Kütle Spektrometrisi Analizi için Optimum Kesme Sıcaklığı Bileşiğine Gömülü İnsan Dokularının Hazırlanması

Özet

Sfengolipidler, insan hastalıklarında iyi bilinen rollere sahip biyoaktif metabolitlerdir. Kütle spektrometresi ile dokulardaki değişikliklerin karakterize edilmesi, hastalık etiyolojisindeki rolleri ortaya çıkarabilir veya terapötik hedefleri tanımlayabilir. Bununla birlikte, biyodepolarda kriyoprezervasyon için kullanılan OCT bileşiği, kütle spektrometrisine müdahale eder. OCT'ye gömülü insan dokularındaki sfingolipidleri LC-ESI-MS / MS ile analiz etme yöntemlerini özetliyoruz.

Özet

Sfengolipidler, insan metabolizmasında ve hastalığında iyi bilinen rollere sahip hücresel bileşenlerdir. Kütle spektrometrisi, sfingolipidlerin bir hastalıkta değişip değişmediğini belirlemek ve sfingolipidlerin klinik olarak hedeflenip hedeflenemeyeceğini araştırmak için kullanılabilir. Bununla birlikte, dokuları doğrudan cerrahi süitten alan uygun şekilde güçlendirilmiş prospektif çalışmalar zaman alıcı ve teknik, lojistik ve idari olarak zor olabilir. Buna karşılık, retrospektif çalışmalar, doku biyodepolarında genellikle çok sayıda bulunan kriyokorunmuş insan örneklerinden yararlanabilir. Dokuları biyodepolardan temin etmenin diğer avantajları, histoloji, patoloji ve bazı durumlarda klinikopatolojik değişkenler de dahil olmak üzere doku örnekleriyle ilişkili bilgilere erişimi içerir ve bunların hepsi lipidomik verilerle korelasyonları incelemek için kullanılabilir. Bununla birlikte, kriyoprezervasyonda ve kütle spektrometrisinde kullanılan optimal kesme sıcaklığı bileşiğinin (OCT) uyumsuzluğu ile ilgili teknik sınırlamalar, lipitlerin analizi için teknik bir engeldir. Bununla birlikte, OCT'nin, sfengolipid içeriğini değiştirmeden yıkama ve santrifüjleme döngüleri yoluyla insan biyodepo örneklerinden kolayca çıkarılabileceğini daha önce göstermiştik. Ayrıca, OKT'de kriyokorunmuş insan dokularındaki sfingolipidlerin 16 yıla kadar stabil olduğunu daha önce tespit etmiştik. Bu raporda, OCT'ye gömülü insan dokusu örneklerinde sfingolipidleri analiz etmek için kullanılan adımları ve iş akışını, yıkama dokuları, veri normalizasyonu için dokuların tartılması, lipitlerin ekstraksiyonu, sıvı kromatografisi elektrosprey iyonizasyon tandem kütle spektrometrisi (LC-ESI-MS / MS), kütle spektrometrisi veri entegrasyonu, veri normalizasyonu ve veri analizi ile analiz için numunelerin hazırlanması dahil olmak üzere özetlemekteyiz.

Giriş

Sfengolipidler, insan metabolizması ve hastalığındaki rolleri ile bilinen biyoaktif metabolitlerdir ^1,2. Hücre göçü, hücre sağkalımı ve ölümü, hücre hareketi, veziküler kaçakçılık, hücresel invazyon ve metastaz, anjiyogenez ve sitokinlerin üretimi gibi karmaşık hücresel süreçleri düzenlerler 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Sfengolipid metabolizmasının düzenlenmesindeki kusurlar, kanserlerin başlamasına ve ilerlemesine katkıda bulunur, kanserlerin ne kadar agresif olduğunu ve kanserlerin tedaviye nasıl tepki verdiğini ve direnç geliştirdiğini belirler ^3,10. Bu nedenle, hastalığın etiyolojisi üzerindeki bu geniş etkileri nedeniyle, hastalığa özgü sfengolipid değişikliklerini kesin olarak belirleyebilen analitik yöntemler önemli araçlardır. Kütle spektrometresi (MS), sfengolipid değişikliklerini analiz etmek için en doğru ve güvenilir yöntemdir.

Sfengolipid değişikliklerinin analizi için kullanılabilecek insan örnekleri, cerrahi süitten prospektif olarak veya doku biyodepolarından retrospektif olarak elde edilebilir. Ameliyattan elde edilen taze dokular avantajlıdır çünkü MS veya diğer analitik yöntemlerle doğrudan analiz edilebilirler. Bununla birlikte, dokuların prospektif olarak elde edilmesinin idari, teknik ve lojistik engelleri vardır ve istatistiksel güce ulaşmak için yeterli örnek toplamak zor olabilir. Dokuların biyodepolardan elde edilmesi avantajlıdır, çünkü retrospektif olarak, çok sayıda edinilebilirler ve biyodepolar histoloji ve patolojiyi doğrular, dokuları kriyojenik olarak korumak ve depolamak için standart çalışma prosedürleri kullanır ve korelasyon analizleri için kullanılabilecek klinikopatolojik veriler sağlayabilir. Bununla birlikte, moleküler ve yapısal özellikleri korumak için, biyodepolar dokuları optimum kesme sıcaklığı (OCT) bileşiğine gömerek kriyoprotektiflik edebilir, ki bu da veri normalleştirme tahlillerine ve sıvı kromatografisi elektrosprey iyonizasyon tandem kütle spektrometrisi (LC-ESI-MS / MS) ¹¹ ile sfengolipidlerin nicelleştirilmesine müdahale ettiğini gösterdik. . OCT bileşiğindeki birincil bileşenler olan polivinil alkol ve polietilen glikolün, diğer MS analiz platformlarında iyon baskılanmasına neden olduğu da gösterilmiştir^12,13,14,15. Bu nedenle, OCT bileşiği MS tarafından sfengolipidomik analizden önce dokulardan uzaklaştırılmalıdır.

Önceki bir raporda, LC-ESI-MS/MS analizi¹¹ için OCT bileşiğinin insan örneklerinden çıkarılmasına yönelik bir protokolü ve veri normalizasyonu için dokuları tartmak için kullanılan metodolojiyi¹¹ olarak doğrulamıştık. Burada, sfengolipidomik OCT bileşiği çıkarma protokolünün (sOCTrP) adımlarını detaylandırıyoruz ve insan akciğer adenokarsinom tümörlerinden ve normal bitişik tutulmamış dokulardan temsili veriler gösteriyoruz.

Protokol

Tanımlanmamış insan akciğer dokuları, Virginia Commonwealth Üniversitesi (VCU) Doku ve Veri Toplama ve Analiz Çekirdeğinden, dahili bir inceleme kurulu (IRB) onaylı protokol (#HM2471) kapsamında elde edilmiştir. Farelerin araştırma ve fare dokularının toplanması için kullanılması, VCU kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Malzemelerin hazırlanması

NOT: Bu adımlar doku yıkamadan bir gün önce yapılmalıdır.

1. Ertesi gün işlenecek her numune için kısa ama net tanımlayıcı kodlara sahip 1,5 mL polipropilen santrifüj tüplerini önceden etiketleyin ve tartın. Tekrarlanan boru taşıma işleminin altında solmayacak kimyasal olarak dayanıklı kalıcı bir işaretleyici kullanın ( Malzeme Tablosuna bakınız).
2. Elektronik bir elektronik tablo açın ve ardışık sütunları şu sütun başlıklarıyla etiketleyin: tüp tanımlayıcısı (ID), tek başına tüp, doku/doku içeren tüp ve toplam doku. Tüp kimliği etiketli sütuna işlenecek tüp tanımlayıcılarını girin.
3. Analitik teraziyi önceden kalibre edin ve sıfırlayın. Denge plakasının ortasına temiz bir 10 mL Erlenmeyer şişesi yerleştirin (şişe tüp tutucu görevi görecektir). Tartım odasının kapağını kapatın ve kantarı şişeyle darmadağın edin.
4. 1,5 mL santrifüj tüplerini tartın. Tüpü şişeye dikkatlice yerleştirin ve tartım odasının kapağını kapatın. Ağırlığın stabilize olmasına izin verin ve ağırlığı yalnızca tüp etiketli sütuna kaydedin.
   NOT: Tüpleri tararken 10 mL Erlenmeyer şişesini hareket ettirmekten kaçının. Şişe hareket ettirilirse, şişeyi yeniden ortalayın ve dengeyi yeniden daralın. Kapalı tüpleri bir rafa yerleştirin ve ihtiyaç duyulana kadar saklayın.
5. 13 x 100 mm vidalı cam tüpleri ve kapakları tanımlayıcı kodlarla önceden etiketleyin ve 2 mL LC-MS sınıfı metanol ile doldurun. Bunları bir tüp rafına yerleştirin, tüpleri kapatın ve kullanana kadar buzdolabında (4 ° C) saklayın.
   NOT: Bir şişe üstü solvent dağıtıcı kullanın (bkz. Biri mevcut değilse, organik çözücüler dağıtırken plastik kullanımından kaçınmak için cam pipetler kullanın.
6. Ön etiket 13 x 100 mm cam test tüpleri. Test tüplerini oda sıcaklığında örtün ve saklayın.
7. Otomatik enjektör şişelerini tanımlayıcı kodlarla önceden etiketleyin. Otomatik enjektör şişelerini örtün ve kullanana kadar oda sıcaklığında saklayın.
8. Doku kurutan fitiller hazırlayın.
   1. Cerrahi makasları LC-MS sınıfı metanole 5 dakika batırarak temizleyin ve ardından temiz bir laboratuvar sınıfı doku ile silin.
   2. Pudrasız eldivenler kullanarak, laboratuvar sınıfı bir dokunun ucunu (bakınız Malzeme Tablosu) ince konik 30-40 mm'lik bir fitil oluşana kadar döndürün.
   3. Metanol ile temizlenmiş makas kullanarak, fitili kalın uçta kesin. Fitilleri temiz bir karton kutuya yerleştirin. Tüm numuneleri işlemek için gerekenden iki kat daha fazla fitil yapın.
9. Kısaltılmış 1 mL pipet uçları hazırlayın. Metanol ile temizlenmiş cerrahi makas kullanarak, 1 mL'lik pipet ucunun ucundan 4-5 mm kesin, ucu tekrar uç tutucuya yerleştirin. İşlenecek numunelerden iki kat daha fazla ipucu hazırlayın.
   NOT: Bunlar, yıkanmış dokuların tüplerden alınmasında kullanılacaktır. Ucun ucuna dokunmayın.
10. Ön soğutma moleküler biyoloji sınıfı fosfat tamponlu salin (PBS) ila 4 °C (0.5 L yeterlidir). Bu, örnekleri almak için kullanılacaktır. İşlenecek her numune için, 60 mL ultra saf deiyonize suyu önceden soğutun (4 °C).
11. Kütle spektrometresi iç standartlarını hazırlayın. Aşağıdaki lipitleri etanol:metanol:su (7:2:1; v/v/v) konsantrasyonunda 25 nmol/mL: d17:1-sfengosin, (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-ene-1,3-diol içinde çözün; d17:1-sfengosin-1-fosfat, heptadekasfing-4-enin-1-fosfat; C12-Seramid (d18:1/C12:0), N-(dodekanoyl)-sphing-4-enin; C12-sfingomiyelin (d18:1/C12:0), N-(dodekanoyl)-sphing-4-enine-1-fosfokolin; C12-glukozilseramid (d18:1/C12:0), N-(dodekanoil)-1-β-glukozil-sphing-4-eine; C12-laktosilseramid (d18:1/C12:0), N-(dodekanoil)-1-ß-laktosil-sphing-4-ene.

2. Doku yıkama

NOT: Bölüm 1'deki tüm adımları bir gün önce tamamlamak, yetenekli bir araştırmacının günde 40 numuneye kadar işlemesine ve günde ~ 10-15 numune almasına izin verir. Sabahın erken saatlerinde başlayın ve bölüm 2.1-3.8'deki tüm adımlar tamamlanana kadar durmayın.

1. Dokuların işleneceği gün, biyogüvenlik kabini çalışma alanını bir girdap, tam yüklü bir serolojik pipetör ve bir buz tepsisi ile donatarak hazırlayın. Bu bölümdeki tüm adımlar için, laboratuvar önlüğü, çift kat eldiven ve koruyucu gözlük dahil olmak üzere uygun KKD'ler giyin. DİKKAT: İnsan dokuları ve sıvıları biyotehlikeli maddeler olarak düşünülmeli ve muamele görmelidir.
2. Ön soğutma (4 °C) sallanan kova santrifüjünü, 15 mL konik santrifüj tüplerini tutmak için gereken adaptörleri ve santrifüj biyolojik muhafaza kapaklarını tutun. Ön soğutma (4 °C) 1,5 mL santrifüj tüplerini tutabilen sabit açılı bir santrifüj.
3. Dokular 15 mL polipropilen santrifüj tüplerine aliquoted edilmezse, önceden etiketlenmiş 15 mL polipropilen tüplere aktarmak için metanol ile temizlenmiş bir spatula (her yeni doku örneği için temiz) kullanın. 15 mL kapakları da etiketleyin.
   1. 15 mL santrifüj tüplerini tutabilen bir tüp rafını bir buz tepsisine yerleştirin ve tepsiyi buzla doldurun. O gün işlenecek dokuları buz üzerindeki rafa yerleştirerek çözün.
      NOT: İşleme için biyodepodan en az 3-4 mg doku talep edilmelidir, çünkü doku yıkama ve tartım protokollerinin bu ağırlıklarda doğru ve güvenilir olduğu daha önce gösterilmiştir¹¹.
4. Numunelerle birlikte buz tepsisini biyogüvenlik kabinine taşıyın.
5. Aşağıda açıklandığı gibi üç sOCTrP döngüsü¹¹ gerçekleştirin (yani, 2.5.1-2.5.5 arasındaki adımları üç kez uygulayın).
   1. Her tüpe 10 mL buz gibi soğuk ultra saf deiyonize su ekleyin ve sıkıca kapatın. Tüplerin 10 dakika kuluçkaya yatmasına izin verin.
   2. Her tüpü 10-20 sn boyunca veya tüpün duvarlarında biriken tüm dokular veya bir doku peleti tamamen yeniden askıya alınana kadar kuvvetli bir şekilde vorteksleyin.
      NOT: sOCTrP döngüleri 2-3'te, pelet içindeki herhangi bir OCT'nin yıkama çözeltisine seyreltilmesi için peletin yeniden askıya alınması kritik öneme sahiptir.
   3. Tüpleri önceden soğutulmuş (4 °C) sallanan kova santrifüjüne aktarın. 4 °C'de 10 dakika boyunca 4.000-5.000 x g'de santrifüj numuneleri.
      NOT: Santrifüj taşıyıcılarını bir biyolojik muhafaza kapağı ile kapatarak santrifüjleme sırasında oluşan biyotehlikeli aerosollerin üretilmesini ve bunlara maruz kalmasını önleyin (bkz.
   4. Santrifüjden numuneleri alın ve buz tepsisine aktarın. Tepsiyi bir biyogüvenlik dolabına yerleştirin ve tüplerin kapağını açın. Kapakları kaydedin.
   5. Yıkama solüsyonunu dikkatlice aspire edin. Tüpün içinde süpernatantın ~ 0.5 mL'sini bırakarak pelet içindeki doku materyalini aspire etmekten kaçının. Tüpleri kapatın ve etiketli kapakları tüplerle eşleştirerek çapraz kontaminasyonu önleyin.
      NOT: Adım 2.5.5'teki yıkama çözeltisi (süpernatant) biyotehlikeli bir malzemedir; İnsan kökenli örnekler için uygun biyogüvenlik kurallarına uygun olarak ele alır ve bertaraf eder.

3. Doku tartımı (veri normalleştirme için)

1. Son sOCTrP yıkama döngüsünden sonra, yıkama çözeltisinin çoğunu dikkatlice aspire edin, ancak peleti rahatsız etmekten kaçının. Yıkama çözeltisinin ~ 0,5 mL'sini tüpün içinde bırakın.
2. Kısaltılmış pipet uçlarını kullanarak (adım 1.9'da hazırlanmıştır), 500 μL buz gibi soğuk PBS alın ve tüpe ekleyin.
   1. Aynı ucu kullanarak, peleti nazikçe askıya alın ve tüm dokuyu alın. Tüp ve pipet ucu duvarlarına yapışmasıyla doku kaybını azaltmak için türbülanslı pipetlemeden kaçının.
3. Yeniden askıya alınmış dokuyu karşılık gelen önceden etiketlenmiş ve önceden tartılmış 1,5 mL santrifüj tüpüne ekleyin ve tüpü buzun üzerine yerleştirin. Veri kümesindeki tüm dokular için bu işlemi tekrarlayın.
4. 1,5 mL tüpleri önceden soğutulmuş bir santrifüje yerleştirin ve dokuları 5-7 dakika ve 4 ° C boyunca 7.000 x g'de pelet edin.
   1. Tüpleri alın ve peleti rahatsız etmeden PBS'nin mümkün olduğunca çoğunu dikkatlice aspire edin. Tüpü tekrar buzun üzerine yerleştirin.
5. Dokuların iyi peletlenmesini sağlamak için tüpleri 7.000 x g'de 3 dakika daha santrifüj yapın. Tüpleri buza aktarın.
   NOT: Ek santrifüjleme adımı, tüm yıkama solüsyonunu ve fitili çıkarırken doku kaybını önlemek için önemlidir. Beşten fazla numune işleniyorsa, dokuların peletlenmiş kalmasını sağlamak için her beşinci numune işlendikten sonra 3 dakika, 7.000 x g santrifüjleme adımını tekrarlayın.
6. Adım 1.8'de hazırlanan fitilleri kullanarak, kalan yıkama solüsyonunu nazikçe çıkarın. Her numune için temiz bir fitil kullanın. Dokuyu fitil ile nazikçe delmek kabul edilebilir, bu da yıkama çözeltisinin çoğunun çıkarılmasına yardımcı olur, ancak fitile yapışarak herhangi bir doku kaybetmekten kaçınır. Tüpü kapatın ve buzun üzerine yerleştirin.
7. Her tüpü yakın zamanda kalibre edilmiş, katranlanmış ve sıfırlanmış analitik terazide tartın.
   1. Her tüpü cam Erlenmeyer şişesine yerleştirin ve oda kapısını kapatın. Ağırlık stabilize olduğunda, tüp w / doku etiketli elektronik elektronik tablo sütununa kaydedin.
   2. Tarttıktan sonra, tüpü tekrar buzun üzerine yerleştirin.
8. 300 μL buz gibi soğuk PBS ekleyin. Kısaltılmış bir pipet ucu (adım 1.9) kullanarak, tüm dokuları dikkatlice alın ve 2 mL buz gibi soğuk LC-MS sınıfı metanol içeren önceden etiketlenmiş bir vidalı cam tüpte (adım 1.5'te hazırlanmış) biriktirin (dokuyu tüpün yanına değil, metanole ekleyin).
9. Yıkanan doku miktarını, tek başına tüpü w / doku değeri olan tüpten çıkararak hesaplayın. Bu sayıyı toplam doku sütununa kaydedin. Toplam doku değeri, adım 6.12'de kütle spektrometresi verilerini normalleştirmek için kullanılacaktır.
10. 4.1-4.15 adımlarını gerçekleştirmeye hazır olana kadar numuneleri -80 °C'de saklayın.
    NOT: Bu iyi bir durma noktasıdır ve numuneler -80 ° C'de birkaç hafta boyunca güvenli bir şekilde saklanabilir. Protein konsantrasyonu veya lipid fosfat içeriği gibi diğer doku normalleştirme yöntemleri için Rohrbach ve ^ark.11'e bakınız.

4. Lipid ekstraksiyonu

NOT: Bu adımlara, özellikle birçok numunenin işleneceği sabah, başlamak önemlidir. Başlamadan önce, bir su banyosunu veya inkübatörü 48 ° C'ye ısıtın.

1. Adım 3.8'de hazırlanan numuneleri ve MS lipit standartlarını (adım 1.11'de hazırlanan) dondurucudan alın. 20 dakika boyunca oda sıcaklığına dengelenmelerine izin verin.
2. Vorteks yapın ve dahili standart çözeltiyi ultrasonik bir su banyosuna ( Malzeme Tablosuna bakınız) 2-3 dakika boyunca veya numunelere dağıtmadan önce MS lipit standartları tamamen çözülene kadar daldırın. Bu, veri normalleştirmedeki hataları önleyecektir.
3. Tekrarlanan bir pipet kullanarak, her tüpe 250 pmol (adım 1.11'de hazırlanan 25 nmol/mL çözeltiden 10 μL) dahili kütle spektrometrisi standartları ekleyin. Tüpleri hafifçe yeniden kapatın.
4. Homojenizasyonu kolaylaştırmak için, metanol hacmini 2 mL'ye ayarlayın. Sadece LC-MS/MS sınıfı metanol kullanın.
5. Her seferinde bir tüp çalışarak, hiçbir küme görünmeyene kadar (tipik olarak 5-20 s) dokuyu tritürize etmek için bir homojenizatör kullanın. Homojenizatör ucunu dairesel bir hareketle hareket ettirin ve tritürasyona yardımcı olmak için tüp duvarına hafifçe bastırın. Tüpü tekrar kapatın.
   NOT: Tüm dokuların ince bir şekilde tritüe edilmesini sağlamak, lipit ekstraksiyonunu en üst düzeye çıkaracaktır. Tek kullanımlık homojenizatör uçları kloroform içeren çözeltiler içinde çözünecek plastikten yapıldığından, homojenizasyondan önce numunelere kloroform eklemeyin.
6. Tüpü 45 ° açıyla 5-10 s için ultrasonik bir su banyosuna batırın.
   1. Ultrasonik banyoya daldırıldıktan sonra hiçbir doku kümelenmesi oluşmazsa, kapağı kapatın ve bir sonraki tüpe geçin.
   2. Tüp ultrasonik banyoya daldırıldığında doku kümeleri oluşursa, yeniden homojenize edin ve kümeleri hedefleyin.
   3. Tüm büyük doku kümeleri kırılana kadar bu işlemi (homojenizasyon / ultrasonik banyoya daldırma) yinelemeli olarak tekrarlayın.
7. Bir duman davlumbazında, 2: 1: 0.1 metanol: kloroform: su oranını elde etmek için her tüpe LC-MS sınıfı kloroform ve metanoform ekleyin (bir şişe üstü dağıtıcı kullanın). Temiz kapaklar kullanarak, tüpleri sıkıca kapatın ve günün sonuna kadar tezgahın üzerinde bırakın.
   1. 50 mg veya daha hafif dokular için, toplam ekstraksiyon hacmi 4 mL'dir ve daha büyük numuneler için bu oranı (50 mg: 4 mL ekstraksiyon çözeltisi) kullanarak ayarlayın.
8. O akşam ayrılmadan önce, sıkıca kapatılmış tüpleri 48 ° C'lik bir su banyosuna veya inkübatöre yerleştirin ve gece boyunca inkübe edin.
   NOT: Solvent oranlarının buharlaşma nedeniyle değişmemesi için tüplerin sıkıca kapatılması çok önemlidir.
9. Ertesi sabah, numuneleri 48 °C su banyosundan alın ve 20 dakika boyunca 4 °C'de 4.000-5.000 x g'de santrifüjleme yoluyla solventte çözünmeyen kalıntıları pelet edin.
10. Bir duman davlumbazında çalışarak, süpernatantı önceden etiketlenmiş 13 x 100 mm borosilikat cam test tüplerine dikkatlice boşaltın. Dekantasyonu kolaylaştırmak için 13 x 100 mm'lik tüpü 30-45° açıyla eğin.
    NOT: 12'den fazla numune işleniyorsa, santrifüj tüplerin uzun süre oturmasına izin vermeyin, çünkü peletler yumuşayacak ve adım 4.10 gerçekleştirilirken çözünmeyen döküntüler aktarılacaktır. Bunu önlemek için, bir seferde santrifüjden sadece 12 tüp çıkarın ve diğer tüpleri boşaltmaya hazır olana kadar santrifüj yapmaya devam edin.
11. Tüpleri 13 x 100 mm tüpleri tutabilen bir vakum yoğunlaştırıcısına aktarın. Tüm çözücüleri ilk 1 saatlik ısıtma adımıyla (40 ° C) buharlaştırın ve maksimum vakum altında çalıştırın.
12. Tüpleri vakum yoğunlaştırıcıdan çıkarın ve her tüpe 500 μL LC-MS sınıfı metanol ekleyin (bir şişe üstü dağıtıcı kullanın).
13. Kurutulmuş lipit ekstraktlarını 5-10 s boyunca vorteks yaparak yeniden askıya alın, ardından tüpü döndürürken tüpleri ultrasonik su banyosunda 2 dakika boyunca 45 ° 'lik bir açıyla daldırın. 5 s için yeniden vorteks yapın ve bir dakika daha ultrasonik su banyosuna daldırın.
    NOT: Bu, ekstrakte edilen lipitlerin maksimum geri kazanımını sağlamak için kritik bir adımdır. Tüpün duvarındaki tüm kurutulmuş malzeme yeniden askıya alınana kadar ilerlemeyin.
14. 13 x 100 mm'lik tüpleri önceden soğutulmuş (4 °C) bir santrifüje yerleştirin ve çözünmeyen kalıntıları 20-30 dakika boyunca 4 °C'de 4.000-5.000 x g'de santrifüjleme ile temizleyin.
15. Berraklaştırılmış süpernatantı önceden etiketlenmiş bir otomatik enjektör şişesine dikkatlice bildirin. Otomatik enjektör şişesinin 30-45° açıyla eğilmesi dekantasyonu kolaylaştıracaktır. 13 x 100 mm'lik tüpün tüm içeriğinin otomatik yükleyici şişesine boşaltıldığından emin olun.
16. Tüpleri sıkıca kapatın ve LC-ESI-MS/MS ile analiz edilene kadar tüpleri -80 °C'de saklayın.

5. LC-ESI-MS/MS analizi

NOT: Aşağıdaki prosedür, üçlü dörtlü modda çalışan bir otomatik enjektör, degazör ve LC-MS/MS sistemine bağlı bir ikili pompa sistemi kullanır. Kolon sıcaklığı bir kolon fırını kullanılarak korunmuştur. Kullanılan ekipmanla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakın.

1. Mobil faz A1 (CH 3 OH:H₂O:HCOOH, 58:41:1, v:v:v, 5 mM amonyum formatlı) ve mobil faz B1'i (CH₃OH:HCOOH, 99:1, v:v, 5 mM amonyum formatlı) hazırlayın. Sadece LC-MS sınıfı çözücüler, su ve reaktifler kullanın.
2. Her numune seti için, 500 μL LC-MS sınıfı metanol içeren dört Boş otomatik yükleyici şişesi hazırlayın.
3. Her numune seti için, 500 μL LC-MS sınıfı metanol içinde adım 1.11'de hazırlanan dahili standart çözeltinin 10 μL'sini (her standart toplam 250 pmol) seyrelterek iki Dahili Standart (IS olarak etiketli) otomatik yükleyici şişesi hazırlayın.
4. Kolon fırın sıcaklığını 60 °C'ye, iyon kaynağı sıcaklığını ise 500 °C'ye ayarlayın.
5. MS / MS analizi için, spektrometrenin üçlü-dörtlü modunu kullanın. İlk kuadrupolü (Q1) öncü iyonları geçecek şekilde ayarlarken, üçüncü kuadrupole (Q3) moleküler olarak ayırt edici ürün iyonlarını (veya Q1 veya Q3'te çoklu m / z boyunca bir taramayı) geçirecek şekilde ayarlarken, Q1'den 30-120 eV ile dengelenen dörtlü 2'de (Q2) çarpışmalı ayrışmaları indüklemek için N2'yi kullanın.
6. Çoklu reaksiyon izleme çiftleri (MRM) algılama penceresini hedef tarama süresi 1,0 sn olacak şekilde 120 sn olarak ayarlayın. MRM çiftlerinin, iyonlaşma enerjilerinin ve çarpışma enerjilerinin listesi için Tablo 1'e bakın.
7. LC adımındaki sfingolipidleri çözmek için aşağıdaki parametreleri kullanın: 0,7 mL/dak'lık bir akış hızı kullanarak, 2,1 (i.d) x 50 mm C18 ters faz kolonunu 0,5 dakika boyunca %95 mobil faz A1 ve %5 mobil faz B1'lik bir çözücü karışımı ile dengeleyin.
   1. Numune enjeksiyonundan sonra, mobil faz A1 / B1 oranını 2,25 dakika boyunca 95/5'te tutun, ardından 1,5 dakika boyunca% 100 B1'e doğrusal bir gradyan izleyin, daha sonra 5,5 dakika boyunca% 100 B1'de tutulur, ardından 95/5 A1 / B1'e 0,5 dakikalık bir gradyan dönüşü gelir.
   2. Çalıştırmadan sonra, sütunu 0,5 dakika boyunca 95/5 A1 / B1 karışımı ile yeniden dengeleyin.
8. Numune otomatik yükleyici için aşağıdaki ayarları kullanın: durulama hacmi, 500 μL; iğne strok, 52 mm (bu, her şişedeki şişe boyutuna ve hacmine bağlı olarak ayarlanmalıdır); durulama hızı, 35 μL/s; örnekleme hızı, 5,0 μL/s; durulama daldırma süresi, 2 s; durulama modu, aspirasyondan önce ve sonra; durulama süresi,2 s.
9. Adım 4.15'te hazırlanan numuneleri otomatik yükleyici tepsisine aşağıdaki sırayla yerleştirin: Boş; DİR; Boş; Adım 4.15'te hazırlanan örnekler; Boş, IS, Boş.
10. Her numunenin 5-10 μL'sini LC-ESI-MS/MS ile analiz edin.

6. Veri işleme, entegrasyon ve normalleştirme

NOT: Aşağıdaki adımlar belirli yazılımlar için bir prosedürü özetlese de (bkz. Malzeme Tablosu), eşdeğer LC-MS cihazları ve yazılımları üzerindeki benzer prosedürler, analiz edilen lipit sınıfları ve ilgili dahili standartlar için MRM çiftlerini entegre etmek için kullanılabilir.

1. Nicelik yazılımını açın. Quantitate sekmesinde Quantitation Wizard'a çift tıklayın. Açılır pencerede, en soldaki çalışma alanında, doğru veri kümesine gidin ve üzerine sol tıklayın. Kullanılabilir örnekler orta çalışma alanında gösterilir.
2. Analiz edilecek örnekleri vurgulayın ve ardından Seçili Örnekler çalışma alanına örnekler eklemek için sağ taraftaki oka tıklayın. Varsayılan ayarların genellikle kullanıldığı ayarlara ve sorgu ekranına gitmek için İleri'ye tıklayın.
3. Entegrasyon yöntemi seçim ekranına gitmek için İleri'ye basın. Analiz edilecek lipitler için MRM geçiş çiftlerini içeren uygun bir entegrasyon yöntemi seçin. MRM geçiş çiftleri için Tablo 1'e bakın. Son'a basın.
   NOT: Bekletme süreleri, ölçümlü izleme ve bireysel ayarlara bağlı olarak değişir ve bu nedenle her bir kurulum için doğrulanması gerekir.
4. Gezinti çubuğunda, MRM çiftlerinin incelenebilmesi için Peak Review (En İyi İnceleme) bölmesine tıklayın. Gözden geçirmeyi kolaylaştırmak için, En Yüksek Gözden Geçirme bölmesine sağ tıklayın, Otomatik Yakınlaştırma'yı en büyük zirvenin %100'üne ve 1,00 - 2,00 dakikalık bir Yakınlaştırma Penceresi'ne değiştirin.
5. Quantitation Display penceresine sağ tıklayın ve Analyte ve incelenmek üzere istenen sfingolipidi seçin. Boş örneklerde tepe noktası olmadığını ve doğru tepe noktasının IS örneklerine entegre edildiğini doğrulayın.
6. Bilinmeyen örnekleri entegre etmeye başlayın. Bir seferde bir sfengolipid sınıfı çalışarak, iç standardın MRM çifti için tutma süresini inceleyin (yani, C12: 0 seramid) ve yazılımın doğru tepe noktasını entegre ettiğinden emin olun.
7. Aynı lipit sınıfındaki analitlere devam edin (yani, C14: 0 seramid, C16:0-seramid, vb.), sınıftaki en kısa zincir uzunluğundaki lipitle başlar. Her zincir uzunluğundaki lipit için yazılım rutininin doğru MRM çifti zirvesini entegre ettiğini doğrulayın.
8. Tüm analitler entegre edildiğinde, analiz edilen her sfengolipid türü için elektronik bir elektronik tablo oluşturun (örneğin, seramidler, sfingomiyelinler, vb.). Sütun başlıklarını, LC-MS/MS niceleme yazılımındaki analitlerin ve zincir uzunluklarının sırasına uyacak şekilde etiketleyin. Ayrıca, adım 3.9'da belirlenen örnek kimliği ve örnek normalleştirme ağırlıkları için bir sütun başlığı ekleyin.
   NOT: Daha önce tarif edildiği gibi¹¹, diğer yaygın normalizasyon önlemleri arasında toplam lipid fosfat içeriği veya protein miktarı bulunur.
9. Tüm analitler ve dahili standartlar için tepe alanlarını elektronik elektronik tabloya aktarın veya kopyalayın.
10. Belirli bir sfengolipid sınıfı için her zincir uzunluğundaki türün entegre tepe alanını, karşılık gelen iç standardının tepe alanına bölerek verileri normalleştirin. Örneğin, C14:0 seramid, C16:0 seramid, C18:1 seramid, vb., her biri C12:0'a bölünmelidir. seramid iç standart tepe bölgesi.
11. Pikomollerdeki normalleştirilmiş pik alanın (adım 6.10'da hesaplanan) 4.3. adımda numuneye eklenen iç standart miktarı ile çarpılmasıyla elde edilen pik alanı geri kazanılan lipit mollerine dönüştürün. Bu protokolde bu miktar 250 pmol'dür.
12. Her numunedeki nispi lipit miktarını elde etmek için, her bir lipit zinciri uzunluğunun pikomollerini adım 3.9'da belirlenen doku ağırlığına bölün. Bu, mg doku başına lipit pikomol birimleri verecektir.

Sonuçlar

Bu protokolde, OKT'yi kriyo-korunmuş insan dokularından çıkarmak ve LC-ESI-MS / MS ile analiz edilmek üzere dokuları tartmak için bir yöntemi ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Bu prosedür için gerekli malzemeler Malzeme Tablosunda listelenmiştir. Şekil 1'de gösterilenler, 10 insan akciğer adenokarsinom tümörünün ve 10 normal bitişik dokunun OKT'yi çıkarmak için yıkandığı ve LC-ESI-MS / MS tarafından analiz edildiği tipik bir deneyin sonuçlarıd...

Tartışmalar

OKT, biyodepolarda kullanılan yaygın bir uzun süreli kriyo-koruma ajanıdır. Bununla birlikte, dokular çeşitli kütle spektrometresi platformları^12,13,14,15 tarafından analiz edildiğinde OCT^, iyon baskılanmasına neden olabilir veya numuneler LC-ESI-MS / MS¹¹ tarafından analiz edildiğinde sinyal kaybına neden olabilir. Kriyokorunmuş dokulardaki OCT, Bradfor...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL polypropylene pipette tips	NA	NA	Used to retrieve specimens
1.5 mL polypropylene centrifuge tubes	NA	NA
10 mL Erlenmeyer flask	VWR	89091-116	Used for tube and tissue weighing
AB Sciex Analyst 1.6.2	Sciex	NA	Software to analyze and integrate MS data
Ammonium formate	Fisher Scientific	A11550	For LC mobile phases
Analytical scale	NA	NA	Scale that is accurate to 0.1 mg
Bottle top dispenser	Sartorius	LH-723071	Used for dispensing solvents
C12-Ceramide (d18:1/C12:0); N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine	Avanti Polar Lipids	LM2212	Internal standard
C12-glucosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-β-glucosyl-sphing-4-eine	Avanti Polar Lipids	LM2511	Internal standard
C12-lactosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-ß-lactosyl-sphing-4-ene	Avanti Polar Lipids	LM2512	Internal standard
C12-Sphingomyelin  (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine-1-phosphocholine	Avanti Polar Lipids	LM2312	Internal standard
CHLOROFORM OMNISOLV 4L	VWR	EM-CX1054-1
ClickSeal Biocontainment Lids	Thermo Scientific	75007309	To prevent biohazard aeresols during centrifugation
Conflikt	Decon Labs	4101	Decontaminant
CTO-20A/20AC Column Oven	Shimadzu	NA	For LC
d17:1-Sphingosine;  (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-ene-1,3-diol	Avanti Polar Lipids	LM2000	Internal standard
d17:1-Sphingosine-1-phosphate; heptadecasphing-4-enine-1-phosphate	Avanti Polar Lipids	LM2144	Internal standard
DGU20A5R degasser	Shimadzu	NA
Disposable Culture Tubes 13x100mm	VWR	53283-800	13x100 mm screw top tubes
Heated water bath	NA	NA	For overnight lipid extraction
Homogenizer 150	Fisher Scientific	15-340-167	triturate tissues
Homogenizer Plastic Disposable Generator Probe	Fisher Scientific	15-340-177	for homogenization
Kimwipes	Kimtech	34120	Laboratory grade tissue used to make wicks
Methanol LC-MS Grade 4L	VWR	EM-MX0486-1
Nexera LC-30 AD binary pump system	Shimadzu	NA	For LC-MS
Permanent marker	VWR	52877-310
Phenolic Screw Thread Closure, Kimble Chase (caps for disposable culture tubes)	VWR	89001-502	13x100 mm screw top tube caps
Phosphate bufffered saline	Thermo Scientific	10010023	To retrieve specimens from tubes after washing
Repeater pipette	Eppendorf	4987000118	To dispense LC-MS internal standards
Screw Caps, Blue, Red PTFE/White Silicone	VWR	89239-020	Autoinjector vial caps
Screw Thread Glass Vials with ID Patch	VWR	46610-724	Autoinjector vials
SIL-30AC autoinjector	Shimadzu	NA
SpeedVac	Thermo Scientific	SPD2030P1220	For drying solvents
Supelco 2.1 (i.d.) x 50 mm Ascentis Express C18 column	Sigma Aldrich	581300-U	For LC-MS
Triple Quad 5500+ LC-MS/MS System	Sciex	NA	For LC-ESI-MS/MS
Ultrasonic water bath	Branson	Model 2800	for homogenization and resuspension of extracted and dried lipids
Vortexer	NA	NA	For sOCTrP and resuspending dried lipids
VWR Culture Tubes Disposable Borosilicate Glass	VWR	47729572	13x100 glass culture tubes
Water Hipersolve Chromanorm LC-MS	VWR	BDH83645.400