ספיגת SEVs המועברת באופן תוך-רחמי בנוירונים של חוט השדרה של העכבר, אסטרוציטים ומיקרוגליה המודגמים על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. התוצאות הייצוגיות מדגימות שונות תלוית זמן בספיגת ה- SEVs על ידי תאים שונים, אשר יכול לעזור לאשר מסירת SEVs מוצלחת לחוט השדרה.

Introduction

שלל חוץ-תאי קטן (sEVs) הם שלטי ננו-ממברנה שמקורם בממברנה עם טווח גודל של 50-150 ננומטר. מקורם בגופים רב-דרכים (MVBs) ומשוחררים מתאים עם היתוך ה-MVBs עם קרום הפלזמה. sEVs מכילים miRNAs, mRNAs, חלבונים, שומנים ביואקטיביים, ומולקולות אלה מועברות בין תאים בצורה של תקשורת בין תא לתא. sEVs יכול להיות מופנמ על ידי תאי הנמען על ידי מגוון של מסלולים אנדוציטיים, ו לכידה זו של sEVs על ידי תאי הנמען מתווכת על ידי זיהוי של מולקולות פני השטח הן על כלי עבודה והן על תאי היעד1.

sEVs צברו עניין בשל יכולתם לעורר שינויים מולקולריים ופנוטיפיים בתאים המקובלים, התועלת שלהם כסוכן טיפולי, ואת הפוטנציאל שלהם כמו נשאים עבור מולקולות מטען או סוכנים פרמקולוגיים. בשל גודלם הקטן, ההדמיה והמעקב אחר SEVs יכולים להיות מאתגרים, במיוחד עבור מחקרי vivo והגדרות קליניות. לכן, פותחו שיטות רבות לתיוג ותמונה sEVs כדי לסייע biodistribution ומעקב במבחנה ו in vivo2.

הטכניקה הנפוצה ביותר לחקר ייחוס ביולוגי של sEV ואינטראקציות בין תאי יעד כוללת תיוג אותם עם מולקולות צבע פלואורסצנטי3,4,5,6,7. EVs סומנו בתחילה עם צבעי קרום התא ששימשו בדרך כלל לתאי תמונה. צבעים פלואורסצנטיים אלה מכתימים בדרך כלל את דו-שכבתי השומנים או חלבונים מעניינים על SEVs. מספר צבעים ליפופיליים מציגים אות פלואורסצנטי חזק כאשר הם משולבים בציטוסול, כולל DiR (1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindotricarbocyanine יוד), DiL (1, 1′-dioctadecyl-3, 3, 3′, 3′-tetramethyl indocarbocyanine perchlorate), ו- DiD (1, 1′-dioctadecyl-3, 3, 3′, 3′-tetramethyl indocarbocyanine 4-כלורובצנסולפונט מלח)8,9,10,11.

צבעים ליפופיליים אחרים, כגון PKH67 ו- PKH26, יש קבוצת ראש קוטב פלואורסצנטית מאוד וזנב פחמימנים אליפטי ארוך כי בקלות intercalate לתוך כל מבנה שומנים ומוביל שימור צבע לטווח ארוך פלואורסצנטיותיציבה 12. צבעי PKH יכולים גם לתייג EVs, המאפשר את המחקר של תכונות EV ב vivo13. צבעים רבים אחרים שימשו לצפייה אקסוזומים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וציטומטריית זרימה, כולל צבעי תיוג שומנים14 וצבעים חדירים לתא כגון carboxyfluorescein diacetate succinimidyl אסתר (CFDA-SE)15,16 ו קלצ'ין אצטטוקסימתיל (AM) אסתר17.

מחקרים של sEV בתיווך צולב בין תאים שונים במערכת ן סיפקו תובנות חשובות על הפתוגנזה של מחלות נוירו-דליקות ונוירודגנרטיביות18. לדוגמה, SEVs מתאי עצב יכולים להפיץ פפטידים בטא עמילואיד וחלבוני טאו זרחן ולסייע בפתוגנזה של מחלתאלצהיימר 19. בנוסף, כלי עבודה אלקטרוניים הנגזרים אריתרוציטים מכילים כמויות גדולות של אלפא-סינוקלין ויכולים לחצות את מחסום הדם - מוח ולתרום לפתולוגיה של פרקינסון20. היכולת של SEVs לחצות מחסומים פיזיולוגיים21 ולהעביר biomolecules שלהם לתאי היעד עושה להם כלים נוחים כדי לספק תרופות טיפוליות ל- CNS22.

הדמיית ספיגת SEV על ידי תאי CNS רבים בחוט השדרה תאפשר הן מחקרים מכניים והן הערכת היתרונות הטיפוליים של SEV מנוהל אקסוגני ממקורות תאיים שונים. מאמר זה מתאר את המתודולוגיה לתייג SEVs הנגזר מקרופאגים ולדמיין את ספיגתם במבחנה וב- vivo בחוט השדרה המותני על ידי נוירונים, מיקרוגליה ואסטרוציטים כדי לאשר באופן איכותי את מסירת SEV על ידי הדמיה.

Protocol

הערה: כל ההליכים בוצעו בהתאם למדריך NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש במכללה לרפואה של אוניברסיטת דרקסל. עכברי CD-1 בהריון מתוזמן שימשו לתרבות אסטרוציטית, וכל הסכרים התקבלו 15 ימים לאחר הספגה. עכברי C57BL/6 בני 10-12 שבועות שימשו לניסויי ספיגת ויוו.

1. בידוד של SEVs מתאי מקרופאגים RAW 264.7

  1. תרבות RAW 264.7 תאים ב 75 ס"מ2 צלוחיות במדיום DMEM exosome-מרוקן המכיל 10% סרום בקר עוברי exosome מרוקן (FBS) ו 1% פניצילין-סטרפטוצין (עט-סטרפטוקוקוס) עבור 24-48 שעות.
  2. לאסוף 300 מ"ל של בינוני מותנה צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 10 דקות ב 4 °C (70 °F).
  3. לאסוף את supernatant וצנטריפוגה ב 2,000 × גרם במשך 20 דקות ב 4 °C (70 °F).
  4. מעבירים את הסופר-נט לצינורות צנטריפוגות, צנטריפוגה למשך 35 דקות ב-12,000 × גרם ב-4 מעלות צלזיוס.
  5. לאסוף את supernatant ולסנן דרך מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר.
  6. העבר צינורות אולטרה צנטריפוגה וצנטריפוגה במשך 80 דקות ב 110,000 × גרם ב 4 °C (50 °F).
  7. אחסן את החומר-על (בינוני מרוקן אקסוזום), תגדיל מחדש את הכדור ב-2 מ"ל של תמיסת מלח עם פוספט אחד (PBS) וצנטריפוגה למשך שעה אחת ב-110,000 גרם × ב-4 מעלות צלזיוס.
  8. Resuspend הכדור ב 100 μL של PBS לאפיון נוסף באמצעות ניתוח מעקב ננו-חלקיקים (NTA) ומיקרוסקופיית אלקטרונים שידור (TEM) או ב- radioimmunoprecipitation assay (RIPA) חוצץ עבור סופג מערבי.

2. אפיון של SEVs

  1. ניתוח מעקב חלקיקים (NTA)
    הערה: התפלגות הגודל ומספר החלקיקים/ריכוז ה- sEV המטוהרים מתאי RAW 264.7 נמדדו על ידי NTA.
    1. לדלל את ה- sEVs ב- PBS מסונן כדי להשיג 20-60 של שלל לכל שדה תצוגה למעקב מיטבי.
    2. הציגו את הדגימה המדוללת לתא זרימה באמצעות משאבת מזרק עם קצב זרימה קבוע.
    3. צ'3-5 סרטונים של 30 שניות כל אחד. הגדר את מהירות הצמצם ואת הרווח, ומקד באופן ידני את הגדרות המצלמה עבור המספר המרבי של שלל להיות גלוי ומסוגל להיות במעקב וניתוח.
    4. קדם את הדגימות בין כל הקלטה כדי לבצע מדידות שכפול. מטב את ההגדרות לאחר הרכישה של NTA ושמור על ההגדרות קבועות בין הדוגמאות.
    5. נתח כל סרטון באמצעות תוכנת NTA כדי להשיג את הגודל והריכוז הממוצעים של השלל.
    6. בצע את כל מדידות NTA עם הגדרות מערכת זהות לעקביות.
  2. כתם מערבי
    1. לכמת את כמויות החלבון הכוללות ב- sEV, בליזאטים של תאים ומדיה מרוקנת אקסוזום באמצעות ערכת חלבון לפי הוראות היצרן.
    2. להכנת ליסאט תא, תרבית RAW 264.7 תאים ב 75 ס"מ2 צלוחיות עד 80-90% confluent. לנתק את התאים עם 0.25% טריפסין במשך 10-15 דקות, לנטרל את טריפסין עם מדיה תרבית, ולגלות את התאים על ידי ספינינג ב 400 × גרם במשך 5 דקות. resuspend התאים במדיום צמיחה טרי.
    3. לספור את התאים באמצעות hemocytometer ולהעביר 1 × 106 תאים לצינור אחר. לשטוף את התאים עם PBS פעמיים באמצעות אותם תנאי צנטריפוגה כמו לעיל ולהוסיף 50 μL של מאגר תמוגה (חוצץ RIPA עם קוקטייל מעכב פרוטאז הוסיף) לכדור התא מן הסיבוב הסופי.
    4. מערבולת את התאים ולשמור אותם על קרח במשך 20 דקות. נושא את התערובת לצנטריפוגה ב 10,000 × גרם במשך 30 דקות ב 4 °C (4 °F), לאסוף את supernatant (כלומר, ליסאט) בצינורות microcentrifuge טרי, ולשמור על −80 °C (70 °F) עד השימוש.
    5. מרכז 2 מ"ל של מדיה מרוקנת אקסוזום ל 100 μL באמצעות 3 מסננים צנטריפוגליים חתוך kDa לפני כימות כמות החלבון. מערבבים את ה-sEVs עם חיץ תמוגה ביחס של 1:1, מערבולת ל-30 מעלות ודגרה על קרח למשך 15 דקות כדי לכמת את כמות החלבון.
    6. ערבבו כמויות שוות של חלבון (2 מיקרוגרם) של ה-sEVs, ליסאט תאי RAW 264.7 ומדיה מרוקנת אקסוזום עם הפחתת מאגר הדגימה.
    7. דנטורה את הדגימות ב 95 °C (5 דקות), לשמור אותם על קרח במשך 5 דקות, ולהסתובב במשך 2 דקות ב 10,000 × גרם. טען את הדגימות על ג'ל חלבון טריס-גליצין 12% והפעל את הג'ל ב 125 V במשך 45 דקות.
    8. העבר את החלבון על קרום פוליווינילידן דיפלואוריד (PVDF) ב 25 V עבור 2 שעות.
    9. לאחר ההעברה, לחסום את ממברנות PVDF עם חוצץ חסימה (ראה טבלת החומרים) עבור 1 שעה בטמפרטורת החדר.
    10. לדגור את כתם עם נוגדנים ראשוניים על שייקר לילה ב 4 °C (50 °F).
      הערה: נוגדנים עיקריים בשימוש היו אנטי CD81 (1:1,000), אנטי אלפא-1,3/1,6-mannosyltransferase (ALG-2)-אינטראקציה חלבון X (Alix) (1:1,000), אנטי קלנקסין (1:1,000), ו anti-גליצרלדהיד 3-פוספט דהידרונאז (GAPDH) (1:1,000).
    11. לשטוף את כתמים 3 x 15 דקות עם 1x תמיסת מלח חוצצת טריס, 0.1% Tween 20 (TBST), ודגרה בטמפרטורת החדר עם עיזים נגד עכבר IgG-חזרת peroxidase (HRP)- או נוגדנים משניים נגד ארנב IgG-HRP-HRP(1:10,000) עבור 1 שעה על שייקר.
    12. לשטוף את כתמים 3 x 15 דקות עם 1x TBST, ולזהות את החלבונים באמצעות מצע HRP.
    13. נתח את הכתמים על ידי כימותרפיה משופרת באמצעות צלם כתם מערבי.
  3. מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור (TEM)
    1. תקן sEVs על-ידי שימוש חוזר בהם ב- paraformaldehyde של 2% (PFA) במאגר פוספט (PB) של 0.1 M; מערבולת עבור 2 x 15 s.
    2. מניח טיפה של 10 μL של השעיית sEV על parafilm נקי. צפים את רשת ה-formvar מצופה הפחמן בטיפה כשצדם מצופה פונה אל המתלים. תן לממברנות להיספג במשך 20 דקות בסביבה יבשה.
    3. מניחים את הרשתות (בצד הממברנה כלפי מטה) על טיפה של PB לשטוף במשך 3 x 2 דקות.
    4. העבר את הרשתות ל 50 μL של 1% glutaraldehyde במשך 5 דקות.
    5. לשטוף את הרשתות עם 100 μL של מים מזוקקים במשך 8 x 2 דקות.
    6. השווה את המדגם על ידי הצבת הרשתות על ירידה של 1% אורניל אצטט במשך 2 דקות.
    7. הטמיע את המדגם עם 50 μL של 0.2% אורניל אצטט עם 2% פתרון methylcellulose במשך 10 דקות על צלחת קרח מכוסה parafilm.
    8. השתמש לולאות נירוסטה להחזיק את הרשתות ולהסיר נוזל עודף עם נייר מסנן.
    9. ייבש את הרשת במשך 10 דקות בעוד עדיין בלולאה.
    10. צפה תחת מיקרוסקופ אלקטרונים שידור ב 80 kV.

3. תיוג של SEVs

  1. לדלל 20 מיקרוגרם של sEVs ב 1 מ"ל של מאגר דילול או אותו נפח של PBS ב 1 מ"ל של מאגר דילול לשליטה בצבע.
  2. לדלל 3 μL של PKH67 או PKH26 צבע ב 1 מ"ל של חיץ דילול ומערבבים על ידי pipetting.
  3. הוסיפו צבע PKH מדולל לארופי ה-SEV המדוללים וערבבו על ידי צנרת. דגירה במשך 5 דקות בחושך בטמפרטורת החדר. לשליטה בצבע, ערבבו את הצבע מדולל עם PBS מדולל משלב 3.1.
  4. הוסיפו 2 מ"ל של 1% סרום בקר (BSA) ב-PBS לצינור עם הצבע ותערובת ה-sEV ולצינור בקרת הצבע כדי לספוג עודפי צבע.
  5. צנטריפוגה עבור 1 שעה ב 110,000 × גרם ב 4 °C (50 °F). השלך את supernatant, resuspend הכדור ב 2 מ"ל של PBS, וצנטריפוגה עבור 1 שעה ב 110,000 × גרם ב 4 °C (60 °F). חזור על הכביסה עם PBS וערך מחדש את ה- sEV המסומן או את פקד הצבע בנפח שווה של PBS.
  6. לכמת את כמות החלבון הכוללת בשיטת ברדפורד.

4. ספיגת SEVs על ידי תאי Neuro-2a

  1. מניחים כיסויים של 18 מ"מ בצלחת 12-well ולוח 10 × 104 תאי Neuro-2a בכל באר בסך הכל 1 מ"ל של מדיום DMEM מלא המכיל 10% FBS ו 1% סטרפטוקוקו אחר עט.
  2. שנה את המדיום הבינוני למדיום המרוקן מ- DMEM כאשר ההשפעה על התא היא 80-90%. הוסף 1, 5 או 10 מיקרוגרם של SEVs המסומנים בכל באר עבור 1, 4 ו- 24 שעות עבור ספיגה תלוית מינון וזמן, או הוסף נפח שווה של בקרת צבע.

5. תרבויות אסטרוציטיות עיקריות

  1. מרדים 4 גורים לאחר הלידה 4 ימים לאחר הלידה על ידי גרימת היפותרמיה.
  2. לאסוף את המוחות בצלחת פטרי 60 מ"מ המכילה קר כקרח האנק פתרון מלח מאוזן (HBSS) בתוספת 10 mM 4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-piperazineethanesulfonic חומצה (HEPES).
  3. לנתח את שתי האונות קליפת המוח ולהסיר את קרום המוח. טחון את הרקמות עם להב מעוקר.
  4. להעביר את הרקמות לצינור חרוט 15 מ"ל המכיל פפאין / deoxyribonuclease אני חוצץ דיסוציאציה ודגרה במשך 20 דקות ב 37 °C (7 °F). מערבבים כל 5 דקות.
    הערה: עבור 4 קליפות עכבר, 9 מ"ל של 7.5 U /mL פפאין ב HBSS מופעל ב 37 °C לפחות 30 דקות, מסונן דרך מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר, מעורבב עם deoxyribonuclease I לריכוז סופי של 0.1 מ"ג / מ"ל.
  5. שאפו את supernatant ולהוסיף 5 מ"ל של DMEM מלא כדי לנטרל את פעילות האנזים. בזהירות טריטורציה כדי לנתק את הרקמות עם פיפטה סרולוגית זכוכית 5 מ"ל ופפטת פסטר מלוטשת להבה.
  6. להעביר את ההשעיה התא דרך מסננת תא 40 מיקרומטר וצנטריפוגה התאים ב 250 × גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (5 °F). שאפו את המדיום וזרעו את התאים ב-10 מ"ל של DMEM שלםבבקבוקון 2 של 75 ס"מ. החלף את המדיום העל-טבעי ב-15 מ"ל של DMEM בינוני טרי 4 שעות לאחר ה ציפוי.
  7. לאחר 14 ימים במבחנה, להעביר את הבקבוקון לשייקר מסלולית לנתק את המיקרוגליה ואוליגודנדרוציטים ב 320 סל"ד עבור 6 שעות.
  8. Trypsinize את אסטרוציטים הנותרים באמצעות 5 מ"ל של אנזים דיסוציאציה התא (שולחן החומרים) במשך 10 דקות ב 37 °C (7 °F). הוסף 5 מ"ל של DMEM מלא כדי לאפעיל את הפעולה אנזימטית ולכדור את התאים ב 250 × גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (70 °F).
  9. תקיף מחדש את התאים ב- DMEM מלא. זרע 5 × 104 תאים על 12 מ"מ #1.5 מכסה בצלחת 24-well.

6. ספיגת SEVs על ידי אסטרוציטים

  1. כאשר אסטרוציטים מגיעים ל-80-90% שיתוף, שנה את המדיום למדיום מרוקן DMEM.
  2. הוסף 1 מיקרוגרם של sEV ללא תווית, עם תווית, נפח שווה של בקרת צבע או PBS לתאים. השתמש בתאים להכתמה 1 שעות ו 24 שעות לאחר טיפול sEV.

7. אימונופלואורסצנטיות

  1. לשטוף את התאים עם PBS 3x ולתקן אותם עם 4% PFA ב PB במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  2. לשטוף את התאים הקבועים 3 x 5 דקות עם PB ולחלחל להם באמצעות 0.1% Triton X-100 ב PB במשך 10-15 דקות לשטוף עם PB 3 x 5 דקות.
  3. לחסום את התאים עם 5% סרום עז נורמלי (NGS) ב PB במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר.
  4. לדגור על התאים עם נוגדנים ראשוניים: חלבון הקשור microtubule 2 (MAP2A, 1:500) עבור תאי Neuro-2a או חלבון חומצי פרברי גליה (GFAP, 1:500) עבור אסטרוציטים ראשוניים טרי 5% NGS / PB לילה ב 4 °C עם רועד עדין.
  5. לשטוף 3 x 10 דקות עם PB ולהוסיף נוגדנים משניים מצומדים פלואורופור (עז אנטי עכבר IgG1, אלכסה פלור 594; או עז אנטי עכבר IgG H&L, אלכסה פלור 488) ב 5% NGS ודגרה עבור 2 שעות בטמפרטורת החדר על רוקר.
  6. לשטוף 3 x 10 דקות עם PB ודגורה עם 1 מיקרוגרם / מ"ל של כתם גרעיני 4 ',6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI) במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את התאים שוב 3x עם PB.
  7. טען את כיסויי השער בשקופיות #1 באמצעות מדיום הרכבה נגד פיד. תן להם להתייבש לילה בחושך, ולאחסן את שקופיות הזכוכית המוכנות ב 4 °C (5 °F) עד הדמיה על מיקרוסקופ קונפוקלי.

8. ספיגת ויוו של SEVs

  1. בצע הזרקה תוך-תיאטרלית של 5 מיקרוגרם של sEVs ללא תווית או תווית resuspended ב 10 μL של PBS, או נפח שווה (10 μL) של בקרת צבע (כפי שהוכן בסעיף 3) לתוך עכברי C57BL /6.
  2. לאחר 6 ו 18 שעות לאחר הזרקה של SEVs, עמוק להרדים עכברים על ידי הזרקה תוך-אישית של 100 מ"ג/ק"ג משקל גוף של קטמין ו 10 מ"ג/ק"ג משקל גוף של xylazine.
  3. בצע זלוף תוך-קרדיאלי של עכברים עם 0.9% תמיסת מלח כדי לשטוף את הדם, ואחריו קר קרח טרי 4% PFA / PB.
  4. לנתח את חוט השדרה ולתקן ב 4% PFA / PB ב 4 °C (55 °F) עבור 24 שעות. Cryoprotect על הרקמות ב 30% סוכרוז ב PB ב 4 °C (50 °F) במשך 24 שעות או עד הרקמות לשקוע. לאחסן את הרקמות ב 4 °C (55 °F) עד immunohistochemistry.

9. אימונוהיסטוכימיה

  1. הטמע חוט השדרה L4-L5 במתחם O.C.T. יש להקפיא על קרח יבש עד להתגבשות מלאה.
  2. חלק את הרקמות ב 30 מיקרומטר (חתך עבור חוט השדרה) באמצעות cryostat, ולאסוף את החלקים בצלחת 24 באר המכיל PB. לשטוף את החלקים 3 x 5 דקות עם 0.3% טריטון PB.
  3. חסום אתרי כריכה לא ספציפיים עם 5% NGS ב- 0.3% טריטון/PB למשך 2 שעות בטמפרטורת החדר.
  4. לדלל נוגדנים עיקריים: אנטי MAP2A (1:500), GFAP (1:1,000), Iba1 עבור מיקרוגליה (1:2,000) עם 5% NGS ב 0.3% טריטון / PB, ודגורת המקטעים לילה ב 4 °C על שייקר.
  5. לשטוף את החלקים 3 x 5 דקות עם 0.3% טריטון / PB, ולהוסיף נוגדנים משניים (חמור נגד ארנב IgG אלכסה פלואור 488, 1:500, או עז נגד עכבר IgG אלכסה פלור 488, 1:500) ב 5% NGS / PB עבור 2 שעות בטמפרטורת החדר.
  6. לשטוף 3 x 5 דקות עם PB, ולדגירה את החלקים ב 1 מיקרוגרם / מ"ל של DAPI במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את החלקים 3 x 5 דקות עם PB.
  7. הר את המקטעים על שקופית דבק נקי (שולחן חומרים) עם מברשת צבע עדינה תחת מיקרוסקופ אור.
  8. מרטיבים את כיסוי עם בינוני הרכבה. לרפא לילה בחושך בטמפרטורת החדר.
  9. תמונה תחת מיקרוסקופ קונפוקלי עם הלייזרים המתאימים.

תוצאות

לאחר בידוד של SEVs מ RAW 264.7 מדיה מותנית באמצעות צנטריפוגה, NTA שימש כדי לקבוע את הריכוז ואת התפלגות הגודל של SEVs מטוהר. הגודל הממוצע הממוצע של ה-RAW 264.7 sEVs נגזר היה 140 ננומטר, וגודל החלקיקים שיא היה 121.8 ננומטר, המאשר כי החלקיקים הניתנים לזיהוי ביותר במדידת פיזור האור נפלו בטווח הגודל של exosomes או sEVs ב 50-...

Discussion

בפרוטוקול זה, הראינו את התיוג של SEVs עם צבעי PKH ואת ההדמיה של ספיגתם בחוט השדרה. PKH צבעי פלואורסצנטית ליפופילית נמצאים בשימוש נרחב לתיוג תאים על ידי ציטומטריית זרימה ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית3,5,6,12,24,

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי מענקים מ NIH NINDS R01NS102836 ואת מחלקת הבריאות של חבר העמים הבריטי אוניברסלי שיפור מחקר (CURE) הוענק Seena ק אג'יט. אנו מודים לד"ר בראדלי נאש על הקריאה הביקורתית של כתב היד.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filtersMilliporeSigmaZ677094
Anti-Alix AntibodyAbcamab1864291:1000
Anti-Calnexin AntibodyAbcamAb102861:1000
Anti-CD81 AntibodySanta Cruz Biotechnologysc-1660291:1000
Anti-GAPDH Monoclonal Antibody (14C10)Cell Signaling Technology21181:1000
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein AntibodySigma-AldrichMAB3601:500 for IF; 1:1000 for IHC
Anti-Iba1 AntibodyWako019-197411:2000
Anti-MAP2A AntibodySigma-AldrichMAB3781:500
Bovine Serum Albumin (BSA)VWR0332
Cell Strainer, 40 μmVWR15-1040-1
Centrifuge TubesThermo Scientific3118-005012,000 x g
Coverslip, 12-mm, #1.5Electron Microscopy Sciences72230-01
Coverslip, 18-mm, #1.5Electron Microscopy Sciences72222-01
DAPISigma-AldrichD9542-1MG1 µg/mL
DC Protein AssayBio-Rad500-0116
Deoxyribonuclease I (DNAse I)MilliporeSigmaD4513-1VL
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)Abcamab162841:10000
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488InvitrogenA-212061:500
Double Frosted Microscope Slides, #1Thermo Scientific12-552-5
DPBS without Calcium and MagnesiumCorning21-031-CV
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Corning10-013-CV
Exosome-Depleted Fetal Bovine SerumGibcoA27208-01
Fetal Bovine Serum (FBS)Corning35-011-CV
FluorChem M imaging systemProteinSimple
FV3000 Confocal MicroscopeOlympus
Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP)Abcamab67891:10000
Goat Anti-Mouse IgG H&L, Alexa Fluor 488InvitrogenA-110011:500
Goat Anti-Mouse IgG1, Alexa Fluor 594InvitrogenA-21125
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)VWR02-0121
HEPESGibco15630080
HRP SubstrateThermo Scientific34094
Intercept blocking buffer, TBSLI-COR Biosciences927-60001
Laemmli SDS Sample BufferAlfa AesarAAJ61337AC
Micro Cover Glass, #1VWR48404-454
Microm HM550Thermo Scientific
NanoSight NS300 systemMalvern Panalytical
NanoSight NTA 3.2 softwareMalvern Panalytical
Neuro-2a Cell LineATCCCCL-131
Normal Goat SerumVector LaboratoriesS-1000
O.C.T CompoundSakura Finetek4583
PapainWorthington Biochemical CorporationNC9597281
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences19210
Penicillin-StreptomycinGibco15140122
PKH26Sigma-AldrichMINI26-1KT
PKH67Sigma-AldrichMINI67-1KT
Protease Inhibitor CocktailThermo Scientific1862209
PVDF Transfer MembraneMDISVFX8302XXXX101
RAW 267.4 Cell LineATCCTIB-71
RIPA BufferSigma-AldrichR0278
Sodium ChlorideAMRESCO0241-2.5KG
Superfrost Plus Gold SlidesThermo Scientific15-188-48adhesive slides
T-75 FlasksCorning431464U
Tecnai 12 Digital Transmission Electron MicroscopeFEI Company
TEM GridsElectron Microscopy SciencesFSF300-cu
Tris-Glycine Protein Gel, 12%InvitrogenXP00120BOX
Tris-Glycine SDS Running BufferInvitrogenLC26755
Tris-Glycine Transfer BufferInvitrogenLC3675
TrypLE Expresscell dissociation enzyme
Triton X-100Acros Organics327371000
Trypsin, 0.25%Corning25-053-CL
Tween 20
Ultracentrifuge TubesBeckman344058110,000 x g

References

  1. Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641 (2014).
  2. Betzer, O., et al. Advances in imaging strategies for in vivo tracking of exosomes. Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 12 (2), 1594 (2020).
  3. Dehghani, M., Gaborski, T. R. Fluorescent labeling of extracellular vesicles. Methods in Enzymology. 645, 15-42 (2020).
  4. González, M. I., et al. Covalently labeled fluorescent exosomes for in vitro and in vivo applications. Biomedicines. 9 (1), 81 (2021).
  5. Chuo, S. T. -. Y., Chien, J. C. -. Y., Lai, C. P. -. K. Imaging extracellular vesicles: current and emerging methods. Journal of Biomedical Science. 25 (1), 91 (2018).
  6. vander Vlist, E. J., Nolte-'tHoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).
  7. Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
  8. Heinrich, L., et al. Confocal laser scanning microscopy using dialkylcarbocyanine dyes for cell tracing in hard and soft biomaterials. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 81 (1), 153-161 (2007).
  9. Haney, M. J., et al. Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson's disease therapy. Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).
  10. Grange, C., et al. Biodistribution of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in a model of acute kidney injury monitored by optical imaging. International Journal of Molecular Medicine. 33 (5), 1055-1063 (2014).
  11. Wiklander, O. P., et al. Extracellular vesicle in vivo biodistribution is determined by cell source, route of administration and targeting. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26316 (2015).
  12. Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nature Communications. 6 (1), 7029 (2015).
  13. Deddens, J. C., et al. Circulating extracellular vesicles contain miRNAs and are released as early biomarkers for cardiac injury. Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (4), 291-301 (2016).
  14. Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119 (3), 756-766 (2012).
  15. Escrevente, C., Keller, S., Altevogt, P., Costa, J. Interaction and uptake of exosomes by ovarian cancer cells. BMC Cancer. 11, 108 (2011).
  16. Cho, E., et al. Comparison of exosomes and ferritin protein nanocages for the delivery of membrane protein therapeutics. Journal of Controlled Release. 279, 326-335 (2018).
  17. Mantel, P. Y., et al. Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system. Cell Host & Microbe. 13 (5), 521-534 (2013).
  18. Porro, C., Trotta, T., Panaro, M. A. Microvesicles in the brain: Biomarker, messenger or mediator. Journal of Neuroimmunology. 288, 70-78 (2015).
  19. De Toro, J., Herschlik, L., Waldner, C., Mongini, C. Emerging roles of exosomes in normal and pathological conditions: new insights for diagnosis and therapeutic applications. Frontiers in Immunology. 6, 203 (2015).
  20. Matsumoto, J., et al. Transmission of alpha-synuclein-containing erythrocyte-derived extracellular vesicles across the blood-brain barrier via adsorptive mediated transcytosis: another mechanism for initiation and progression of Parkinson's disease. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 71 (2017).
  21. Matsumoto, J., Stewart, T., Banks, W. A., Zhang, J. The transport mechanism of extracellular vesicles at the blood-brain barrier. Current Pharmaceutical Design. 23 (40), 6206-6214 (2017).
  22. Shaimardanova, A., et al. Extracellular vesicles in the diagnosis and treatment of central nervous system diseases. Neural Regeneration Research. 15 (4), 586-596 (2020).
  23. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  24. Hoen, E. N. M. N. -. t., et al. Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).
  25. Gangadaran, P., Hong, C. M., Ahn, B. -. C. An update on in vivo imaging of extracellular vesicles as drug delivery vehicles. Frontiers in Pharmacology. 9, 169 (2018).
  26. Teare, G. F., Horan, P. K., Slezak, S. E., Smith, C., Hay, J. B. Long-term tracking of lymphocytes in vivo: the migration of PKH-labeled lymphocytes. Cellular Immunology. 134 (1), 157-170 (1991).
  27. Kuffler, D. P. Long-term survival and sprouting in culture by motoneurons isolated from the spinal cord of adult frogs. Journal of Comparative Neurology. 302 (4), 729-738 (1990).
  28. Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731 (2017).
  29. Pužar Dominkuš, P., et al. PKH26 labeling of extracellular vesicles: Characterization and cellular internalization of contaminating PKH26 nanoparticles. Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1860 (6), 1350-1361 (2018).
  30. Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 9533 (2020).
  31. Shimomura, T., et al. New lipophilic fluorescent dyes for labeling extracellular vesicles: characterization and monitoring of cellular uptake. Bioconjugate Chemistry. 32 (4), 680-684 (2021).
  32. Yuan, D., et al. Macrophage exosomes as natural nanocarriers for protein delivery to inflamed brain. Biomaterials. 142, 1-12 (2017).
  33. Polanco, J. C., Li, C., Durisic, N., Sullivan, R., Götz, J. Exosomes taken up by neurons hijack the endosomal pathway to spread to interconnected neurons. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 10 (2018).
  34. Jurgielewicz, B. J., Yao, Y., Stice, S. L. Kinetics and specificity of HEK293T extracellular vesicle uptake using imaging flow cytometry. Nanoscale Research Letters. 15 (1), 170 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

171PKH

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved