用于质谱分析的最佳切割温度化合物中嵌入的人组织制备

摘要

鞘脂是生物活性代谢物，在人类疾病中具有公认的作用。用质谱法表征组织改变可以揭示疾病病因学中的作用或确定治疗靶点。然而，用于生物储存库中冷冻保存的OCT化合物会干扰质谱分析。我们概述了使用LC-ESI-MS / MS分析嵌入OCT的人体组织中鞘脂的方法。

摘要

鞘脂是在人体新陈代谢和疾病中具有明确作用的细胞成分。质谱可用于确定鞘脂在疾病中是否改变，并研究鞘脂是否可以在临床上靶向。然而，直接从手术室获取组织的适当把握度的前瞻性研究可能非常耗时，并且在技术、后勤和行政上具有挑战性。相比之下，回顾性研究可以利用组织生物储存库中已经存在的冷冻保存的人类标本，通常数量很大。从生物储存库采购组织的其他优点包括访问与组织标本相关的信息，包括组织学、病理学以及在某些情况下的临床病理学变量，所有这些都可用于检查与脂质组学数据的相关性。然而，与冷冻保存和质谱中使用的最佳切割温度化合物（OCT）不相容相关的技术限制是脂质分析的技术障碍。然而，我们之前已经证明，OCT可以通过洗涤和离心的循环轻松地从人类生物储存库标本中去除，而不会改变其鞘脂含量。我们之前还确定，在OCT中冷冻保存的人体组织中的鞘脂可以稳定长达16年。在本报告中，我们概述了分析嵌入OCT的人组织标本中鞘脂的步骤和工作流程，包括洗涤组织，称量组织以进行数据归一化，脂质提取，制备用于液相色谱电喷雾电离串联质谱（LC-ESI-MS / MS）分析的样品，质谱数据集成，数据归一化和数据分析。

引言

鞘脂是生物活性代谢物，以其在人体代谢^{和疾病中的作用}而闻名1^，2。它们调节复杂的细胞过程，如细胞迁移、细胞存活和死亡、细胞运动、囊泡运输、细胞侵袭和转移、血管生成以及细胞因子的产生¹，²，³，⁴，⁵，⁶，⁷，^8，9.鞘脂代谢调节的缺陷有助于癌症的发生和进展，决定癌症的侵袭性，以及癌症如何^{对治疗产生}反应和耐药性3^，10。因此，由于这些对疾病病因的广泛影响，能够精确确定疾病特异性鞘脂改变的分析方法是重要的工具。质谱（MS）是分析鞘脂改变的最准确和可靠的方法。

可用于分析鞘脂改变的人类标本可以从手术室前瞻性地获得，也可以从组织生物储存库中回顾性地获得。来自手术的新鲜组织是有利的，因为它们可以通过MS或其他分析方法直接分析。然而，前瞻性地获取组织存在行政、技术和后勤障碍，收集足够的标本以达到统计能力可能具有挑战性。从生物储存库获取组织是有利的，因为它们可以回顾性地大量获取，并且生物储存库确认组织学和病理学，使用标准操作程序低温保存和储存组织，并且可以提供可用于相关性分析的临床病理学数据。然而，为了保留分子和结构特征，生物储存库可以通过将组织嵌入最佳切割温度 （OCT） 化合物来冷冻保存组织，我们已经证明这会干扰数据归一化测定和通过液相色谱电喷雾串联质谱 （LC-ESI-MS/MS） 对鞘脂的定量¹¹.还表明，聚乙烯醇和聚乙二醇（OCT化合物中的主要成分）在其他MS分析平台中导致离子抑制¹²，¹³，^14，15。因此，在通过MS进行鞘脂组学分析之前，必须从组织中去除OCT化合物。

在之前的报告中，我们验证了从人类标本中去除OCT化合物的方案，用于LC-ESI-MS/MS分析¹¹ ，以及用于称量组织以进行数据归一化的方法¹¹。在这里，我们详细介绍了鞘脂组OCT化合物去除方案（sOCTrP）的步骤，并显示了来自人肺腺癌肿瘤和正常邻近未受累组织的代表性数据。

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研究方案

根据内部审查委员会（IRB）批准的协议（#HM2471），从弗吉尼亚联邦大学（VCU）组织和数据采集和分析核心获得去识别的人肺组织。使用小鼠研究和收获小鼠组织得到了VCU机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 材料准备

注意:这些步骤应在纸巾清洗前一天进行。

1. 对 1.5 mL 聚丙烯离心管进行预标记和称量，并为第二天处理的每个样品提供简洁明了的标识符代码。使用耐化学腐蚀的永久性标记（见 材料表），在反复的管处理下不会褪色。
2. 打开电子电子表格，并用以下列标题标记连续的列:试管标识符 （ID）、单独试管、带组织的试管和总组织。输入将处理到标有试管 ID 的列中的试管标识符。
3. 预先校准分析秤并将其归零。将干净的 10 mL 锥形瓶放在天平板的中心（培养瓶将充当试管支架）。关闭称量室门，用烧瓶去皮秤。
4. 称取 1.5 mL 离心管。小心地将试管放入烧瓶中并关闭称量室门。让重量稳定并单独记录标记管中的重量。
   注意:称量试管时避免移动 10 mL 锥形瓶。如果烧瓶被移动，将烧瓶重新居中并重新去皮天平。将封闭的管子放在架子上并存放直到需要为止。
5. 在 13 x 100 mm 螺旋盖玻璃管和盖子上预先贴上标识符代码，并用 2 mL LC-MS 级甲醇填充。将它们放在管架中，盖上管子，并将它们存放在冰箱（4°C）中直至使用。
   注意:使用瓶口溶剂分配器（见 材料表）。如果没有，请使用玻璃移液器，以避免在分配有机溶剂时使用塑料。
6. 预先标记 13 x 100 mm 玻璃试管。盖上并在室温下储存试管。
7. 带有标识符代码的预标记自动注射器小瓶。盖上并将自动注射器小瓶存放在室温下直至使用。
8. 准备纸巾干燥灯芯。
   1. 首先将手术剪刀浸入LC-MS级甲醇中5分钟，然后用干净的实验室级纸巾擦拭。
   2. 使用无粉手套，旋转实验室级纸巾的末端（见 材料表），直到形成细锥形的30-40毫米灯芯。
   3. 使用甲醇清洁的剪刀，剪掉厚端的灯芯。将灯芯放入干净的纸板箱中。使芯的数量是处理所有样品所需的两倍。
9. 准备缩短的 1 mL 移液器吸头。使用甲醇清洁的手术剪刀，从 1 mL 移液器吸头的尖端切下 4-5 mm，然后将吸头放回吸头支架中。准备的吸头数量是要处理的样品的两倍。
   注意:这些将用于从管中取出洗涤过的纸巾。请勿触摸尖端的末端。
10. 预冷分子生物学级磷酸盐缓冲盐水（PBS）至4°C（0.5L就足够了）。这将用于检索标本。对于将要处理的每个样品，预冷（4°C）60 mL超纯去离子水。
11. 准备质谱内标。将以下脂质溶解在乙醇中:甲醇:水（7:2:1;v/v/v），浓度为25 nmol / mL:d17:1-鞘氨醇，（2S，3R，4E）-2-氨基十七烷-4-烯-1，3-二醇;D17:1-鞘氨醇-1-磷酸，十七烷-4-烯嘧啶-1-磷酸;C12-神经酰胺（d18:1/C12:0）， N-十二烷酰基-4-烯吩;C12-鞘磷脂（d18:1/C12:0）， N-十二烷基-鞘-4-烯-1-磷酸胆碱;C12-葡萄糖神经酰胺（d18:1/C12:0）， N-十二烷基-1-β-葡萄糖基-4-烯;C12-乳糖神经酰胺（d18:1/C12:0），N-（十二烷基）-1-β-乳糖基-4-烯。

2. 纸巾清洗

注意:提前一天完成第 1 节中的所有步骤，熟练的研究人员每天最多可以处理 40 个样品，新手每天可以处理 ~10-15 个样品。清晨开始，在完成第 2.1-3.8 节中的所有步骤之前不要停止。

1. 在处理组织当天，通过配备涡流器、充满电的血清移液器和冰盘来准备生物安全柜工作区。对于本节中的所有步骤，请穿戴适当的个人防护用品，包括实验室外套、双层手套和防护眼镜。注意:人体组织和体液应被视为生物危害性材料并进行处理。
2. 预冷（4°C）摆动桶离心机，容纳15 mL锥形离心管所需的任何适配器以及离心机生物防护盖。预冷（4°C）能够容纳1.5 mL离心管的固定角度离心机。
3. 如果未将组织等分到15 mL聚丙烯离心管中，请使用甲醇清洁刮刀（对每个新组织样品清洁）将其转移到预先标记的15 mL聚丙烯管中。也标记 15 mL 盖子。
   1. 将能够容纳 15 mL 离心管的管架放入冰盘中，并在托盘中装满冰块。通过将当天将要处理的组织放在冰上的架子上来解冻它们。
      注意:应从生物储存库中请求至少 3-4 mg 的组织进行处理，因为之前已经表明，在这些重量下组织洗涤和称量方案准确可靠¹¹.
4. 将装有样品的冰盘移至生物安全柜中。
5. 如下所述执行三个sOCTrP循环¹¹ （即执行步骤2.5.1-2.5.5三次）。
   1. 向每个试管中加入 10 mL 冰冷的超纯去离子水，并盖紧。让试管孵育10分钟。
   2. 剧烈涡旋每个管10-20秒或直到沉积在管壁上的所有组织或组织颗粒完全重新悬浮。
      注意:在sOCTrP循环2-3中，将沉淀重悬至关重要，以便将沉淀中的任何OCT稀释到洗涤溶液中。
   3. 将试管转移到预冷（4°C）水平桶离心机中。在4°C下以4，000-5，000× g 离心样品10分钟。
      注意:通过用生物防护盖密封离心机载体，避免产生和暴露于离心过程中产生的生物危害性气溶胶（参见 材料表）。
   4. 从离心机中取出样品并转移到冰盘中。将托盘放入生物安全柜中并打开试管盖。保存大写字母。
   5. 小心地吸出洗涤液。通过在管中留下~0.5mL的上清液来避免吸出沉淀中的组织材料。盖上管子，并通过将标记的盖子与管子匹配来避免交叉污染。
      注意:步骤2.5.5中的洗涤溶液（上清液）是生物危害性材料;按照适用于人类来源标本的生物安全准则进行处理和处置。

3. 纸巾称量（用于数据归一化）

1. 在最后一个sOCTrP洗涤循环后，小心吸出大部分洗涤溶液，但避免干扰沉淀。将~0.5mL洗涤溶液留在管中。
2. 使用缩短的移液器吸头（在步骤1.9中制备），吸取500μL冰冷的PBS并将其添加到管中。
   1. 使用相同的尖端，轻轻重悬沉淀并取出所有组织。避免湍流移液，通过粘附在管和移液器吸头壁上来减少组织损失。
3. 将重悬的组织添加到相应的预标记和预称重的 1.5 mL 离心管中，并将管放在冰上。对数据集中的所有组织重复此操作。
4. 将1.5mL管放入预冷离心机中，并以7，000× g 沉淀组织5-7分钟和4°C。
   1. 取回试管并小心地吸出尽可能多的PBS，而不会干扰颗粒。将管子放回冰上。
5. 以7，000 x g 离心管再离心3分钟，以确保组织充分沉淀。将试管转移到冰上。
   注意:额外的离心步骤对于防止在去除所有洗涤溶液和芯吸时组织损失很重要。如果处理超过五个样品，则在每处理第五个样品后重复3分钟，7，000× g 离心步骤，以确保组织保持沉淀。
6. 使用步骤1.8中制备的灯芯，轻轻除去任何剩余的洗涤溶液。对每个样品使用干净的灯芯。用灯芯轻轻轻拍纸巾是可以接受的，这将有助于去除大部分洗涤液，但避免因粘附在灯芯上而丢失任何纸巾。关闭管子并将其放在冰上。
7. 在最近校准、去皮和归零的分析天平中称量每个试管。
   1. 将每个试管放入玻璃锥形瓶中并关闭腔室门。当重量稳定下来时，将其记录在标有带组织的管子的电子电子表格列中。
   2. 称重后，将试管放回冰上。
8. 加入 300 μL 冰冷的 PBS。使用缩短的移液器吸头（步骤1.9），小心地取出所有组织并沉积在含有2 mL冰冷LC-MS级甲醇的预标记螺旋盖玻璃管（在步骤1.5中制备）中（将组织添加到甲醇中，而不是管的侧面）。
9. 通过从带有组织值的管中单独减去试管来计算洗涤的组织量。将此数字记录在总组织列中。总组织值将用于在步骤6.12中归一化质谱数据。
10. 将样品储存在-80°C，直到准备好执行步骤4.1-4.15。
    注意:这是一个很好的停止点，样品可以在-80°C下安全储存几周。 对于其他组织归一化方法，例如蛋白质浓度或脂质磷酸盐含量，请参阅Rohrbach等人¹¹。

4. 脂质提取

注意:在早上开始这些步骤很重要，尤其是在要处理许多样品时。在开始之前，将水浴或培养箱预热至48°C。

1. 从冰箱中取出步骤3.8中制备的样品和MS脂质标准品（在步骤1.11中制备）。让它们平衡至室温20分钟。
2. 涡旋并将内标溶液浸入超声水浴（见 材料表）中2-3分钟或直到MS脂质标准品完全溶解，然后分液到样品中。这将避免数据规范化中的错误。
3. 使用重复移液器，向每个试管中加入 250 pmol（来自步骤 1.11 中制备的 25 nmol/mL 溶液中的 10 μL）的内部质谱标准品。轻轻盖上试管。
4. 为便于均质化，将甲醇体积调节至 2 mL。仅使用 LC-MS/MS 级甲醇。
5. 一次工作一个管，使用均质机研磨组织，直到没有可见的团块（通常为5-20秒）。以圆周运动移动均质器尖端，轻轻按压管壁以帮助研磨。重新盖上试管。
   注意:确保所有组织都经过精细研磨将最大限度地提高脂质提取。在均质化之前，请勿向样品中添加氯仿，因为一次性均质器吸头由塑料制成，可溶解在含有氯仿的溶液中。
6. 将管子以45°角浸入超声波水浴中5-10秒。
   1. 如果浸入超声波浴中时没有形成组织团块，请盖上盖子，然后移至下一个试管。
   2. 如果将管浸入超声波浴中时形成组织团块，请重新均质化并靶向团块。
   3. 重复此过程（均质化/浸入超声波浴中），直到所有大组织团块都被分解。
7. 在通风橱中，向每个试管中加入LC-MS级氯仿和甲醇（使用瓶顶分配器），以达到2:1:0.1甲醇:氯仿:水的比例。使用干净的盖子，将管子密封好，放在工作台上直到一天结束。
   1. 对于重量不超过 50 mg 的组织，使用总提取体积为 4 mL，并使用此比例（50 mg:4 mL 提取溶液）调整较大的标本。
8. 在当晚离开之前，将紧密盖的管放入48°C水浴或培养箱中，并孵育过夜。
   注意:至关重要的是，管子必须紧闭，以免溶剂比例因蒸发而改变。
9. 第二天早上，从48°C水浴中取出样品，并通过在4°C下以4，000-5，000× g 离心20分钟来沉淀任何溶剂不溶性碎片。
10. 在通风橱中工作，小心地将上清液倒入预先标记的13 x 100 mm硼硅酸盐玻璃试管中。将 13 x 100 mm 的管子倾斜 30-45° 角，以便于倾析。
    注意:如果处理超过12个样品，请勿让离心管长时间静置，因为执行步骤4.10时，颗粒会软化并且不溶性碎屑会转移。为避免这种情况，一次只能从离心机中取出 12 个试管，然后继续离心其他试管，直到您准备好倾析它们。
11. 将管子转移到能够容纳 13 x 100 mm 管的真空浓缩器中。用最初的1小时加热步骤（40°C）蒸发所有溶剂，并在最大真空下运行。
12. 从真空浓缩器中取出试管，向每个试管中加入 500 μL LC-MS 级甲醇（使用瓶顶分配器）。
13. 通过涡旋5-10秒重悬干燥的脂质提取物，然后将管以45°角浸入超声波水浴中2分钟，同时旋转管。重新涡旋5秒，再浸入超声波水浴中一分钟。
    注意:这是确保提取脂质的最大回收率的关键步骤。在管壁上的所有干燥材料重新悬浮之前，不要继续前进。
14. 将13 x 100mm管置于预冷（4°C）离心机中，并通过在4°C下以4，000-5，000× g 离心20-30分钟除去任何不溶性碎片。
15. 小心地将澄清的上清液倒入预先标记的自动进样器小瓶中。将自动注射器小瓶倾斜 30-45° 角将有助于倾析。确保将 13 x 100 mm 管的全部内容物倒入自动加载器小瓶中。
16. 盖紧试管并将试管储存在-80°C，直到通过LC-ESI-MS / MS进行分析。

5. LC-ESI-MS/MS 分析

注意:以下程序使用二进制泵系统与自动注射器、脱气器和以三重四极杆模式运行的 LC-MS/MS 系统耦合。使用柱温箱保持柱温。有关所用设备的详细信息，请参阅 材料表 。

1. 制备流动相A1（CH 3 OH:H₂O:HCOOH，58:41:1，v:v:v，含5 mM甲酸铵）和流动相B1（CH₃OH:HCOOH，99:1，v:v，含5 mM甲酸铵）。仅使用LC-MS级溶剂、水和试剂。
2. 对于每组样品，准备四个含有 500 μL LC-MS 级甲醇的空白自动进样器小瓶。
3. 对于每组样品，通过在500 μLLC-MS级甲醇中稀释10 μL（每个标准品总共250 pmol）在步骤1.11中制备的内标溶液，制备两个内标（标记为IS）自动进样器小瓶。
4. 将柱温炉温度设置为60°C，离子源温度设置为500°C。
5. 对于MS / MS分析，请使用光谱仪的三重四极杆模式。设置第一个四极杆 （Q1） 以传递母离子，同时将第三个四极杆 （Q3） 设置为传递分子独特的产物离子（或在 Q1 或 Q3 中扫描多个 m/z），使用 N2 碰撞诱导四极杆 2 （Q2） 中的解离，该解离与 Q1 偏移 30-120 eV。
6. 将多反应监测对 （MRM） 检测窗口设置为 120 秒，目标扫描时间为 1.0 秒。有关MRM对、电离能和碰撞能的列表，请参阅 表1 。
7. 使用以下参数在液相色谱步骤中分离鞘脂:使用0.7 mL/min的流速，用95%流动相A1和5%流动相B1的溶剂混合物平衡2.1（内径）x 50 mm C18反相柱0.5分钟。
   1. 进样后，将流动相A1/B1比值保持在95/52.25分钟，然后在1.5分钟内线性梯度至100%B1，然后在100%B1下保持5.5分钟，然后梯度0.5分钟返回95/5 A1/B1。
   2. 运行后，用95/5 A1 / B1的混合物重新平衡色谱柱0.5分钟。
8. 对样品自动进样器使用以下设置:冲洗体积，500 μL;针行程，52毫米（应根据每个小瓶中的小瓶尺寸和体积进行调整）;冲洗速度，35 μL/s;采样速度，5.0 μL/s;漂洗浸渍时间，2秒;冲洗模式，抽吸前后;冲洗时间，2秒。
9. 将步骤4.15中制备的样品按以下顺序放在自动加载器托盘上:空白;是;空白;步骤4.15制备的样品;空白，IS，空白。
10. 通过LC-ESI-MS/MS分析每个样品的5-10 μL.分析数据集中所有样品的相同体积。

6. 数据处理、集成和规范化

注意:虽然以下步骤概述了特定软件的程序（参见 材料表），但等效LC-MS仪器和软件上的类似程序可用于整合所分析脂质类别和相应内标的MRM对。

1. 打开定量软件。在 "定量 "选项卡中，双击" 定量向导"。在弹出窗口中最左侧的工作区中，导航到正确的数据集，然后单击鼠标左键。可用示例将显示在中间工作区中。
2. 突出显示要分析的样本，然后单击右侧箭头将样本添加到 "所选样本 "工作区。单击" 下一步 "导航到通常使用默认设置的设置和查询屏幕。
3. 点击 下一步 导航到集成方法选择屏幕。选择包含MRM过渡对的适当积分方法，用于分析脂质。有关 MRM 转换对，请参阅 表 1 。点击 完成。
   注意:保留时间因仪器和个别设置而异，因此必须针对每个单独的设置进行验证。
4. 在导航栏中，单击 "峰值查看 "窗格，以便可以检查 MRM 对。为便于查看，请右键单击 "峰值查看 "窗格，将自动 缩放 更改为 最大峰值的 100%，缩放 窗口 为 1.00 - 2.00 分钟。
5. 右键单击" 定量显示 "窗口，然后选择分析 物 和所需的鞘脂进行检查。验证空白样品中没有峰，并且IS样品中是否积分了正确的峰。
6. 开始整合未知样本。一次处理一个鞘脂等级，检查内标MRM对的保留时间（即C12:0神经酰胺），并确保软件已积分正确的峰。
7. 继续使用相同脂质类别（即 C14:0神经酰胺、C16:0-神经酰胺等），从同类中链长最短的脂质开始。验证每个链长脂质的软件例程是否积分了正确的MRM对峰。
8. 整合所有分析物后，为分析的每种鞘脂种类（例如神经酰胺、鞘磷脂等）创建一个电子电子表格。标记列标题，以匹配LC-MS/MS定量软件中分析物的顺序和链长。还包括步骤 3.9 中确定的样品 ID 和样品归一化权重的列标题。
   注意:如前所述¹¹，其它常见的归一化措施包括总脂质磷酸盐含量或蛋白质量。
9. 将所有分析物和内标的峰面积导出或复制到电子电子表格中。
10. 通过将给定鞘脂类别的每个链长物种的积分峰面积除以其相应内标的峰面积来归一化数据。例如，C14:0神经酰胺， C16:0神经酰胺、C18:1神经酰胺等，应各按C12:0除以神经酰胺内标峰面积。
11. 通过将归一化峰面积（在步骤6.10中计算）乘以步骤4.3中添加到样品中的内标量（以皮摩尔为单位），将峰面积转换为回收的脂质摩尔数。在该协议中，该量为250 pmol。
12. 为了获得每个样品中脂质的相对量，将每个脂质链长度的皮摩尔除以步骤3.9中确定的组织重量。这将给出每毫克组织的脂质皮摩尔单位。

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结果

在该协议中，我们详细描述了一种从冷冻保存的人体组织中去除OCT的方法，并称量组织以进行LC-ESI-MS / MS分析。此程序所需的材料列在 材料表中。 图1 所示是一个典型实验的结果，其中洗涤10个人肺腺癌肿瘤和10个正常邻近组织以去除OCT，并通过LC-ESI-MS / MS进行分析。 重要的是，正如我们之前显示的¹¹所示，与正常的相邻未受累组织相比，肺腺?...

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讨论

OCT是一种常见的长期冷冻保存剂，用于生物储存库。然而^，当通过各种质谱平台^{12、13、14、15}分析组织时，OCT会导致离子抑制，或者当通过LC-ESI-MS/MS¹¹分析样品时，会导致信号丢失。冷冻保存组织中的OCT也会干扰组织标准化方法，例如称量和蛋白质定量测定，例如Bradford和BCA

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL polypropylene pipette tips	NA	NA	Used to retrieve specimens
1.5 mL polypropylene centrifuge tubes	NA	NA
10 mL Erlenmeyer flask	VWR	89091-116	Used for tube and tissue weighing
AB Sciex Analyst 1.6.2	Sciex	NA	Software to analyze and integrate MS data
Ammonium formate	Fisher Scientific	A11550	For LC mobile phases
Analytical scale	NA	NA	Scale that is accurate to 0.1 mg
Bottle top dispenser	Sartorius	LH-723071	Used for dispensing solvents
C12-Ceramide (d18:1/C12:0); N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine	Avanti Polar Lipids	LM2212	Internal standard
C12-glucosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-β-glucosyl-sphing-4-eine	Avanti Polar Lipids	LM2511	Internal standard
C12-lactosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-ß-lactosyl-sphing-4-ene	Avanti Polar Lipids	LM2512	Internal standard
C12-Sphingomyelin  (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine-1-phosphocholine	Avanti Polar Lipids	LM2312	Internal standard
CHLOROFORM OMNISOLV 4L	VWR	EM-CX1054-1
ClickSeal Biocontainment Lids	Thermo Scientific	75007309	To prevent biohazard aeresols during centrifugation
Conflikt	Decon Labs	4101	Decontaminant
CTO-20A/20AC Column Oven	Shimadzu	NA	For LC
d17:1-Sphingosine;  (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-ene-1,3-diol	Avanti Polar Lipids	LM2000	Internal standard
d17:1-Sphingosine-1-phosphate; heptadecasphing-4-enine-1-phosphate	Avanti Polar Lipids	LM2144	Internal standard
DGU20A5R degasser	Shimadzu	NA
Disposable Culture Tubes 13x100mm	VWR	53283-800	13x100 mm screw top tubes
Heated water bath	NA	NA	For overnight lipid extraction
Homogenizer 150	Fisher Scientific	15-340-167	triturate tissues
Homogenizer Plastic Disposable Generator Probe	Fisher Scientific	15-340-177	for homogenization
Kimwipes	Kimtech	34120	Laboratory grade tissue used to make wicks
Methanol LC-MS Grade 4L	VWR	EM-MX0486-1
Nexera LC-30 AD binary pump system	Shimadzu	NA	For LC-MS
Permanent marker	VWR	52877-310
Phenolic Screw Thread Closure, Kimble Chase (caps for disposable culture tubes)	VWR	89001-502	13x100 mm screw top tube caps
Phosphate bufffered saline	Thermo Scientific	10010023	To retrieve specimens from tubes after washing
Repeater pipette	Eppendorf	4987000118	To dispense LC-MS internal standards
Screw Caps, Blue, Red PTFE/White Silicone	VWR	89239-020	Autoinjector vial caps
Screw Thread Glass Vials with ID Patch	VWR	46610-724	Autoinjector vials
SIL-30AC autoinjector	Shimadzu	NA
SpeedVac	Thermo Scientific	SPD2030P1220	For drying solvents
Supelco 2.1 (i.d.) x 50 mm Ascentis Express C18 column	Sigma Aldrich	581300-U	For LC-MS
Triple Quad 5500+ LC-MS/MS System	Sciex	NA	For LC-ESI-MS/MS
Ultrasonic water bath	Branson	Model 2800	for homogenization and resuspension of extracted and dried lipids
Vortexer	NA	NA	For sOCTrP and resuspending dried lipids
VWR Culture Tubes Disposable Borosilicate Glass	VWR	47729572	13x100 glass culture tubes
Water Hipersolve Chromanorm LC-MS	VWR	BDH83645.400