Preparazione di tessuti umani incorporati in un composto di temperatura di taglio ottimale per l'analisi della spettrometria di massa

Riepilogo

Gli sfingolipidi sono metaboliti bioattivi con ruoli ben consolidati nelle malattie umane. La caratterizzazione delle alterazioni nei tessuti con spettrometria di massa può rivelare ruoli nell'eziologia della malattia o identificare bersagli terapeutici. Tuttavia, il composto OCT utilizzato per la crioconservazione nei biodepositi interferisce con la spettrometria di massa. Descriviamo metodi per analizzare gli sfingolipidi nei tessuti umani incorporati nell'OCT con LC-ESI-MS / MS.

Abstract

Gli sfingolipidi sono componenti cellulari che hanno ruoli ben consolidati nel metabolismo umano e nella malattia. La spettrometria di massa può essere utilizzata per determinare se gli sfingolipidi sono alterati in una malattia e indagare se gli sfingolipidi possono essere mirati clinicamente. Tuttavia, studi prospettici adeguatamente alimentati che acquisiscono tessuti direttamente dalla suite chirurgica possono richiedere molto tempo e impegnativi dal punto di vista tecnico, logistico e amministrativo. Al contrario, gli studi retrospettivi possono trarre vantaggio da campioni umani crioconservati già disponibili, di solito in gran numero, presso i biodepositi tissutali. Altri vantaggi dell'approvvigionamento di tessuti da biorepository includono l'accesso alle informazioni associate ai campioni di tessuto, tra cui istologia, patologia e in alcuni casi variabili clinicopatologiche, che possono essere utilizzate per esaminare le correlazioni con i dati lipidomici. Tuttavia, le limitazioni tecniche legate all'incompatibilità del composto a temperatura di taglio ottimale (OCT) utilizzato nella crioconservazione e nella spettrometria di massa rappresentano un ostacolo tecnico per l'analisi dei lipidi. Tuttavia, abbiamo precedentemente dimostrato che l'OCT può essere facilmente rimosso dai campioni di biorepository umani attraverso cicli di lavaggi e centrifugazione senza alterare il loro contenuto di sfingolipidi. Abbiamo anche precedentemente stabilito che gli sfingolipidi nei tessuti umani crioconservati nell'OCT sono stabili fino a 16 anni. In questo rapporto, delineiamo i passaggi e il flusso di lavoro per analizzare gli sfingolipidi nei campioni di tessuto umano incorporati nell'OCT, inclusi il lavaggio dei tessuti, la pesatura dei tessuti per la normalizzazione dei dati, l'estrazione dei lipidi, la preparazione di campioni per l'analisi mediante cromatografia liquida elettrospray ionizzazione tandem spettrometria di massa (LC-ESI-MS / MS), integrazione dei dati di spettrometria di massa, normalizzazione dei dati e analisi dei dati.

Introduzione

Gli sfingolipidi sono metaboliti bioattivi noti per il loro ruolo nel metabolismo umano e nella malattia ^1,2. Regolano processi cellulari complessi come la migrazione cellulare, la sopravvivenza e la morte cellulare, il movimento cellulare, il traffico vescicolare, l'invasione cellulare e le metastasi, l'angiogenesi e la produzione di citochine 1,2,3,4,5,6,7,8,9

Protocollo

I tessuti polmonari umani de-identificati sono stati ottenuti dal Tissue and Data Acquisition and Analysis Core della Virginia Commonwealth University (VCU) nell'ambito di un protocollo approvato (#HM2471) dal comitato di revisione interno (IRB). L'uso di topi per la ricerca e la raccolta di tessuti di topi è stato approvato dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della VCU (IACUC).

1. Preparazione dei materiali

NOTA: Questi passaggi devono essere eseguiti un giorno prima del lavaggio dei tessuti.

1. Pre-etichettare e pesare provette da centrifuga in polipropilene da 1,5 ml con codici ....

Risultati

In questo protocollo, descriviamo in dettaglio un metodo per rimuovere l'OCT dai tessuti umani crioconservati e pesare i tessuti per l'analisi mediante LC-ESI-MS / MS. I materiali necessari per questa procedura sono elencati nella tabella dei materiali. Mostrati nella Figura 1 sono i risultati di un tipico esperimento in cui 10 tumori dell'adenocarcinoma polmonare umano e 10 tessuti normali adiacenti sono stati lavati per rimuovere l'OCT e analizzati da LC-ESI-MS / MS. È im.......

Discussione

L'OCT è un comune agente di crioconservazione a lungo termine utilizzato nei biorepository. Tuttavia, l'OCT può provocare la soppressione ionica quando i tessuti vengono analizzati da varie piattaforme di spettrometria di massa^12,13,14,15, o provocare la perdita di segnale quando i campioni vengono analizzati da LC-ESI-MS/MS ¹¹. L'OCT nei tessuti crioconservati può an.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL polypropylene pipette tips	NA	NA	Used to retrieve specimens
1.5 mL polypropylene centrifuge tubes	NA	NA
10 mL Erlenmeyer flask	VWR	89091-116	Used for tube and tissue weighing
AB Sciex Analyst 1.6.2	Sciex	NA	Software to analyze and integrate MS data
Ammonium formate	Fisher Scientific	A11550	For LC mobile phases
Analytical scale	NA	NA	Scale that is accurate to 0.1 mg
Bottle top dispenser	Sartorius	LH-723071	Used for dispensing solvents
C12-Ceramide (d18:1/C12:0); N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine	Avanti Polar Lipids	LM2212	Internal standard
C12-glucosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-β-glucosyl-sphing-4-eine	Avanti Polar Lipids	LM2511	Internal standard
C12-lactosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-ß-lactosyl-sphing-4-ene	Avanti Polar Lipids	LM2512	Internal standard
C12-Sphingomyelin  (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine-1-phosphocholine	Avanti Polar Lipids	LM2312	Internal standard
CHLOROFORM OMNISOLV 4L	VWR	EM-CX1054-1
ClickSeal Biocontainment Lids	Thermo Scientific	75007309	To prevent biohazard aeresols during centrifugation
Conflikt	Decon Labs	4101	Decontaminant
CTO-20A/20AC Column Oven	Shimadzu	NA	For LC
d17:1-Sphingosine;  (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-ene-1,3-diol	Avanti Polar Lipids	LM2000	Internal standard
d17:1-Sphingosine-1-phosphate; heptadecasphing-4-enine-1-phosphate	Avanti Polar Lipids	LM2144	Internal standard
DGU20A5R degasser	Shimadzu	NA
Disposable Culture Tubes 13x100mm	VWR	53283-800	13x100 mm screw top tubes
Heated water bath	NA	NA	For overnight lipid extraction
Homogenizer 150	Fisher Scientific	15-340-167	triturate tissues
Homogenizer Plastic Disposable Generator Probe	Fisher Scientific	15-340-177	for homogenization
Kimwipes	Kimtech	34120	Laboratory grade tissue used to make wicks
Methanol LC-MS Grade 4L	VWR	EM-MX0486-1
Nexera LC-30 AD binary pump system	Shimadzu	NA	For LC-MS
Permanent marker	VWR	52877-310
Phenolic Screw Thread Closure, Kimble Chase (caps for disposable culture tubes)	VWR	89001-502	13x100 mm screw top tube caps
Phosphate bufffered saline	Thermo Scientific	10010023	To retrieve specimens from tubes after washing
Repeater pipette	Eppendorf	4987000118	To dispense LC-MS internal standards
Screw Caps, Blue, Red PTFE/White Silicone	VWR	89239-020	Autoinjector vial caps
Screw Thread Glass Vials with ID Patch	VWR	46610-724	Autoinjector vials
SIL-30AC autoinjector	Shimadzu	NA
SpeedVac	Thermo Scientific	SPD2030P1220	For drying solvents
Supelco 2.1 (i.d.) x 50 mm Ascentis Express C18 column	Sigma Aldrich	53822-U	For LC-MS
Triple Quad 5500+ LC-MS/MS System	Sciex	NA	For LC-ESI-MS/MS
Ultrasonic water bath	Branson	Model 2800	for homogenization and resuspension of extracted and dried lipids
Vortexer	NA	NA	For sOCTrP and resuspending dried lipids
VWR Culture Tubes Disposable Borosilicate Glass	VWR	47729572	13x100 glass culture tubes
Water Hipersolve Chromanorm LC-MS	VWR	BDH83645.400