Preparazione di tessuti umani incorporati in un composto di temperatura di taglio ottimale per l'analisi della spettrometria di massa

Riepilogo

Gli sfingolipidi sono metaboliti bioattivi con ruoli ben consolidati nelle malattie umane. La caratterizzazione delle alterazioni nei tessuti con spettrometria di massa può rivelare ruoli nell'eziologia della malattia o identificare bersagli terapeutici. Tuttavia, il composto OCT utilizzato per la crioconservazione nei biodepositi interferisce con la spettrometria di massa. Descriviamo metodi per analizzare gli sfingolipidi nei tessuti umani incorporati nell'OCT con LC-ESI-MS / MS.

Abstract

Gli sfingolipidi sono componenti cellulari che hanno ruoli ben consolidati nel metabolismo umano e nella malattia. La spettrometria di massa può essere utilizzata per determinare se gli sfingolipidi sono alterati in una malattia e indagare se gli sfingolipidi possono essere mirati clinicamente. Tuttavia, studi prospettici adeguatamente alimentati che acquisiscono tessuti direttamente dalla suite chirurgica possono richiedere molto tempo e impegnativi dal punto di vista tecnico, logistico e amministrativo. Al contrario, gli studi retrospettivi possono trarre vantaggio da campioni umani crioconservati già disponibili, di solito in gran numero, presso i biodepositi tissutali. Altri vantaggi dell'approvvigionamento di tessuti da biorepository includono l'accesso alle informazioni associate ai campioni di tessuto, tra cui istologia, patologia e in alcuni casi variabili clinicopatologiche, che possono essere utilizzate per esaminare le correlazioni con i dati lipidomici. Tuttavia, le limitazioni tecniche legate all'incompatibilità del composto a temperatura di taglio ottimale (OCT) utilizzato nella crioconservazione e nella spettrometria di massa rappresentano un ostacolo tecnico per l'analisi dei lipidi. Tuttavia, abbiamo precedentemente dimostrato che l'OCT può essere facilmente rimosso dai campioni di biorepository umani attraverso cicli di lavaggi e centrifugazione senza alterare il loro contenuto di sfingolipidi. Abbiamo anche precedentemente stabilito che gli sfingolipidi nei tessuti umani crioconservati nell'OCT sono stabili fino a 16 anni. In questo rapporto, delineiamo i passaggi e il flusso di lavoro per analizzare gli sfingolipidi nei campioni di tessuto umano incorporati nell'OCT, inclusi il lavaggio dei tessuti, la pesatura dei tessuti per la normalizzazione dei dati, l'estrazione dei lipidi, la preparazione di campioni per l'analisi mediante cromatografia liquida elettrospray ionizzazione tandem spettrometria di massa (LC-ESI-MS / MS), integrazione dei dati di spettrometria di massa, normalizzazione dei dati e analisi dei dati.

Introduzione

Gli sfingolipidi sono metaboliti bioattivi noti per il loro ruolo nel metabolismo umano e nella malattia ^1,2. Regolano processi cellulari complessi come la migrazione cellulare, la sopravvivenza e la morte cellulare, il movimento cellulare, il traffico vescicolare, l'invasione cellulare e le metastasi, l'angiogenesi e la produzione di citochine 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . I difetti nella regolazione del metabolismo degli sfingolipidi contribuiscono all'inizio e alla progressione dei tumori, determinano quanto siano aggressivi i tumori e come i tumori rispondano e sviluppino resistenza alla terapia ^3,10. Pertanto, a causa di questi ampi impatti sull'eziologia della malattia, i metodi analitici che possono stabilire con precisione le alterazioni degli sfingolipidi specifici della malattia sono strumenti importanti. La spettrometria di massa (MS) è il metodo più accurato e affidabile per analizzare le alterazioni degli sfingolipidi.

I campioni umani che possono essere utilizzati per l'analisi delle alterazioni degli sfingolipidi possono essere ottenuti prospetticamente dalla suite chirurgica o retrospettivamente dai biodepositi tissutali. I tessuti freschi della chirurgia sono vantaggiosi perché possono essere analizzati direttamente dalla SM o da altri metodi analitici. Tuttavia, l'acquisizione prospettica di tessuti presenta ostacoli amministrativi, tecnici e logistici e la raccolta di campioni sufficienti per raggiungere il potere statistico può essere difficile. Ottenere tessuti da biorepository è vantaggioso perché possono essere acquisiti retrospettivamente, in gran numero, e i biorepository confermano istologia e patologia, utilizzano procedure operative standard per conservare e conservare criogenicamente i tessuti e possono fornire dati clinicopatologici che possono essere utilizzati per analisi di correlazione. Tuttavia, per preservare le caratteristiche molecolari e strutturali, i biorepository possono crioconservare i tessuti incorporandoli in un composto a temperatura di taglio ottimale (OCT), che abbiamo dimostrato interferisce con i saggi di normalizzazione dei dati e la quantificazione degli sfingolipidi mediante cromatografia liquida elettrospray ionizzazione tandem spettrometria di massa (LC-ESI-MS/MS)¹¹ . È stato inoltre dimostrato che l'alcol polivinilico e il glicole polietilenico, i componenti primari del composto OCT, determinano la soppressione ionica in altre piattaforme di analisi della SM^12,13,14,15. Pertanto, il composto OCT deve essere rimosso dai tessuti prima dell'analisi sfingolipidomica mediante SM.

In un precedente rapporto, abbiamo convalidato un protocollo per la rimozione del composto OCT da campioni umani per l'analisi LC-ESI-MS/MS¹¹ e la metodologia utilizzata per la pesatura dei tessuti per la normalizzazione dei dati¹¹. Qui, descriviamo in dettaglio le fasi del protocollo di rimozione del composto OCT sfingolipidomico (sOCTrP) e mostriamo dati rappresentativi da tumori dell'adenocarcinoma polmonare umano e normali tessuti adiacenti non coinvolti.

Protocollo

I tessuti polmonari umani de-identificati sono stati ottenuti dal Tissue and Data Acquisition and Analysis Core della Virginia Commonwealth University (VCU) nell'ambito di un protocollo approvato (#HM2471) dal comitato di revisione interno (IRB). L'uso di topi per la ricerca e la raccolta di tessuti di topi è stato approvato dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della VCU (IACUC).

1. Preparazione dei materiali

NOTA: Questi passaggi devono essere eseguiti un giorno prima del lavaggio dei tessuti.

1. Pre-etichettare e pesare provette da centrifuga in polipropilene da 1,5 ml con codici identificativi concisi ma chiari per ciascun campione che verrà elaborato il giorno successivo. Utilizzare un marcatore permanente resistente agli agenti chimici (vedere la tabella dei materiali) che non sbiadisca sotto la manipolazione ripetuta del tubo.
2. Apri un foglio di calcolo elettronico ed etichetta colonne consecutive con le seguenti intestazioni di colonna: identificatore del tubo (ID), tubo da solo, tubo con tessuto e tessuto totale. Immettere gli identificatori del tubo che verranno elaborati nella colonna denominata ID tubo.
3. Pre-calibrare e azzerare una bilancia analitica. Posizionare un matraccio Erlenmeyer pulito da 10 mL al centro della piastra della bilancia (il matraccio fungerà da portatubi). Chiudere lo sportello della camera di pesata e tarare la bilancia con il pallone.
4. Pesare provette da centrifuga da 1,5 ml. Posizionare con cautela il tubo nel pallone e chiudere lo sportello della camera di pesatura. Lasciare che il peso si stabilizzi e registrare il peso nel tubo etichettato a colonna da solo.
   NOTA: Evitare di spostare il matraccio Erlenmeyer da 10 mL durante la pesatura dei provette. Se il matraccio viene spostato, ricentrare il matraccio e ricalibrare la bilancia. Posizionare i tubi chiusi in una griglia e conservare fino al momento del bisogno.
5. Pre-etichettare tubi e tappi di vetro con tappo a vite 13 x 100 mm con i codici identificativi e riempirli con 2 ml di metanolo di grado LC-MS. Metterli in una griglia per tubi, tapparli e conservarli in frigorifero (4 °C) fino all'uso.
   NOTA: Utilizzare un dosatore di solvente con tappo di bottiglia (vedere la tabella dei materiali). Se non è disponibile, utilizzare pipette di vetro per evitare l'uso di materie plastiche durante l'erogazione di solventi organici.
6. Pre-etichettare provette in vetro 13 x 100 mm. Coprire e conservare le provette a temperatura ambiente.
7. Fiale di autoiniettori pre-etichettati con codici identificativi. Coprire e conservare i flaconcini dell'autoiniettore a temperatura ambiente fino all'uso.
8. Preparare stoppini per asciugare i tessuti.
   1. Inizia pulendo le forbici chirurgiche immergendole in metanolo di grado LC-MS per 5 minuti, quindi puliscile con un tessuto pulito da laboratorio.
   2. Utilizzando guanti senza polvere, ruotare l'estremità di un tessuto di laboratorio (vedi Tabella dei materiali) fino a formare uno stoppino finemente rastremato di 30-40 mm.
   3. Usando le forbici pulite a metanolo, tagliare lo stoppino sull'estremità spessa. Metti gli stoppini in una scatola di cartone pulita. Raddoppiare il numero di stoppini di quanto sarà necessario per elaborare tutti i campioni.
9. Preparare punte per pipette accorciate da 1 ml. Utilizzando forbici chirurgiche pulite con metanolo, tagliare 4-5 mm dalla punta di una punta di pipetta da 1 mL e riposizionare la punta nel supporto della punta. Prepara il doppio delle punte rispetto ai campioni da elaborare.
   NOTA: Questi saranno utilizzati nel recupero dei tessuti lavati dai tubi. Non toccare l'estremità della punta.
10. Soluzione salina tamponata con tampone fosfato (PBS) di grado biologia molecolare pre-freddo a 4 °C (0,5 L è sufficiente). Questo sarà usato per recuperare i campioni. Per ogni campione che verrà lavorato, pre-chill (4 °C) 60 ml di acqua deionizzata ultrapura.
11. Preparare standard interni di spettrometria di massa. Sciogliere i seguenti lipidi in etanolo:metanolo:acqua (7:2:1; v/v/v) ad una concentrazione di 25 nmol/mL: d17:1-sfingosina, (2S,3R,4E)-2-amminoeptadec-4-ene-1,3-diolo; D17:1-sfingosina-1-fosfato, eptadecasphing-4-enina-1-fosfato; C12-ceramide (d18:1/C12:0), N-(dodecanoil)-sfingo-4-enina; C12-sfingomielina (d18:1/C12:0), N-(dodecanoil)-sphing-4-enina-1-fosfocolina; C12-glucosilceramide (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-1-β-glucosil-sphing-4-eine; C12-lattosilceramide (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-1-ß-lattosil-sphing-4-ene.

2. Lavaggio dei tessuti

NOTA: Il completamento di tutti i passaggi della sezione 1 un giorno prima consente a un ricercatore esperto di elaborare fino a 40 campioni al giorno e ai principianti ~ 10-15 campioni al giorno. Iniziare la mattina presto e non fermarsi fino al completamento di tutti i passaggi delle sezioni 2.1-3.8.

1. Il giorno in cui i tessuti saranno lavorati, preparare l'area di lavoro dell'armadio di biosicurezza dotandolo di un vortice, un pipettor sierologico completamente carico e un vassoio per il ghiaccio. Per tutti i passaggi di questa sezione, indossare DPI appropriati, tra cui un camice da laboratorio, un doppio strato di guanti e occhiali protettivi. ATTENZIONE: I tessuti e i fluidi umani devono essere considerati e trattati come materiali biopericolosi.
2. Pre-raffreddare (4 °C) una centrifuga a secchio oscillante, eventuali adattatori necessari per contenere tubi conici da centrifuga da 15 ml e coperchi di biocontenimento della centrifuga. Pre-chill (4 °C) una centrifuga ad angolo fisso in grado di contenere provette da centrifuga da 1,5 ml.
3. Se i tessuti non sono aliquotati in provette da centrifuga in polipropilene da 15 ml, utilizzare una spatola pulita con metanolo (pulita per ogni nuovo campione di tessuto) per trasferirli in provette di polipropilene pre-etichettate da 15 ml. Etichettare anche i tappi da 15 ml.
   1. Posizionare una griglia portatubi in grado di contenere 15 mL di provette da centrifuga in una vaschetta per il ghiaccio e riempire la vaschetta con ghiaccio. Scongelare i tessuti che verranno lavorati quel giorno mettendoli nel rack sul ghiaccio.
      NOTA: Un minimo di 3-4 mg di tessuto deve essere richiesto al biorepository per l'elaborazione poiché è stato precedentemente dimostrato che i protocolli di lavaggio e pesatura dei tessuti sono accurati e affidabili a questi pesi¹¹.
4. Spostare la vaschetta del ghiaccio con i campioni nell'armadio di biosicurezza.
5. Eseguire tre cicli sOCTrP¹¹ come discusso di seguito (ad esempio, eseguire i passaggi 2.5.1-2.5.5 tre volte).
   1. Aggiungere 10 ml di acqua deionizzata ultrapura ghiacciata ghiacciata a ciascun tubo e coprirli ermeticamente. Lasciare incubare i tubi per 10 minuti.
   2. Vortice vigorosamente ogni tubo per 10-20 s o fino a quando tutto il tessuto depositato sulle pareti del tubo, o un pellet di tessuto, è completamente sospeso.
      NOTA: Nei cicli sOCTrP 2-3, è fondamentale che il pellet venga risospeso in modo che qualsiasi OCT nel pellet venga diluito nella soluzione di lavaggio.
   3. Trasferire i tubi nella centrifuga a secchio oscillante pre-raffreddata (4 °C). Centrifugare i campioni a 4.000-5.000 x g per 10 minuti a 4 °C.
      NOTA: Evitare la generazione e l'esposizione ad aerosol biopericolosi generati durante la centrifugazione sigillando i portacentrifughi con un coperchio di biocontenimento (vedere Tabella dei materiali).
   4. Prelevare i campioni dalla centrifuga e trasferirli nella vaschetta del ghiaccio. Posizionare il vassoio in un armadio di biosicurezza e aprire i tubi. Salva i tappi.
   5. Aspirare con cura la soluzione di lavaggio. Evitare di aspirare il materiale tissutale nel pellet lasciando ~ 0,5 ml di surnatante nel tubo. Tappare i tubi ed evitare la contaminazione incrociata abbinando i tappi etichettati con i tubi.
      NOTA: La soluzione di lavaggio (il surnatante) nella fase 2.5.5 è un materiale biopericoloso; maneggiarlo e smaltirlo seguendo le linee guida sulla biosicurezza appropriate per gli esemplari di origine umana.

3. Pesatura dei tessuti (per la normalizzazione dei dati)

1. Dopo l'ultimo ciclo di lavaggio sOCTrP, aspirare con cura la maggior parte della soluzione di lavaggio evitando di disturbare il pellet. Lasciare ~ 0,5 ml della soluzione di lavaggio nel tubo.
2. Utilizzando le punte delle pipette accorciate (preparate al punto 1.9), prelevare 500 μL di PBS ghiacciato e aggiungerlo al tubo.
   1. Utilizzando la stessa punta, risospendere delicatamente il pellet e recuperare tutto il tessuto. Evitare il pipettaggio turbolento per ridurre la perdita di tessuto grazie alla sua aderenza alle pareti del tubo e della punta della pipetta.
3. Aggiungere il tessuto risospeso al corrispondente tubo da centrifuga da 1,5 mL pre-etichettato e pre-pesato e posizionare il tubo sul ghiaccio. Ripetere l'operazione per tutti i tessuti nel set di dati.
4. Mettere i tubi da 1,5 mL in una centrifuga pre-refrigerata e pellettare i tessuti a 7.000 x g per 5-7 minuti e 4 °C.
   1. Recuperare i tubi e aspirare con cura la maggior parte del PBS possibile senza disturbare il pellet. Rimettere il tubo sul ghiaccio.
5. Centrifugare le provette per altri 3 minuti a 7.000 x g per garantire che i tessuti siano ben pellettati. Trasferire i tubi sul ghiaccio.
   NOTA: La fase di centrifugazione aggiuntiva è importante per prevenire la perdita di tessuto quando si rimuove tutta la soluzione di lavaggio e la traspirante. Se si elaborano più di cinque campioni, ripetere la fase di centrifugazione di 3 minuti e 7.000 x g dopo che ogni quinto campione è stato elaborato per garantire che i tessuti rimangano pellettati.
6. Utilizzando gli stoppini preparati al punto 1.8, rimuovere delicatamente la soluzione di lavaggio rimanente. Utilizzare uno stoppino pulito per ogni campione. È accettabile tamponare delicatamente il tessuto con lo stoppino, che aiuterà a rimuovere la maggior parte della soluzione di lavaggio ma eviterà di perdere qualsiasi tessuto aderendo allo stoppino. Chiudere il tubo e metterlo sul ghiaccio.
7. Pesare ogni tubo nella bilancia analitica recentemente calibrata, nastrata e azzerata.
   1. Posizionare ciascun tubo nel pallone Erlenmeyer di vetro e chiudere lo sportello della camera. Quando il peso si è stabilizzato, registrarlo nella colonna del foglio elettronico etichettata tubo w / tessuto.
   2. Dopo la pesatura, riposizionare il tubo sul ghiaccio.
8. Aggiungere 300 μL di PBS ghiacciato. Utilizzando una punta di pipetta accorciata (punto 1.9), recuperare con cura tutto il tessuto e depositarlo in un tubo di vetro con tappo a vite preetichettato (preparato al punto 1.5) contenente 2 ml di metanolo LC-MS ghiacciato (aggiungere il tessuto al metanolo, non sul lato del tubo).
9. Calcola la quantità di tessuto che è stata lavata sottraendo il tubo da solo dal tubo con valore di tessuto. Registrare questo numero nella colonna totale del tessuto. Il valore totale del tessuto sarà utilizzato per normalizzare i dati di spettrometria di massa nella fase 6.12.
10. Conservare i campioni a -80 °C fino al momento di eseguire le fasi 4.1-4.15.
    NOTA: Questo è un buon punto di sosta e i campioni possono essere conservati in modo sicuro per un paio di settimane a -80 °C. Per altri metodi di normalizzazione tissutale, come la concentrazione proteica o il contenuto di fosfati lipidici, fare riferimento a Rohrbach et ^al.11.

4. Estrazione dei lipidi

NOTA: è importante iniziare questi passaggi al mattino, in particolare quando verranno elaborati molti campioni. Prima di iniziare, preriscaldare a bagnomaria o incubatore a 48 °C.

1. Prelevare dal congelatore i campioni preparati al punto 3.8 e gli standard lipidici della SM (preparati al punto 1.11). Lasciare che si equilibrino a temperatura ambiente per 20 minuti.
2. Vortice e immergere la soluzione standard interna in un bagno d'acqua ad ultrasuoni (vedi Tabella dei materiali) per 2-3 minuti o fino a quando gli standard lipidici MS sono completamente sciolti prima dell'erogazione nei campioni. Ciò eviterà errori nella normalizzazione dei dati.
3. Utilizzando una pipetta ripetuta, aggiungere 250 pmol (10 μL dalla soluzione da 25 nmol/mL preparata al punto 1.11) di standard di spettrometria di massa interna a ciascuna provetta. Ri-caprare leggermente i tubi.
4. Per facilitare l'omogeneizzazione, regolare il volume di metanolo a 2 ml. Utilizzare solo metanolo di grado LC-MS/MS.
5. Lavorando un tubo alla volta, utilizzare un omogeneizzatore per triturare il tessuto fino a quando non sono visibili grumi (in genere 5-20 s). Spostare la punta dell'omogeneizzatore con un movimento circolare e premere delicatamente contro la parete del tubo per aiutare la triturazione. Ri-tappo il tubo.
   NOTA: Assicurarsi che tutti i tessuti siano finemente triturati massimizzerà l'estrazione dei lipidi. Non aggiungere cloroformio ai campioni prima dell'omogeneizzazione poiché le punte dell'omogeneizzatore monouso sono fatte di plastica che si dissolverà in soluzioni contenenti cloroformio.
6. Immergere il tubo con un angolo di 45° in un bagno d'acqua ad ultrasuoni per 5-10 s.
   1. Se non si formano grumi di tessuto durante l'immersione nel bagno ad ultrasuoni, coprirlo e passare al tubo successivo.
   2. Se si formano grumi di tessuto quando il tubo è immerso nel bagno ad ultrasuoni, riomogeneizzare e indirizzare i grumi.
   3. Ripetere questo processo (omogeneizzazione / immersione in un bagno ad ultrasuoni) in modo iterativo fino a quando tutti i grandi grumi di tessuto sono rotti.
7. In una cappa aspirante, aggiungere cloroformio e metanolo di grado LC-MS a ciascun tubo (utilizzare un dosatore per bottiglie) per ottenere un rapporto di 2:1:0.1 metanolo:cloroformio:acqua. Utilizzando tappi puliti, sigillare ermeticamente i tubi e lasciare sul banco fino alla fine della giornata.
   1. Per i tessuti di peso pari o inferiore a 50 mg, utilizzare un volume totale di estrazione di 4 ml e regolare utilizzando questo rapporto (soluzione di estrazione 50 mg:4 ml) per campioni più grandi.
8. Prima di partire la sera, collocare i tubi ben coperti in un bagnomaria o in un'incubatrice a 48 °C e incubarli durante la notte.
   NOTA: È fondamentale che i tubi siano ben chiusi in modo che i rapporti del solvente non cambino a causa dell'evaporazione.
9. La mattina seguente, prelevare i campioni dal bagno d'acqua a 48 °C e pellettare eventuali detriti insolubili in solvente mediante centrifugazione a 4.000-5.000 x g a 4 °C per 20 minuti.
10. Lavorando in una cappa aspirante, decantare accuratamente il surnatante nelle provette di vetro borosilicato pre-etichettate 13 x 100 mm. Inclinare il tubo di 13 x 100 mm con un angolo di 30-45° per facilitare la decantazione.
    NOTA: Se si trattano più di 12 campioni, non lasciare che i tubi centrifugati rimangano per lunghi periodi di tempo poiché i pellet si ammorbidiranno e i detriti insolubili verranno trasferiti durante l'esecuzione del passaggio 4.10. Per evitare ciò, estrarre solo 12 tubi dalla centrifuga alla volta e continuare a centrifugare gli altri tubi fino a quando non si è pronti a decantarli.
11. Trasferire i tubi in un concentratore di vuoto in grado di contenere tubi da 13 x 100 mm. Far evaporare tutto il solvente con una fase di riscaldamento iniziale di 1 ora (40 °C) e passare sotto il vuoto massimo.
12. Rimuovere i tubi dal concentratore di vuoto e aggiungere 500 μL di metanolo di grado LC-MS (utilizzare un dosatore con tappo di bottiglia) a ciascun tubo.
13. Risospendere gli estratti lipidici essiccati mediante vortice per 5-10 s, seguito da tubi di immersione con un angolo di 45 ° in un bagno d'acqua ad ultrasuoni per 2 minuti durante la rotazione del tubo. Ri-vortice per 5 s e immergere nel bagno d'acqua ad ultrasuoni per un minuto aggiuntivo.
    NOTA: Questo è un passaggio fondamentale per garantire il massimo recupero dei lipidi estratti. Non andare avanti fino a quando tutto il materiale essiccato sulla parete del tubo non è stato risospeso.
14. Porre i tubi da 13 x 100 mm in una centrifuga pre-raffreddata (4 °C) e rimuovere eventuali detriti insolubili mediante centrifugazione a 4.000-5.000 x g a 4 °C per 20-30 minuti.
15. Decantare accuratamente il surnatante chiarificato in un flaconcino di autoiniettore pre-etichettato. L'inclinazione del flaconcino dell'autoiniettore con un angolo di 30-45° faciliterà la decantazione. Assicurarsi che l'intero contenuto del tubo da 13 x 100 mm sia decantato nel flaconcino del caricatore automatico.
16. Tappare ermeticamente i tubi e conservarli a -80 °C fino all'analisi con LC-ESI-MS/MS.

5. Analisi LC-ESI-MS/MS

NOTA: la seguente procedura utilizza un sistema di pompa binario accoppiato a un autoiniettore, un degasatore e un sistema LC-MS/MS che opera in modalità triplo quadrupolo. La temperatura della colonna è stata mantenuta utilizzando un forno a colonna. Vedere la tabella dei materiali per i dettagli sulle attrezzature utilizzate.

1. Preparare la fase mobile A1 (CH 3 OH:H₂O:HCOOH, 58:41:1, v:v:v, con formiato di ammonio 5 mM) e la fase mobile B1 (CH₃OH:HCOOH, 99:1, v:v, con formiato di ammonio 5 mM). Utilizzare solo solventi, acqua e reagenti di grado LC-MS.
2. Per ogni set di campioni, preparare quattro flaconcini con caricatore automatico Blank contenenti 500 μL di metanolo LC-MS.
3. Per ogni set di campioni preparare due flaconcini di autoloader standard interno (etichetta come IS) diluendo 10 μL (250 pmol totali per ogni standard) della soluzione standard interna preparata al punto 1.11 in 500 μL di metanolo di grado LC-MS.
4. Impostare la temperatura del forno a colonna su 60 °C e la temperatura della sorgente ionica su 500 °C.
5. Per l'analisi MS/MS, utilizzare la modalità triplo quadrupolo dello spettrometro. Impostare il primo quadrupolo (Q1) per far passare gli ioni precursori, mentre impostare il terzo quadrupolo (Q3) per far passare ioni prodotto molecolarmente distintivi (o una scansione attraverso più m / z in Q1 o Q3) usando N2 per indurre collisionalmente dissociazioni nel quadrupolo 2 (Q2), che è sfalsato da Q1 di 30-120 eV.
6. Impostare la finestra di rilevamento delle coppie di monitoraggio delle reazioni multiple (MRM) su 120 s con un tempo di scansione target di 1,0 s. Fare riferimento alla Tabella 1 per un elenco di coppie MRM, energie di ionizzazione ed energie di collisione.
7. Utilizzare i seguenti parametri per risolvere gli sfingolipidi nella fase LC: utilizzando una portata di 0,7 mL/min, equilibrare una colonna di fase inversa C18 di 2,1 (i.d) x 50 mm per 0,5 minuti con una miscela di solvente composta al 95% dalla fase mobile A1 e dalla fase mobile B1 al 5%.
   1. Dopo l'iniezione del campione, mantenere il rapporto di fase mobile A1/B1 a 95/5 per 2,25 minuti, seguito da un gradiente lineare al 100% B1 su 1,5 minuti, che viene quindi mantenuto al 100% B1 per 5,5 minuti, seguito da un ritorno del gradiente di 0,5 minuti a 95/5 A1/B1.
   2. Dopo la corsa, riequilibrare la colonna con una miscela di 95/5 A1/B1 per 0,5 min.
8. Utilizzare le seguenti impostazioni per il caricatore automatico di esempio: volume di risciacquo, 500 μL; corsa dell'ago, 52 mm (deve essere regolata in base alle dimensioni e al volume del flaconcino in ciascun flaconcino); velocità di risciacquo, 35 μL/s; velocità di campionamento, 5,0 μL/s; tempo di immersione di risciacquo, 2 s; modalità di risciacquo, prima e dopo l'aspirazione; tempo di risciacquo,2 s.
9. Posizionare i campioni preparati al punto 4.15 su un vassoio del caricatore automatico nel seguente ordine: Vuoto; È; Vuoto; campioni preparati nella fase 4.15; Vuoto, È, Vuoto.
10. Analizzare 5-10 μL di ciascun campione mediante LC-ESI-MS/MS. Analizzare lo stesso volume per tutti i campioni nel set di dati.

6. Elaborazione, integrazione e normalizzazione dei dati

NOTA: Sebbene i seguenti passaggi delineino una procedura per software specifico (vedere Tabella dei materiali), procedure simili su strumenti e software LC-MS equivalenti possono essere utilizzate per integrare coppie MRM per le classi lipidiche analizzate e gli standard interni corrispondenti.

1. Aprire il software di quantificazione. Nella scheda Quantitate fare doppio clic su Quantitation Wizard. Nella finestra pop-up, nell'area di lavoro più a sinistra, passare al set di dati corretto e fare clic con il pulsante sinistro del mouse su di esso. Gli esempi disponibili verranno visualizzati nell'area di lavoro centrale.
2. Evidenziare i campioni da analizzare, quindi fare clic sulla freccia per destra per aggiungere campioni all'area di lavoro Campioni selezionati . Fare clic su Avanti per passare alla schermata delle impostazioni e delle query in cui vengono in genere utilizzate le impostazioni predefinite.
3. Premere Avanti per passare alla schermata di selezione del metodo di integrazione. Selezionare un metodo di integrazione appropriato contenente coppie di transizione MRM per i lipidi da analizzare. Fare riferimento alla Tabella 1 per le coppie di transizione MRM. Premi Fine.
   NOTA: i tempi di conservazione variano a seconda della strumentazione e delle singole impostazioni e devono quindi essere verificati per ogni singola configurazione.
4. Nella barra di spostamento fare clic sul riquadro Peak Review per ispezionare le coppie di Gestione record di messaggi. Per facilitare la revisione, fare clic con il pulsante destro del mouse sul riquadro Peak Review, modificare lo zoom automatico al 100% del picco più grande e una finestra di zoom di 1,00 - 2,00 minuti.
5. Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla finestra Visualizzazione quantificazione e selezionare Analita e lo sfingolipide desiderato da esaminare. Verificare che non vi siano picchi nei campioni vuoti e che il picco corretto sia stato integrato nei campioni IS.
6. Inizia a integrare campioni sconosciuti. Lavorando una classe di sfingolipidi alla volta, ispezionare il tempo di ritenzione per la coppia MRM dello standard interno (ad esempio, C12: 0 ceramide) e assicurarsi che il software abbia integrato il picco corretto.
7. Continuare sugli analiti della stessa classe lipidica (cioè C14:0 ceramide, C16:0-ceramide, ecc.), iniziando con il lipide a catena più corta della classe. Verificare per ogni lipide di lunghezza della catena che la routine software abbia integrato il picco di coppia MRM corretto.
8. Quando tutti gli analiti sono stati integrati, creare un foglio elettronico per ogni specie di sfingolipidi analizzata (ad esempio, ceramidi, sfingomieline, ecc.). Etichettare le intestazioni delle colonne in modo che corrispondano all'ordine degli analiti e delle lunghezze delle catene nel software di quantificazione LC-MS/MS. Includi anche un'intestazione di colonna per l'ID campione e i pesi di normalizzazione del campione determinati nel passaggio 3.9.
   NOTA: Come descritto in precedenza¹¹, altre misure di normalizzazione comuni includono il contenuto totale di fosfato lipidico o la quantità di proteine.
9. Esporta o copia le aree di picco per tutti gli analiti e gli standard interni nel foglio di calcolo elettronico.
10. Normalizzare i dati dividendo l'area del picco integrata di ciascuna specie di lunghezza della catena per una data classe di sfingolipidi per l'area del picco del suo standard interno corrispondente. Ad esempio, C14:0 ceramide, C16:0 ceramide, ceramide C18:1, ecc., Dovrebbero essere divisi ciascuno per il C12:0 Ceramide Area di picco standard interna.
11. Convertire l'area del picco in moli di lipidi recuperati moltiplicando l'area del picco normalizzata (calcolata nel punto 6.10) per la quantità di standard interno, in picomoli, che è stata aggiunta al campione nel punto 4.3. In questo protocollo, questa quantità è di 250 pmol.
12. Per ottenere la quantità relativa di lipidi in ciascun campione, dividere i picomoli di ciascuna lunghezza della catena lipidica per il peso del tessuto determinato al punto 3.9. Questo darà unità di picomoli di lipidi per mg di tessuto.

Risultati

In questo protocollo, descriviamo in dettaglio un metodo per rimuovere l'OCT dai tessuti umani crioconservati e pesare i tessuti per l'analisi mediante LC-ESI-MS / MS. I materiali necessari per questa procedura sono elencati nella tabella dei materiali. Mostrati nella Figura 1 sono i risultati di un tipico esperimento in cui 10 tumori dell'adenocarcinoma polmonare umano e 10 tessuti normali adiacenti sono stati lavati per rimuovere l'OCT e analizzati da LC-ESI-MS / MS. È im...

Discussione

L'OCT è un comune agente di crioconservazione a lungo termine utilizzato nei biorepository. Tuttavia, l'OCT può provocare la soppressione ionica quando i tessuti vengono analizzati da varie piattaforme di spettrometria di massa^12,13,14,15, o provocare la perdita di segnale quando i campioni vengono analizzati da LC-ESI-MS/MS ¹¹. L'OCT nei tessuti crioconservati può an...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL polypropylene pipette tips	NA	NA	Used to retrieve specimens
1.5 mL polypropylene centrifuge tubes	NA	NA
10 mL Erlenmeyer flask	VWR	89091-116	Used for tube and tissue weighing
AB Sciex Analyst 1.6.2	Sciex	NA	Software to analyze and integrate MS data
Ammonium formate	Fisher Scientific	A11550	For LC mobile phases
Analytical scale	NA	NA	Scale that is accurate to 0.1 mg
Bottle top dispenser	Sartorius	LH-723071	Used for dispensing solvents
C12-Ceramide (d18:1/C12:0); N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine	Avanti Polar Lipids	LM2212	Internal standard
C12-glucosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-β-glucosyl-sphing-4-eine	Avanti Polar Lipids	LM2511	Internal standard
C12-lactosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-ß-lactosyl-sphing-4-ene	Avanti Polar Lipids	LM2512	Internal standard
C12-Sphingomyelin  (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine-1-phosphocholine	Avanti Polar Lipids	LM2312	Internal standard
CHLOROFORM OMNISOLV 4L	VWR	EM-CX1054-1
ClickSeal Biocontainment Lids	Thermo Scientific	75007309	To prevent biohazard aeresols during centrifugation
Conflikt	Decon Labs	4101	Decontaminant
CTO-20A/20AC Column Oven	Shimadzu	NA	For LC
d17:1-Sphingosine;  (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-ene-1,3-diol	Avanti Polar Lipids	LM2000	Internal standard
d17:1-Sphingosine-1-phosphate; heptadecasphing-4-enine-1-phosphate	Avanti Polar Lipids	LM2144	Internal standard
DGU20A5R degasser	Shimadzu	NA
Disposable Culture Tubes 13x100mm	VWR	53283-800	13x100 mm screw top tubes
Heated water bath	NA	NA	For overnight lipid extraction
Homogenizer 150	Fisher Scientific	15-340-167	triturate tissues
Homogenizer Plastic Disposable Generator Probe	Fisher Scientific	15-340-177	for homogenization
Kimwipes	Kimtech	34120	Laboratory grade tissue used to make wicks
Methanol LC-MS Grade 4L	VWR	EM-MX0486-1
Nexera LC-30 AD binary pump system	Shimadzu	NA	For LC-MS
Permanent marker	VWR	52877-310
Phenolic Screw Thread Closure, Kimble Chase (caps for disposable culture tubes)	VWR	89001-502	13x100 mm screw top tube caps
Phosphate bufffered saline	Thermo Scientific	10010023	To retrieve specimens from tubes after washing
Repeater pipette	Eppendorf	4987000118	To dispense LC-MS internal standards
Screw Caps, Blue, Red PTFE/White Silicone	VWR	89239-020	Autoinjector vial caps
Screw Thread Glass Vials with ID Patch	VWR	46610-724	Autoinjector vials
SIL-30AC autoinjector	Shimadzu	NA
SpeedVac	Thermo Scientific	SPD2030P1220	For drying solvents
Supelco 2.1 (i.d.) x 50 mm Ascentis Express C18 column	Sigma Aldrich	581300-U	For LC-MS
Triple Quad 5500+ LC-MS/MS System	Sciex	NA	For LC-ESI-MS/MS
Ultrasonic water bath	Branson	Model 2800	for homogenization and resuspension of extracted and dried lipids
Vortexer	NA	NA	For sOCTrP and resuspending dried lipids
VWR Culture Tubes Disposable Borosilicate Glass	VWR	47729572	13x100 glass culture tubes
Water Hipersolve Chromanorm LC-MS	VWR	BDH83645.400