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요약

우리는 PKH 염료로 대식세포 유래 작은 세포외 소포를 라벨과 시험관 내 및 척수에서 그들의 upup을 관찰하는 프로토콜을 기술합니다.

초록

작은 세포 외 소포 (sEV)는 모든 세포에 의해 분비되고 체액에 존재하는 50-150 nm 소포입니다. sEV는 RNA, 단백질 및 지질과 같은 생체 분자를 기증자에서 수용세포로 이송하여 세포 간의 주요 신호 중재자를 만듭니다. 중추 신경계 (CNS)에서 sEV는 신경 면역 상호 작용을 포함하여 세포 간 신호를 중재 할 수 있습니다. sEV 기능은 생체외 및 생체 내 모두 받는 사람 세포에서 표지된 sEV의 섭취량을 추적하여 연구할 수 있다. 이 논문은 PKH 멤브레인 염료를 사용하여 RAW 264.7 대식세포의 조건부 매체로부터 sEV의 라벨링을 설명합니다. 그것은 신경-2a 세포와 시험관내1 차 성상세포에 의해 여러 시간 지점에서 표지된 sEV의 다른 농도의 uptakes를 보여줍니다. 또한 마우스 척수 뉴런, 성상세포 및 공초점 현미경 검사법에 의해 시각화된 미세glia에서 내trathecally를 전달한 sEV의 섭취도 표시됩니다. 대표적인 결과는 척수로 성공적인 sEV 납품을 확인하는 것을 도울 수 있는 다른 세포에 의하여 sEV의 uptake에 있는 시간 의존적인 변이를 보여줍니다.

서문

작은 세포 외 소포 (sEV)는 나노 크기, 50-150 nm의 크기 범위와 멤브레인 소포입니다. 그(것)들은 다중 vesicular 바디 (MVBs)에서 유래하고 플라즈마 막과 MVB의 융합에 세포에서 풀어 놓입니다. sEV는 miRNAs, mRNA, 단백질 및 생리활성 지질을 포함하고, 이 분자는 세포 간 세포 통신의 형태로 세포 사이 옮겨질 것입니다. sEV는 다양한 내막 경로에 의해 수신자 세포에 의해 내부화될 수 있으며, 수신자 세포에 의한 sEV의 이러한 포획은 EV와 표적 세포1모두에 대한 표면 분자의 인식에 의해 중재된다.

sEV는 수용체 세포의 분자 및 현상 변화를 유발할 수 있는 능력, 치료제로서의 유용성, 화물 분자 또는 약리학제의 운반선으로서의 잠재력으로 인해 관심을 얻고 있습니다. 그들의 작은 크기 때문에, sEV의 화상 진찰 및 추적은 특히 생체 내 연구 및 임상 설정에 도전적일 수 있습니다. 따라서 생체 내 및 생체 내 및 생체 내 추적을 지원하기 위해 라벨 및 이미지 sEV를 표시하고 이미지 sEV를개발하는 많은 방법이 개발되었다.

sEV 생체 분포및 표적 세포 상호 작용을 연구하는 가장 일반적인 기술은 형광염염료 분자3,4,5,6,7로라벨을 붙이는 것을 포함한다. 전기 는 처음에 일반적으로 이미지 세포에 사용 된 세포막 염료로 표시 되었다. 이 형광 염료는 일반적으로 sEV에 관심있는 지질 이중 층 또는 단백질을 얼룩. 몇몇 지방성 염료는 디르 (1,1′-디옥타데딜-3,3,3′,3′-테트라메틸린도트리카르보시아노니 오오드), DiL (1, 1′-dioctadecyl-3, 3, 3′, 3′-테트라메틸 인도카르보시아닌 과염소산염), 및 DiD (1, 1′-디옥타데킬-3, 3, 3′, 3′, 3′-테트라메틸 인도카르보시야닌 4-클로로벤젠술포네이트 소금)8,9,101.

PKH67 및 PKH26과 같은 다른 지방성 염료는, 고형성 극지 헤드 그룹과 어떤 지질 구조로 쉽게 상호 작용하고 장기 염료 보존 및 안정적인 형광12로이어지는 긴 알리파성 탄화수소 꼬리를 갖는다. PKH 염료는 또한 EV 라벨을 지정할 수 있으며, 이는 생체 내에서EV 속성의 연구를 할 수 있습니다13. 다른 많은 염료는 형광 현미경 검사법과 유동 세포종을 사용하여 외종을 관찰하는 데 사용되어 왔으며, 여기에는 지질 라벨염료14 및 카박스시플루오레세인 디아세테이트 succinimidyl ester(CFDA-SE)15,16 및 칼세옥 아세틸(AM)

CNS에 있는 다른 세포 사이 sEV 매개 한 교차토크의 연구 결과는 신경 염증성 및 신경 퇴행성 질환의 병인에 중요한 통찰력을 제공했다18. 예를 들어, 뉴런으로부터의 sEV는 베타 아밀로이드 펩타이드와 인광타우 단백질을 퍼뜨리고알츠하이머병(19)의발병에 도움을 주어 질 수 있다. 추가적으로, 적혈구에서 파생된 전기는 많은 양의 알파-시뉴클레인을 함유하고 있으며 혈액-뇌 장벽을 넘어파킨슨병증(20)에기여할 수 있다. sEV의 능력은 생리적 장벽을교차하고 표적 세포에 자신의 생체 분자를 전송하는 그들에게 CNS22에치료 약물을 전달하는 편리한 도구를 만든다.

척수에 있는 무수한 CNS 세포에 의하여 sEV upup를 시각화하는 것은 기계학 연구 및 각종 세포 근원에서 외인성 관리한 sEV의 치료 이득의 평가를 둘 다 가능하게 할 것입니다. 이 논문은 대식세포에서 파생된 sEV를 라벨로 지정하고 생체외에서 의 기생을 이미지하고 뉴런, 마이크로글리아 및 성상세포에 의해 요추 척수에서 생체내로 분류하여 시각화에 의한 sEV 전달을 질적으로 확인하는 방법을 설명합니다.

프로토콜

참고: 모든 절차는 실험실 동물의 치료 및 사용에 대한 NIH 가이드를 준수하여 수행되었으며 드렉셀 대학 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 시간 임신 한 CD-1 마우스는 성상체 배양에 사용되었고, 모든 댐은 함침 후 15 일 수신되었다. 12주 된 C57BL/6 마우스는 생체 내 섭취 실험에 사용되었다.

1. RAW 264.7 대식세포로부터 의 대체 분리

  1. 배양 RAW 264.7 세포는 DMEM 엑소좀 고갈된 배지에서 75cm2 플라스크로 24-48h에 대해 10% 엑소좀 고갈된 태아소 혈청(FBS)과 1%의 페니실린-연쇄절제술(pen-strep)을 함유하고 있다.
  2. 4°C에서 10분 동안 300ml의 조건부 배지 및 원심분리기를 300× g에서 수집합니다.
  3. 4°C에서 20분 동안 2,000g× g에서 상피 및 원심분리기를 수집합니다.
  4. 상체를 원심분리기 튜브로 옮기고, 원심분리기는 4°C에서 12,000g에서 35분 동안 ×.
  5. 상체를 수집하고 0.22 μm 주사기 필터를 통해 필터링합니다.
  6. 4°C에서 110,× 000 g에서 80분 동안 초원심분리기 튜브 및 원심분리기로 이송합니다.
  7. 상체(exosome-고갈된 매체)를 저장하고, 1x 인산염 완충식식염(PBS)의 2mL로 펠릿을 재중단하고, 원심분리기는 4°C에서 110,000× g에서 1시간 동안 재차한다.
  8. 나노입자 추적 분석(NTA) 및 투과 전자 현미경검사(TEM) 또는 서부 블로팅을 위한 방사성 면역 침전 분석(RIPA) 버퍼를 사용하여 추가 특성화를 위해 PBS의 100 μL에서 펠릿을 재중단한다.

2. sEV의 특성화

  1. 나노입자 추적 분석(NTA)
    참고: RAW 264.7 셀로부터의 정제된 세프의 크기 분포 및 입자 개수/농도는 NTA에 의해 측정되었다.
    1. 최적의 추적을 위해 시야별 20-60 개의 소포를 얻기 위해 필터링 된 PBS의 sEV를 희석합니다.
    2. 일정한 유량의 주사기 펌프를 사용하여 희석된 샘플을 유량 셀에 도입합니다.
    3. 30 s의 3-5 동영상을 촬영합니다. 셔터 속도와 게인을 설정하고 카메라 설정을 수동으로 집중하여 최대 소포 수를 표시하고 추적 및 분석할 수 있습니다.
    4. 복제 측정을 수행하기 위해 각 기록 간에 샘플을 사전합니다. NTA 인수 후 설정을 최적화하고 샘플 간에 설정을 일정하게 유지합니다.
    5. NTA 소프트웨어를 사용하여 각 비디오를 분석하여 소포의 평균 크기와 농도를 얻습니다.
    6. 일관성을 위해 동일한 시스템 설정으로 모든 NTA 측정을 수행합니다.
  2. 웨스턴 블롯
    1. 제조 업체의 지시에 따라 단백질 분석 키트를 사용 하 여 sEV, 세포 용액 및 엑소좀 고갈 된 매체에서 총 단백질 양을 정량화.
    2. 세포 용해 제제의 경우, 80-90%까지 75cm2 플라스크로 RAW 264.7 세포를 배양한다. 10-15분 동안 0.25%의 트립신으로 세포를 분리하고, 배양 배지로 트립신을 중화시키고, 5분 × 동안 400 g에서 회전하여 세포를 펠릿한다. 신선한 성장 배지에서 세포를 다시 중단.
    3. 혈전계를 사용하여 세포를 계산하고 1 × 106 세포를 다른 튜브로 옮길 수 있습니다. 위와 동일한 원심분리 조건을 사용하여 PBS로 세포를 두 번 세척하고 최종 스핀에서 셀 펠릿에 50 μL의 용해 완충제(protease 억제제 칵테일을 첨가한 RIPA 버퍼)를 추가합니다.
    4. 세포를 소용돌이치며 20분 동안 얼음 위에 보관하십시오. 4°C에서 30분 동안 10,000 ×g의 원심분리로 혼합물을 주체하고, 신선한 미세원심분리기 튜브에서 상체(즉, lysate)를 수집하고, 사용할 때까지 -80°C에서 보관한다.
    5. 단백질의 양을 정량화하기 전에 3 kDa-컷오프 원심 필터를 사용하여 100 μL에 엑소솜 고갈 된 매체의 2 mL을 농축한다. sEV를 1:1 비율로 혼합하고, 30초동안 소용돌이를 만들고, 15분 동안 얼음에 배양하여 단백질의 양을 정량화합니다.
    6. sEV의 동일한 양의 단백질(2 μg), RAW 264.7 셀 리세이트 및 외성 고갈 된 매체를 샘플 버퍼를 감소시키는 혼합합니다.
    7. 샘플을 95°C에서 5분 동안 분해하고 5분 동안 얼음 위에 보관하고 10,000 ×g에서 2분 동안 회전합니다. 샘플을 12% 트리글리신 단백질 젤에 적재하고 젤을 125 V에서 45분 동안 실행합니다.
    8. 단백질을 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인에 25 V에서 2시간 동안 전달한다.
    9. 이송 후, 실온에서 1h에 대한 차단 버퍼 (재료의 테이블참조)와 PVDF 멤브레인을 차단합니다.
    10. 4°C에서 하룻밤 사이에 셰이커에 1차 항체로 블롯을 배양한다.
      참고: 사용된 1차 항체는 항 CD81(1:1,000), 항알파-1,3/1,6-mannosyltransferase (ALG-2)-상호작용 단백질 X(Alix) (Alix) (Alix) (1:1,000), 칼넥신 방지(1:1,000), 및 안티 글리세랄데히드 3-인산염 탈수소효소(GAPDH) (1:1,000).
    11. 1x 트라이버퍼식 식염수, 0.1% 트웬 20(TBST)으로 블로트 3 x 15분 세척, 염소 안티마우스 IgG-고추냉이 과로시다제(HRP) 또는 당나귀 안티래빗 IgG-HRP-컨쥬게이드 이차 항체(1:10,000 h)로 실온에서 배양한다.
    12. 1x TBST로 3 x 15분 동안 블롯을 세척하고 HRP 기판을 사용하여 단백질을 감지합니다.
    13. 웨스턴 블롯 이미저를 사용하여 향상된 화학 발광을 사용하여 얼룩을 분석합니다.
  3. 투과 전자 현미경 검사법 (TEM)
    1. 0.1 M 인산염 버퍼(PB)에서 2% 파라포름알데히드(PFA)로 재보설하여 sEV를 수정합니다. 2 x 15 s용 소용돌이.
    2. 깨끗한 파라필름에 10 μL의 sEV 서스펜션을 놓습니다. 카본 코팅 폼바 그리드를 서스펜션을 향한 코팅된 면을 플로팅합니다. 마른 환경에서 멤브레인을 20 분 동안 흡수하십시오.
    3. 그리드(멤브레인 사이드 다운)를 PB 한 방울에 놓고 3 x 2 분 동안 세척하십시오.
    4. 그리드를 5분 동안 1% 글루타랄데히드의 50 μL로 전송합니다.
    5. 8 x 2 분 동안 증류수 100 μL로 그리드를 세척하십시오.
    6. 2 분 동안 1 % uranyl 아세테이트의 드롭에 그리드를 배치하여 샘플을 대조.
    7. 시료를 0.2%의 50 μL에 2% 메틸셀룰로오스 용액으로 파라필름으로 덮인 얼음 접시에 10분 동안 포함시합니다.
    8. 스테인레스 스틸 루프를 사용하여 그리드를 유지하고 필터 용지로 과도한 유체를 제거합니다.
    9. 루프에 있는 동안 그리드를 10분 동안 공기 건조시합니다.
    10. 80 kV에서 전송 전자 현미경으로 관찰하십시오.

3. sEV 라벨링

  1. 염료 제어를 위한 희석완충액 1mL 또는 동일한 PBS 부피1mL에 20 μg의 sEV를 희석시 희석한다.
  2. 희석 완충제의 1mL에 PKH67 또는 PKH26 염료3μL을 희석하고 파이펫팅하여 혼합한다.
  3. 희석된 PKH 염료를 희석된 SEV에 넣고 파이펫팅하여 섞습니다. 실온에서 어둠 속에서 5 분 동안 배양하십시오. 염료 제어를 위해, 3.1 단계에서 희석 된 PBS와 희석 된 염료를 혼합합니다.
  4. PBS에 1% 소 세럼 알부민(BSA)의 2mL을 첨가하여 염료와 sEV 믹스를 튜브에 넣고 염료를 흡수한다.
  5. 4°C에서 110,000 × g에서 1h의 원심분리기. 상체를 버리고, PBS의 2mL에서 펠릿을 재차, 원심분리기는 4°C에서 110,000 × g에서 1h로 재차한다. PBS로 세척을 반복하고 표지된 SEV 또는 염료 제어를 동일한 볼륨으로 복리용합니다.
  6. 브래드포드 방법에 의한 총 단백질의 양을 정량화한다.

4. 신경-2a 세포에 의한 sEV 섭취

  1. 12웰 플레이트에 18mm 커버립을 놓고 10개의 × 104 Neuro-2a 세포를 10% FBS 및 1% 펜 스트렙을 함유한 완전한 DMEM 배지 1mL의 총 1mL에 배치합니다.
  2. 세포 수렴성이 80-90%인 경우 배지를 DMEM 엑소좀 고갈된 매체로 변경한다. 1, 5 또는 10 μg의 라벨이 붙은 sEV를 각 웰에 1, 4 및 24h에 추가하여 용량 및 시간 의존적 섭취를 하거나 동일한 양의 염료 제어를 추가합니다.

5. 초등회 성상세포 문화

  1. 저체온증을 유도하여 출생 4 일 후에 출생 후 새끼 4개 마취.
  2. 10mM 4-(2-하이드록세틸)-1-파이프라진에탄황포닉산(HEPES)으로 보충된 얼음-차가운 행크의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)을 함유한 60mm 페트리 접시에서 뇌를 수집합니다.
  3. 피질 엽을 모두 해부하고 수막을 제거합니다. 멸균 된 블레이드로 조직을 다진다.
  4. 조직을 파충/데옥시리보누벨리스 I 해리 버퍼를 포함하는 15mL 원추형 튜브로 이송하고 37°C에서 20분 동안 배양한다. 5분마다 소용돌이치기.
    참고: 4개의 마우스 코르티제의 경우, HBSS의 7.5 U/mL 파파인 9mL이 37°C에서 30분 이상 활성화되고, 0.22 μm 주사기 필터를 통해 여과하고, 데시리보누벨리스 I와 혼합하여 0.1 mg/mL의 최종 농도로 혼합한다.
  5. 수퍼내티츠를 흡인시키고 완전한 DMEM 5mL를 추가하여 효소 활성을 비활성화합니다. 5mL 유리 세로지컬 파이펫과 화염 광택 파스퇴 파이펫으로 조직을 분리하는 것을 조심스럽게 세심하게 세심하게 합니다.
  6. 40 μm 세포 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 통과하고 4 °C에서 5 분 동안 250 × g에서 세포를 원심 분리합니다. 75cm2 플라스크에서 전체 DMEM의 10mL에서 배지를 흡인하고 세포를 시드한다. 도금 후 4h의 신선한 DMEM 배지 15mL로 상체 매체를 교체하십시오.
  7. 시험관에서14 일 후, 6 시간 동안 320 rpm에서 마이크로글리아와 올리고덴드로키트를 분리하기 위해 플라스크를 궤도 셰이커로 옮다.
  8. 37°C에서 10분 동안 세포 해리효소(재료 표)의5mL를 사용하여 나머지 성상세포를 트립시션한다. 완전한 DMEM 5mL을 추가하여 효소 작용을 비활성화하고 4 °C에서 5 분 동안 250 × g에서 세포를 펠릿하십시오.
  9. 전체 DMEM에서 셀을 다시 일시 중지합니다. 씨앗 5 × 104 셀에 12 mm #1.5 커버립 24 웰 플레이트에.

6. 성상세포에 의한 sEV 섭취

  1. 성상 세포가 80-90 %의 합류에 도달하면 매체를 DMEM 엑소솜 고갈 매체로 변경합니다.
  2. 레이블이 지정되지 않은 레이블이 없는 sEV 1μg, 동일한 양의 염료 제어 또는 PBS를 셀에 추가합니다. sEV 치료 후 1h 및 24 h염색세포를 사용하십시오.

7. 면역형광

  1. PBS 3x로 세포를 헹구고 실온에서 10 분 동안 PB에서 4 % PFA로 고정하십시오.
  2. 고정셀을 PB로 3 x 5분 세척하고 PB에서 0.1% 트리톤 X-100을 사용하여 10-15분 동안 세척하고 PB 3 x 5분으로 세척합니다.
  3. 실온에서 1시간 동안 PB에서 5% 정상 염소 혈청(NGS)으로 세포를 차단합니다.
  4. 1 차적인 항체로 세포를 배양: microtubule 관련 단백질 2 (MAP2A, 1:500) 신경-2a 세포 또는 신경교낭 산성 단백질 (GFAP, 1:500) 신선한 5% NGS/PB 에 대한 신선한 5% NGS/PB 는 부드러운 흔들림으로 4°C에서 하룻밤 사이에.
  5. PB로 3 x 10 분 세척하고 플루오로포레 접합 보조 항체 (염소 안티 마우스 IgG1, 알렉사 플루어 594; 또는 염소 안티 마우스 IgG H&L, 알렉사 플루어 488)를 5 % NGS에 추가하고 로커의 실온에서 2 시간 동안 배양하십시오.
  6. PB로 3 x 10분 세척하고 핵 얼룩 4',6-디아미드노-2-페닐린돌(DAPI)의 1μg/mL로 실온에서 10분 동안 배양하십시오. PB로 셀을 다시 3배 다시 세척합니다.
  7. 페이드 장착 방지 매체를 사용하여 #1 슬라이드에 커버립을 장착합니다. 어둠 속에서 밤새 건조하고, 공초점 현미경에 이미징 될 때까지 4 °C에서 준비 된 유리 슬라이드를 저장합니다.

8. sEV의 생체 내 섭취

  1. 표지되지 않은 또는 표지된 sEV 5μg의 인트라테칼 주입을 PBS의 10 μL로 재장매하거나, 동일한 부피(10 μL)의 염료 제어(섹션 3에서 제조됨)를 C57BL/6 마우스로 주입한다.
  2. 후 6 및 18 sEV의 후 주입, 깊이 케타민의 100 mg/kg 체중의 내 역류 주사와 자일라진의 10 mg/kg 체중에 의해 마우스를 마취.
  3. 0.9% 식염수로 생쥐의 심내 복혈을 수행하여 혈액을 씻어내고, 갓 만든 얼음 차가운 4% PFA/PB가 그 뒤를 이습니다.
  4. 척수를 해부하고 24 시간 동안 4 ° C에서 4 % PFA / PB로 수정하십시오. Cryo는 24 시간 동안 또는 조직이 가라 앉을 때까지 PB에서 30 % 자당에서 조직을 보호합니다. 면역 조직 화학까지 4 °C에서 조직을 저장합니다.

9. 면역 작용화학

  1. O.C.T 화합물에 L4-L5 척수를 포함. 완전히 고화 될 때까지 드라이 아이스에 동결.
  2. 저온을 사용하여 30 μm(척수의 단면)에서 조직을 섹션화하고 PB를 포함하는 24웰 플레이트에서 단면을 수집합니다. PB에서 0.3 % 트리톤으로 섹션 3 x 5 분 세척하십시오.
  3. 실온에서 2시간 동안 0.3% Triton/PB에서 5% NGS로 비특이적 결합 부위를 차단합니다.
  4. 희석 1차 항체: 항 MAP2A(1:500), GFAP(1:1,000), 마이크로글리아용 이바1(1:2,000), 0.3% 트리톤/PB에서 5% NGS를, 셰이커에 4°C로 하룻밤 동안 배양한다.
  5. 섹션 3 x 5 분 0.3% 트리톤/PB로 세척하고, 실온에서 2시간 동안 5% NGS/PB에 이차 항체(당나귀 안티래빗 IgG 알렉사 플루어 488, 1:500 또는 염소 안티 마우스 IgG 알렉사 플루어 488, 1:500)를 추가합니다.
  6. PB로 3 x 5분 세척하고 실온에서 10분 동안 DAPI의 1 μg/mL로 섹션을 배양합니다. PB로 섹션 3 x 5 분 세척합니다.
  7. 깨끗한 접착제 슬라이드(재료 테이블)에섹션을 마운트하고 가벼운 현미경 아래에 미세 한 페인트 브러시를 장착합니다.
  8. 장착 매체로 커버슬립을 적시다. 실온에서 어둠 속에서 하룻밤 을 치료하십시오.
  9. 각각의 레이저를 가진 공초점 현미경의 밑에 심상.

결과

원심분리를 통해 RAW 264.7 컨디셔닝 된 매체로부터 sEV를 분리한 후, NTA는 정제된 세프의 농도 및 크기 분포를 결정하는 데 사용되었다. RAW 264.7 유래 sEV의 평균 평균 크기는 140nm이고 피크 입자 크기는 121.8nm였으며, 빛 산란 측정에서 대부분의 검출 가능한 입자가 50-150 nm(그림1A)에서엑소좀 또는 sEV의 크기 범위 내에 떨어졌는 것을 확인하였다. 세포 외 소포 2018 (MISEV2018)

토론

이 프로토콜에서, 우리는 PKH 염료와 sEV의 라벨링과 척수에 그들의 섭취량의 시각화를 보여주었습니다. PKH 리포필릭 형광염은 세포측정 및형광 현미경검사3,5,6,12,24,25를유동하여 세포 라벨링에 널리 사용된다. 상대적으로 긴 반감기 와 낮은 세포 독...

공개

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

감사의 말

이 연구는 NIH NINDS R01NS102836및 펜실베니아 보건부 유니버설 연구 강화(CURE)의 보조금에 의해 지원되었으며, 시나 K. 아지트에게 수여되었습니다. 우리는 원고의 비판적 독서에 대한 박사 브래들리 내쉬 에게 감사드립니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filtersMilliporeSigmaZ677094
Anti-Alix AntibodyAbcamab1864291:1000
Anti-Calnexin AntibodyAbcamAb102861:1000
Anti-CD81 AntibodySanta Cruz Biotechnologysc-1660291:1000
Anti-GAPDH Monoclonal Antibody (14C10)Cell Signaling Technology21181:1000
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein AntibodySigma-AldrichMAB3601:500 for IF; 1:1000 for IHC
Anti-Iba1 AntibodyWako019-197411:2000
Anti-MAP2A AntibodySigma-AldrichMAB3781:500
Bovine Serum Albumin (BSA)VWR0332
Cell Strainer, 40 μmVWR15-1040-1
Centrifuge TubesThermo Scientific3118-005012,000 x g
Coverslip, 12-mm, #1.5Electron Microscopy Sciences72230-01
Coverslip, 18-mm, #1.5Electron Microscopy Sciences72222-01
DAPISigma-AldrichD9542-1MG1 µg/mL
DC Protein AssayBio-Rad500-0116
Deoxyribonuclease I (DNAse I)MilliporeSigmaD4513-1VL
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)Abcamab162841:10000
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488InvitrogenA-212061:500
Double Frosted Microscope Slides, #1Thermo Scientific12-552-5
DPBS without Calcium and MagnesiumCorning21-031-CV
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Corning10-013-CV
Exosome-Depleted Fetal Bovine SerumGibcoA27208-01
Fetal Bovine Serum (FBS)Corning35-011-CV
FluorChem M imaging systemProteinSimple
FV3000 Confocal MicroscopeOlympus
Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP)Abcamab67891:10000
Goat Anti-Mouse IgG H&L, Alexa Fluor 488InvitrogenA-110011:500
Goat Anti-Mouse IgG1, Alexa Fluor 594InvitrogenA-21125
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)VWR02-0121
HEPESGibco15630080
HRP SubstrateThermo Scientific34094
Intercept blocking buffer, TBSLI-COR Biosciences927-60001
Laemmli SDS Sample BufferAlfa AesarAAJ61337AC
Micro Cover Glass, #1VWR48404-454
Microm HM550Thermo Scientific
NanoSight NS300 systemMalvern Panalytical
NanoSight NTA 3.2 softwareMalvern Panalytical
Neuro-2a Cell LineATCCCCL-131
Normal Goat SerumVector LaboratoriesS-1000
O.C.T CompoundSakura Finetek4583
PapainWorthington Biochemical CorporationNC9597281
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences19210
Penicillin-StreptomycinGibco15140122
PKH26Sigma-AldrichMINI26-1KT
PKH67Sigma-AldrichMINI67-1KT
Protease Inhibitor CocktailThermo Scientific1862209
PVDF Transfer MembraneMDISVFX8302XXXX101
RAW 267.4 Cell LineATCCTIB-71
RIPA BufferSigma-AldrichR0278
Sodium ChlorideAMRESCO0241-2.5KG
Superfrost Plus Gold SlidesThermo Scientific15-188-48adhesive slides
T-75 FlasksCorning431464U
Tecnai 12 Digital Transmission Electron MicroscopeFEI Company
TEM GridsElectron Microscopy SciencesFSF300-cu
Tris-Glycine Protein Gel, 12%InvitrogenXP00120BOX
Tris-Glycine SDS Running BufferInvitrogenLC26755
Tris-Glycine Transfer BufferInvitrogenLC3675
TrypLE Expresscell dissociation enzyme
Triton X-100Acros Organics327371000
Trypsin, 0.25%Corning25-053-CL
Tween 20
Ultracentrifuge TubesBeckman344058110,000 x g

참고문헌

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