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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Descriviamo un protocollo per etichettare piccole vescicole extracellulari derivate da macrofagi con coloranti PKH e osservarne l'assorbimento in vitro e nel midollo spinale dopo il parto intratecale.

Abstract

Le piccole vescicole extracellulari (sEV) sono vescicole da 50-150 nm secrete da tutte le cellule e presenti nei fluidi corporei. Gli sEV trasferiscono biomolecole come RNA, proteine e lipidi dalle cellule donatrici alle cellule accettori, rendendole mediatori chiave di segnalazione tra le cellule. Nel sistema nervoso centrale (SNC), i sEV possono mediare la segnalazione intercellulare, comprese le interazioni neuroimmune. Le funzioni di sEV possono essere studiate monitorando l'assorbimento di sEV etichettati nelle cellule riceventi sia in vitro che in vivo. Questo documento descrive l'etichettatura dei sEV dai mezzi condizionati delle cellule macrofagiCHE RAW 264.7 utilizzando un colorante a membrana PKH. Mostra l'assorbimento di diverse concentrazioni di sEV etichettati in più punti temporali da parte delle cellule Neuro-2a e degli astrociti primari in vitro. Viene anche mostrato l'assorbimento di sEV somministrati per via intratecale nei neuroni del midollo spinale del topo, negli astrociti e nelle microglia visualizzate mediante microscopia confocale. I risultati rappresentativi dimostrano una variazione dipendente dal tempo nell'assorbimento di sEV da parte di cellule diverse, che può aiutare a confermare il successo della consegna di sEV nel midollo spinale.

Introduzione

Le piccole vescicole extracellulari (sEV) sono vescicole nanodimensionate derivate dalla membrana con un intervallo di dimensioni di 50-150 nm. Hanno origine da corpi multi-vescicolari (MVB) e vengono rilasciati dalle cellule dopo la fusione degli MVB con la membrana plasmatica. Gli sEV contengono miRNA, mRNA, proteine e lipidi bioattivi e queste molecole vengono trasferite tra le cellule sotto forma di comunicazione cellula-cellula. Le sEV possono essere internalizzate dalle cellule riceventi attraverso una varietà di vie endocitiche e questa cattura di sEV da parte delle cellule riceventi è mediata dal riconoscimento delle molecole di superficie sia sugli EV che sulle cellule bersaglio1.

I sEV hanno guadagnato interesse grazie alla loro capacità di innescare cambiamenti molecolari e fenotipici nelle cellule accettori, alla loro utilità come agente terapeutico e al loro potenziale come vettori di molecole di carico o agenti farmacologici. A causa delle loro piccole dimensioni, l'imaging e il tracciamento dei sEV possono essere impegnativi, specialmente per gli studi in vivo e le impostazioni cliniche. Pertanto, sono stati sviluppati molti metodi per etichettare e immaginare i sEV per aiutare la loro biodistribuzione e tracciamento in vitro e in vivo2.

La tecnica più comune per studiare la biodistribuzione sEV e le interazioni delle cellule bersaglio prevede l'etichettatura con molecole di colorante fluorescente3,4,5,6,7. I veicoli elettrici sono stati inizialmente etichettati con coloranti a membrana cellulare che erano comunemente usati per l'immagine delle cellule. Questi coloranti fluorescenti generalmente macchiano il doppio strato lipidico o le proteine di interesse sui sEV. Diversi coloranti lipofili mostrano un forte segnale fluorescente quando incorporati nel citosol, tra cui DiR (1,1′-diottadecile-3,3,3′,3′-tetrametilinditricarbocianina ioduro), DiL (1, 1′-diottadecile-3, 3, 3′, 3′-tetrametil indocarbocianina perclorato) e DiD (1, 1′-diottadecile-3, 3, 3′,3′-tetrametil indocarbocianine 4-clorobenzensolfonato sale)8,9,10,11.

Altri coloranti lipofili, come PKH67 e PKH26, hanno un gruppo di testa polare altamente fluorescente e una lunga coda di idrocarburi alifatici che si intercala facilmente in qualsiasi struttura lipidica e porta alla ritenzione del colorante a lungo termine e alla fluorescenza stabile12. I coloranti PKH possono anche etichettare i veicoli elettrici, il che consente lo studio delle proprietà EV in vivo13. Molti altri coloranti sono stati utilizzati per osservare gli esosomi utilizzando la microscopia a fluorescenza e la citometria a flusso, compresi i coloranti per l'etichettatura lipidica14 e coloranti permeabili alle cellule come l'estere succinimidile carbossifluoresceina diacetato (CFDA-SE)15,16 e l'estere acetoximetile (AM) di calceina17.

Studi di crosstalk mediata da sEV tra diverse cellule del SNC hanno fornito importanti approfondimenti sulla patogenesi delle malattie neuroinfiammatorie e neurodegenerative18. Ad esempio, gli sEV dei neuroni possono diffondere peptidi beta-amiloidi e proteine tau fosforilate e aiutare nella patogenesi della malattia di Alzheimer19. Inoltre, gli EV derivati dagli eritrociti contengono grandi quantità di alfa-sinucleina e possono attraversare la barriera emato-encefalica e contribuire alla patologia del Parkinson20. La capacità dei sEV di attraversare le barriere fisiologiche21 e trasferire le loro biomolecole alle cellule bersaglio li rende strumenti convenienti per fornire farmaci terapeutici al SNC22.

La visualizzazione dell'assorbimento di sEV da parte di una miriade di cellule del SNC nel midollo spinale consentirà sia studi meccanicistici che la valutazione dei benefici terapeutici dei sEV somministrati esogenamente da varie fonti cellulari. Questo documento descrive la metodologia per etichettare i sEV derivati dai macrofagi e immaginare il loro assorbimento in vitro e in vivo nel midollo spinale lombare da parte di neuroni, microglia e astrociti per confermare qualitativamente la consegna di sEV mediante visualizzazione.

Protocollo

NOTA: Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con la Guida NIH per la cura e l'uso di animali da laboratorio e approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali del Drexel University College of Medicine. I topi CD-1 gravidi a tempo sono stati utilizzati per la coltura astrocitica e tutte le dighe sono state ricevute 15 giorni dopo l'impregnazione. I topi C57BL/6 di dieci-dodici settimane sono stati utilizzati per esperimenti di assorbimento in vivo.

1. Isolamento di sEV da cellule macrofagiche RAW 264.7

  1. Coltura RAW 264,7 cellule in palloni da 75 cm2 in mezzo impoverito di esosomi DMEM contenenti il 10% di siero bovino fetale impoverito di esosomi (FBS) e l'1% di penicillina-streptomicina (pen-streptococco) per 24-48 ore.
  2. Raccogliere 300 ml di mezzo condizionato e centrifugare a 300 × g per 10 minuti a 4 °C.
  3. Raccogliere il surnatante e la centrifuga a 2.000 × g per 20 minuti a 4 °C.
  4. Trasferire il surnatante in tubi centrifughi, centrifugare per 35 minuti a 12.000 × g a 4 °C.
  5. Raccogliere il surnatante e filtrare attraverso un filtro a siringa da 0,22 μm.
  6. Trasferire in tubi ultracentrifughi e centrifuga per 80 minuti a 110.000 × g a 4 °C.
  7. Conservare il surnatante (mezzo impoverito di esosomi), riesemere il pellet in 2 mL di 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e centrifugare per 1 ora a 110.000 × g a 4 °C.
  8. Rinsociemere il pellet in 100 μL di PBS per un'ulteriore caratterizzazione utilizzando l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) e la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) o nel tampone del saggio di radioimmunoprecipitazione (RIPA) per il western blotting.

2. Caratterizzazione dei sEV

  1. Analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA)
    NOTA: La distribuzione dimensionale e il numero/concentrazione di particelle dei sEV purificati dalle celle RAW 264.7 sono stati misurati da NTA.
    1. Diluire i sEV in PBS filtrati per ottenere 20-60 vescicole per campo visivo per un tracciamento ottimale.
    2. Introdurre il campione diluito in una cella di flusso utilizzando una pompa a siringa con una portata costante.
    3. Prendi 3-5 video di 30 s ciascuno. Impostare la velocità e il guadagno dell'otturatore e mettere a fuoco manualmente le impostazioni della fotocamera affinché il numero massimo di vescicole sia visibile e in grado di essere monitorato e analizzato.
    4. Avanza i campioni tra ogni registrazione per eseguire misurazioni di replica. Ottimizza le impostazioni di post-acquisizione NTA e mantieni costanti le impostazioni tra i campioni.
    5. Analizza ogni video utilizzando il software NTA per ottenere la dimensione media e la concentrazione delle vescicole.
    6. Eseguire tutte le misurazioni NTA con impostazioni di sistema identiche per coerenza.
  2. Macchia occidentale
    1. Quantificare le quantità totali di proteine in sEV, lisati cellulari e mezzi impoveriti di esosomi utilizzando un kit di analisi proteica seguendo le istruzioni del produttore.
    2. Per la preparazione del lisato cellulare, colturare le cellule RAW 264,7 in palloni da 75 cm2 fino all'80-90% di confluenti. Staccare le cellule con lo 0,25% di tripsina per 10-15 minuti, neutralizzare la tripsina con mezzi di coltura e pellettizzare le cellule ruotando a 400 × g per 5 minuti. Risuspendare le cellule in un terreno di crescita fresco.
    3. Contare le cellule usando un emocitometro e trasferire 1 × 106 cellule in un altro tubo. Lavare le cellule con PBS due volte utilizzando le stesse condizioni di centrifugazione di cui sopra e aggiungere 50 μL di tampone di lisi (tampone RIPA con cocktail inibitore della proteasi aggiunto) al pellet cellulare dal giro finale.
    4. Vortice le cellule e tenerle sul ghiaccio per 20 min. Sottoporre la miscela a centrifugazione a 10.000 × g per 30 minuti a 4 °C, raccogliere il surnatante (cioè il lisato) in tubi microcentrifuga freschi e conservare a -80 °C fino all'uso.
    5. Concentrare 2 mL di mezzi impoveriti di esosomi a 100 μL utilizzando filtri centrifughi a taglio di 3 kDa prima di quantificare la quantità di proteine. Mescolare i sEV con tampone di lisi in un rapporto 1: 1, vortice per 30 s e incubare sul ghiaccio per 15 minuti per quantificare la quantità di proteine.
    6. Mescolare quantità uguali di proteine (2 μg) dei sEV, del lisato cellulare RAW 264.7 e dei mezzi impoveriti di esosomi con tampone campione riducente.
    7. Denaturare i campioni a 95 °C per 5 minuti, tenerli sul ghiaccio per 5 minuti e ruotare per 2 minuti a 10.000 × g. Caricare i campioni su un gel proteico Tris-glicina al 12% ed eseguire il gel a 125 V per 45 minuti.
    8. Trasferire la proteina su una membrana di polivinilidene difluoruro (PVDF) a 25 V per 2 ore.
    9. Dopo il trasferimento, bloccare le membrane pvDF con tampone di blocco (vedere la tabella dei materiali)per 1 ora a temperatura ambiente.
    10. Incubare la macchia con anticorpi primari su uno shaker durante la notte a 4 °C.
      NOTA: Gli anticorpi primari utilizzati erano anti-CD81 (1:1.000), anti-alfa-1,3/1,6-mannosiltransferasi (ALG-2)-interazione proteina X (Alix) (1:1.000), anti-Calnexin (1:1.000) e anti-gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) (1:1.000).
    11. Lavare le macchie 3 x 15 minuti con 1x soluzione salina tamponata tris, 0,1% Tween 20 (TBST) e incubare a temperatura ambiente con anticorpi secondari coniugati IgG-rafano perossidasi (HRP) o anti-asino anti-coniglio IgG-HRP (1:10.000) per 1 ora sullo shaker.
    12. Lavare le macchie 3 x 15 minuti con 1x TBST e rilevare le proteine utilizzando un substrato HRP.
    13. Analizza le macchie migliorando la chemiluminescenza utilizzando un imager western blot.
  3. Microscopia elettronica a trasmissione (TEM)
    1. Correggere i sEV riconsostandoli in paraformaldeide al 2% (PFA) in tampone fosfato 0,1 M (PB); vortice per 2 x 15 s.
    2. Posizionare una goccia di 10 μL di sospensione sEV su parafilm pulito. Fai galleggiare la griglia del formvar rivestita in carbonio sulla goccia con il lato rivestito rivolto verso la sospensione. Lasciare assorbire le membrane per 20 minuti in ambiente asciutto.
    3. Posizionare le griglie (lato membrana verso il basso) su una goccia di PB per lavare per 3 x 2 min.
    4. Trasferire le griglie a 50 μL di glutaraldeide all'1% per 5 minuti.
    5. Lavare le griglie con 100 μL di acqua distillata per 8 x 2 min.
    6. Contrasta il campione posizionando le griglie su una goccia di acetato di uranile all'1% per 2 minuti.
    7. Incorporare il campione con 50 μL di acetato di uranile allo 0,2% con soluzione di metilcellulosa al 2% per 10 minuti su una palaccia di ghiaccio ricoperta di parafilm.
    8. Utilizzare anelli in acciaio inossidabile per tenere le griglie e rimuovere il fluido in eccesso con carta da filtro.
    9. Asciugare all'aria la griglia per 10 minuti mentre si è ancora sul loop.
    10. Osservare al microscopio elettronico a trasmissione a 80 kV.

3. Etichettatura dei sEV

  1. Diluire 20 μg di sEV in 1 mL di tampone diluente o lo stesso volume di PBS in 1 mL di tampone diluente per il controllo del colorante.
  2. Diluire 3 μL di colorante PKH67 o PKH26 in 1 mL di tampone diluente e miscelare mediante pipettaggio.
  3. Aggiungere il colorante PKH diluito ai sEV diluiti e mescolare mediante pipettaggio. Incubare per 5 minuti al buio a temperatura ambiente. Per un controllo del colorante, mescolare il colorante diluito con PBS diluito dal passaggio 3.1.
  4. Aggiungere 2 ml di albumina sierica bovina all'1% (BSA) in PBS al tubo con il colorante e la miscela sEV e al tubo di controllo del colorante per assorbire il colorante in eccesso.
  5. Centrifuga per 1 ora a 110.000 × g a 4 °C. Scartare il surnatante, risuscivare il pellet in 2 ml di PBS e centrifugare per 1 ora a 110.000 × g a 4 °C. Ripetere il lavaggio con PBS e risusediare i sEV etichettati o il controllo del colorante in un volume uguale di PBS.
  6. Quantificare la quantità di proteine totali con il metodo Bradford.

4. Assorbimento di sEV da parte delle cellule Neuro-2a

  1. Posizionare le coperture da 18 mm in una piastra a 12 pozzetti e la piastra 10 × 104 cellule Neuro-2a in ciascun pozzetti in un totale di 1 mL di mezzo DMEM completo contenente il 10% di FBS e l'1% di pen-strep.
  2. Cambiare il mezzo in mezzo impoverito di esosomi DMEM quando la confluenza cellulare è dell'80-90%. Aggiungere 1, 5 o 10 μg di sEV etichettati in ciascun pozzetto per 1, 4 e 24 ore per l'assorbimento dose-dipendente e tempo, oppure aggiungere un volume uguale di controllo del colorante.

5. Culture astrocitiche primarie

  1. Anestetizzare 4 cuccioli postnatali 4 giorni dopo la nascita inducendo ipotermia.
  2. Raccogli il cervello in una capsula di Petri da 60 mm contenente hank's Balanced Salt Solution (HBSS) ghiacciata integrata con acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineanesofonico (HEPES) da 10 mM.
  3. Sezionare entrambi i lobi corticali e rimuovere le meningi. Tritare i tessuti con una lama sterilizzata.
  4. Trasferire i tessuti in un tubo conico da 15 mL contenente tampone di dissociazione papaina/desossiribonucleasi I e incubare per 20 minuti a 37 °C. Vortice ogni 5 min.
    NOTA: Per 4 cortecce di topo, 9 mL di 7,5 U/mL di papaina in HBSS vengono attivati a 37 °C per almeno 30 minuti, filtrati attraverso un filtro a siringa da 0,22 μm e miscelati con desossiribonucleasi I ad una concentrazione finale di 0,1 mg/mL.
  5. Aspirare il surnatante e aggiungere 5 ml di DMEM completo per inattivare l'attività enzimatica. Triturare accuratamente per dissociare i tessuti con una pipetta sierologica di vetro da 5 ml e una pipetta Pasteur lucidata a fiamma.
  6. Passare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 40 μm e centrifugare le cellule a 250 × g per 5 minuti a 4 °C. Aspirare il mezzo e seminare le cellule in 10 ml di DMEM completo in un pallone da 75 cm2. Sostituire il mezzo surnatante con 15 ml di DMEM medio fresco 4 ore dopo la placcatura.
  7. Dopo 14 giorni in vitro,trasferire il pallone su uno shaker orbitale per staccare la microglia e gli oligodendrociti a 320 giri/min per 6 ore.
  8. Tripsinizzare gli astrociti rimanenti utilizzando 5 mL dell'enzima di dissociazione cellulare (Table of Materials) per 10 min a 37 °C. Aggiungere 5 mL di DMEM completo per inattivare l'azione enzimatica e pellettizzare le cellule a 250 × g per 5 min a 4 °C.
  9. Risuspendare le celle in DMEM completo. Seme 5 × 104 celle su 12 mm #1.5 coverslips in una piastra a 24 pozzetti.

6. Assorbimento di sEV da parte degli astrociti

  1. Quando gli astrociti raggiungono l'80-90% di confluenza, cambiare il mezzo in mezzo impoverito di esosomi DMEM.
  2. Aggiungere 1 μg di sEV non etichettati, un volume uguale di controllo del colorante o PBS alle cellule. Utilizzare le cellule per la colorazione 1 ora e 24 ore dopo il trattamento sEV.

7. Immunofluorescenza

  1. Risciacquare le cellule con PBS 3x e fissarle con il 4% di PFA in PB per 10 minuti a temperatura ambiente.
  2. Lavare le celle fisse 3 x 5 min con PB e permeabilizzarle utilizzando 0,1% Triton X-100 in PB per 10-15 min e lavare con PB 3 x 5 min.
  3. Bloccare le cellule con il 5% di siero di capra normale (NGS) in PB per 1 ora a temperatura ambiente.
  4. Incubare le cellule con anticorpi primari: proteina 2 associata a microtubuli (MAP2A, 1:500) per cellule Neuro-2a o proteina acida fibrillare gliale (GFAP, 1:500) per astrociti primari in NGS/PB fresco al 5% durante la notte a 4 °C con agitazione delicata.
  5. Lavare 3 x 10 minuti con PB e aggiungere anticorpi secondari coniugati con fluoroforo (Goat Anti-Mouse IgG1, Alexa Fluor 594; o Goat Anti-Mouse IgG H & L, Alexa Fluor 488) in 5% NGS e incubare per 2 ore a temperatura ambiente su un bilanciere.
  6. Lavare 3 x 10 min con PB e incubare con 1 μg/mL di macchia nucleare 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per 10 min a temperatura ambiente. Lavare nuovamente le celle 3 volte con PB.
  7. Montare i coperchi su diapositive #1 utilizzando un mezzo di montaggio antifade. Lasciarli asciugare per una notte al buio e conservare i vetrini preparati a 4 °C fino all'imaging al microscopio confocale.

8. Diffusione in vivo dei sEV

  1. Eseguire l'iniezione intratecale di 5 μg di sEV non etichettati o marcati sospenati in 10 μL di PBS, o di uguale volume (10 μL) di controllo del colorante (come preparato nel paragrafo 3) in topi C57BL/6.
  2. Dopo 6 e 18 ore dopo l'iniezione di sEV, anestetizzare profondamente i topi mediante iniezione intraperitoneale di 100 mg/kg di peso corporeo di ketamina e 10 mg/kg di peso corporeo di xilazina.
  3. Eseguire la perfusione intracardica di topi con soluzione salina allo 0,9% per scovare il sangue, seguita da PFA / PB al 4% ghiacciato appena fatto.
  4. Sezionare il midollo spinale e fissare in PFA/PB al 4% a 4 °C per 24 ore. Crioproteggere i tessuti in saccarosio al 30% in PB a 4 °C per 24 ore o fino a quando i tessuti affondano. Conservare i tessuti a 4 °C fino all'immunoistochimica.

9. Immunoistochimica

  1. Incorporare il midollo spinale L4-L5 nel composto O.C.T. Congelare su ghiaccio secco fino a completa solidificazione.
  2. Sezionare i tessuti a 30 μm (in sezione trasversale per il midollo spinale) usando un criostato e raccogliere le sezioni in una piastra a 24 pozzetti contenente PB. Lavare le sezioni 3 x 5 min con 0,3% Triton in PB.
  3. Blocca siti di legame non specifici con 5% NGS in 0,3% Triton/PB per 2 ore a temperatura ambiente.
  4. Anticorpi primari diluiti: Anti-MAP2A (1:500), GFAP (1:1.000), Iba1 per microglia (1:2.000) con 5% NGS in 0,3% Triton/PB, e incubare le sezioni durante la notte a 4 °C su uno shaker.
  5. Lavare le sezioni 3 x 5 min con lo 0,3% di Triton/PB e aggiungere anticorpi secondari (Donkey Anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488, 1:500, o Goat Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488, 1:500) al 5% NGS/PB per 2 ore a temperatura ambiente.
  6. Lavare 3 x 5 minuti con PB e incubare le sezioni in 1 μg/mL di DAPI per 10 minuti a temperatura ambiente. Lavare le sezioni 3 x 5 min con PB.
  7. Montare le sezioni su un vetrino adesivo pulito (Table of Materials) con un pennello fine al microscopio ottico.
  8. Bagnare il coperchio con il mezzo di montaggio. Curare durante la notte al buio a temperatura ambiente.
  9. Immagine al microscopio confocale con i rispettivi laser.

Risultati

Dopo l'isolamento dei sEV dai mezzi condizionati RAW 264.7 tramite centrifugazione, nta è stato utilizzato per determinare la concentrazione e la distribuzione dimensionale dei sEV purificati. La dimensione media media delle sEV derivate da RAW 264,7 era di 140 nm e la dimensione delle particelle di picco era di 121,8 nm, confermando che la maggior parte delle particelle rilevabili nella misurazione della diffusione della luce rientrava nell'intervallo di dimensioni degli esosomi o dei sEV a 50-150 nm (

Discussione

In questo protocollo, abbiamo mostrato l'etichettatura dei sEV con coloranti PKH e la visualizzazione del loro assorbimento nel midollo spinale. I coloranti fluorescenti lipofili PKH sono ampiamente utilizzati per l'etichettatura delle cellule mediante citometria a flusso e microscopia fluorescente3,5,6,12,24,25. A causa dell...

Divulgazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Riconoscimenti

Questo studio è stato supportato da sovvenzioni del NIH NINDS R01NS102836 e del Pennsylvania Department of Health Commonwealth Universal Research Enhancement (CURE) assegnato a Seena K. Ajit. Ringraziamo il Dr. Bradley Nash per la lettura critica del manoscritto.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filtersMilliporeSigmaZ677094
Anti-Alix AntibodyAbcamab1864291:1000
Anti-Calnexin AntibodyAbcamAb102861:1000
Anti-CD81 AntibodySanta Cruz Biotechnologysc-1660291:1000
Anti-GAPDH Monoclonal Antibody (14C10)Cell Signaling Technology21181:1000
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein AntibodySigma-AldrichMAB3601:500 for IF; 1:1000 for IHC
Anti-Iba1 AntibodyWako019-197411:2000
Anti-MAP2A AntibodySigma-AldrichMAB3781:500
Bovine Serum Albumin (BSA)VWR0332
Cell Strainer, 40 μmVWR15-1040-1
Centrifuge TubesThermo Scientific3118-005012,000 x g
Coverslip, 12-mm, #1.5Electron Microscopy Sciences72230-01
Coverslip, 18-mm, #1.5Electron Microscopy Sciences72222-01
DAPISigma-AldrichD9542-1MG1 µg/mL
DC Protein AssayBio-Rad500-0116
Deoxyribonuclease I (DNAse I)MilliporeSigmaD4513-1VL
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)Abcamab162841:10000
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488InvitrogenA-212061:500
Double Frosted Microscope Slides, #1Thermo Scientific12-552-5
DPBS without Calcium and MagnesiumCorning21-031-CV
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Corning10-013-CV
Exosome-Depleted Fetal Bovine SerumGibcoA27208-01
Fetal Bovine Serum (FBS)Corning35-011-CV
FluorChem M imaging systemProteinSimple
FV3000 Confocal MicroscopeOlympus
Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP)Abcamab67891:10000
Goat Anti-Mouse IgG H&L, Alexa Fluor 488InvitrogenA-110011:500
Goat Anti-Mouse IgG1, Alexa Fluor 594InvitrogenA-21125
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)VWR02-0121
HEPESGibco15630080
HRP SubstrateThermo Scientific34094
Intercept blocking buffer, TBSLI-COR Biosciences927-60001
Laemmli SDS Sample BufferAlfa AesarAAJ61337AC
Micro Cover Glass, #1VWR48404-454
Microm HM550Thermo Scientific
NanoSight NS300 systemMalvern Panalytical
NanoSight NTA 3.2 softwareMalvern Panalytical
Neuro-2a Cell LineATCCCCL-131
Normal Goat SerumVector LaboratoriesS-1000
O.C.T CompoundSakura Finetek4583
PapainWorthington Biochemical CorporationNC9597281
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences19210
Penicillin-StreptomycinGibco15140122
PKH26Sigma-AldrichMINI26-1KT
PKH67Sigma-AldrichMINI67-1KT
Protease Inhibitor CocktailThermo Scientific1862209
PVDF Transfer MembraneMDISVFX8302XXXX101
RAW 267.4 Cell LineATCCTIB-71
RIPA BufferSigma-AldrichR0278
Sodium ChlorideAMRESCO0241-2.5KG
Superfrost Plus Gold SlidesThermo Scientific15-188-48adhesive slides
T-75 FlasksCorning431464U
Tecnai 12 Digital Transmission Electron MicroscopeFEI Company
TEM GridsElectron Microscopy SciencesFSF300-cu
Tris-Glycine Protein Gel, 12%InvitrogenXP00120BOX
Tris-Glycine SDS Running BufferInvitrogenLC26755
Tris-Glycine Transfer BufferInvitrogenLC3675
TrypLE Expresscell dissociation enzyme
Triton X-100Acros Organics327371000
Trypsin, 0.25%Corning25-053-CL
Tween 20
Ultracentrifuge TubesBeckman344058110,000 x g

Riferimenti

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