一种优化的O9-1/水凝胶系统，用于研究神经嵴细胞中的机械信号

摘要

这里描述了详细的分步方案，用于使用多能O9-1神经嵴细胞和不同硬度的聚丙烯酰胺水凝胶 在体外 研究机械信号。

摘要

神经嵴细胞（NCCs）是脊椎动物胚胎多能细胞，可以迁移和分化成各种细胞类型，从而产生各种器官和组织。组织刚度产生机械力，这是一种在NCC分化中起关键作用的物理线索;然而，机制仍不清楚。这里描述的方法为优化生成具有不同刚度的聚丙烯酰胺水凝胶，精确测量这种刚度以及评估O9-1细胞中机械信号的影响提供了详细信息，O9-1细胞是一种模拟 体内 NCC的NCC系。

使用原子力显微镜（AFM）测量水凝胶刚度，并相应地指示不同的刚度水平。在不同硬度的水凝胶上培养的O9-1 NCCs表现出不同的细胞形态和应激纤维的基因表达，这表明机械信号变化引起的生物学效应不同。此外，这确定了改变水凝胶刚度导致有效的 体外 系统，通过改变凝胶刚度和分析NCC中的分子和遗传调节来操纵机械信号传导.O9-1 NCCs可以在相应分化介质的影响下分化成广泛的细胞类型，并且便于 在体外操纵化学信号。因此，这种 体外 系统是研究机械信号传导在NCC中的作用及其与化学信号相互作用的有力工具，这将有助于研究人员更好地了解神经嵴发育和疾病的分子和遗传机制。

引言

神经嵴细胞（NCCs）是脊椎动物胚胎发生过程中的一组干细胞，具有显着的迁移能力，有助于各种器官和组织的发育。NCCs可以分化成不同的细胞类型，包括感觉神经元，软骨，骨骼，黑素细胞和平滑肌细胞，这取决于轴向起源的位置和NCC^1，2的局部环境引导。由于能够分化成多种细胞类型，在神经嵴（NC）发育的任何阶段引起失调的遗传异常都可能导致许多先天性疾病²。例如，NCC形成，迁移和发展过程中的扰动导致发育障碍，统称为神经性心脏病^1，3。这些疾病的范围从由于NCC形成失败而导致的颅面缺陷，例如Treacher Collins综合征，到由于NCC转移性迁移能力引起的各种癌症的发展，如黑色素瘤^{3，4，5，6}所示。在过去的几十年里，研究人员对NCC在发育和疾病中的作用和机制有了非凡的发现，大多数发现都集中在化学信号^7，8上。最近，机械信号已被证明在NCC开发^9，10中发挥了关键但知之甚少的作用。

NCC的环境线索在其发育过程中起着至关重要的作用，包括调节NCC分化成各种细胞类型。环境线索，例如物理线索，影响关键行为和细胞反应，如功能多样化。机械转导允许细胞感知并响应这些线索，以维持各种生物过程^2。NCCs被邻近细胞和不同的底物包围，例如细胞外基质（ECM），其可以产生机械刺激以维持体内平衡并通过命运决定，增殖和凋亡来适应变化^11。机械转导从发生机械细胞外刺激的感觉成分的质膜开始，导致细胞¹²的细胞内调节。整合素、局灶粘附和质膜的连接将机械信号（如剪切力、应力和周围基质的刚度）传递到化学信号中，以产生细胞响应^12。化学信号从质膜到最终细胞调节的传递是通过不同的信号通路进行的，以最终确定生物体的重要过程，例如分化。

一些研究表明，来自底物刚度的机械信号在细胞分化中起作用^13，14。例如，先前的研究表明，在软底物上生长的间充质干细胞（MSCs）具有类似于脑组织的刚度（在0.1-1.0 kPa的范围内）导致神经元细胞分化^15，16。然而，当在模仿肌肉硬度的8-17 kPa底物上生长时，更多的MSCs分化成肌细胞样细胞，而当MSCs在坚硬的底物（25-40 kPa）上培养时观察到成骨细胞样分化^15，16。机械信号通路中的不规则和异常突出了机甲转导的重要性，这些异常和异常可能导致严重的发育缺陷和疾病，包括癌症，心血管疾病和骨质疏松症^{17，18，19。}在癌症中，正常的乳房组织是柔软的，并且在僵硬和致密的乳房组织中患乳腺癌的风险增加，这种环境更类似于乳腺肿瘤¹⁵。有了这些知识，可以通过体外系统对底物刚度的简单操作来研究机械信号传导对NCC发展的影响，为理解NC相关疾病进展和病因的基本原理提供了进一步的优势和可能性。

为了研究机械信号对NCC的影响，我们基于先前发表的方法的优化和对NCC对不同机械信号的响应的评估，建立了一个有效的NCC体外系统20，21。为改变水凝胶刚度制备和评估机械信号传导在NCC中的影响提供了详细的方案。为了实现这一点，使用O9-1 NCCs作为NC模型来研究对刚性水凝胶与软水凝胶的反应和变化。O9-1 NCCs是在第8.5天从小鼠胚胎（E）中分离出来的稳定NC细胞系。O9-1 NCCs在体内模仿NCC，因为它们可以在定义的分化培养基²²中分化成各种NC衍生的细胞类型。为了研究NCC的机械信号传导，从不同浓度的丙烯酰胺和双丙烯酰胺溶液中制备具有可调弹性的基质基质，以达到所需的刚度，与生物底物刚度^20，21，23相关。为了优化NCC，特别是O9-1细胞的基质底物的条件，对先前发表的方案²⁰进行了修改。该协议中的一项更改是在37°C下将水凝胶在胶原I中孵育，用0.2%乙酸稀释而不是50mM HEPES过夜。乙酸的低pH值导致均匀分布和更高的胶原I掺入，从而允许ECM蛋白²⁴更均匀地附着。此外，在将水凝胶储存在培养箱中之前，分别在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中以10%和5%的浓度使用马血清和胎牛血清（FBS）的组合。马血清被用作FBS的额外补充，因为它能够在^10%25的浓度下促进细胞增殖和分化。

使用这种方法，通过ECM蛋白质包衣（例如胶原蛋白I）模拟生物环境，为NCC的生长和存活创造准确的体外环境20，21。通过原子力显微镜（AFM）定量分析所制备的水凝胶的刚度，原子力显微镜是描述弹性模量²⁶的众所周知的技术。为了研究不同硬度水平对NCC的影响，在水凝胶上培养和制备野生型O9-1细胞，用于免疫荧光（IF）染色，以对抗丝状肌动蛋白（F-actin），以显示细胞粘附和形态的差异响应底物刚度的变化。利用这种体外系统，研究人员将能够研究机械信号在NCC中的作用及其与其他化学信号的相互作用，以更深入地了解NCC与机械信号之间的关系。

研究方案

1. 水凝胶制备

注意:所有步骤必须在细胞培养罩中执行，该培养罩在使用前已用乙醇和紫外线（UV）灭菌消毒，以保持无菌性。工具，如镊子和移液器，必须喷洒乙醇。缓冲液也必须经过无菌过滤。

1. 氨基硅烷镀膜玻璃盖玻片的制备
   1. 将所需数量的玻璃盖玻片放在一块实验室擦拭布上。
      注:准备额外的 3-4 个盖玻片，以确保有足够的备用电源，因为它们很容易断裂。不同材质的玻璃盖玻片会产生不同的细胞接种和附着相容性。在开始实验之前，最好确定哪种类型最适合实验（见 材料表）。
   2. 使用酒精燃烧器或本生燃烧器通过火焰来回传递每个盖玻片来灭菌（蛋白质测定实验为30秒）。将每个玻璃盖玻片放在实验室湿巾上以冷却。
   3. 一旦玻璃盖玻片冷却下来，将它们转移到衬有parafilm的培养皿上，以防止滑移。
      注意:如果盖玻片不够冷，残余热量会将parafilm熔化到滑移上，使其无法使用。
   4. 用约200 μL和800 μL的0.1 M NaOH分别覆盖盖玻片，分别为12 mm和25 mm盖玻片，并让它们静置5分钟。然后，吸出0.1 M NaOH，让盖玻片再风干5分钟，形成均匀的薄膜。
   5. 盖玻片干燥后，分别移液约80μL和150μL3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTS）12 mm和25 mm盖玻片。小心避免溶液溅到胶片上。让溶液静置5分钟。
   6. 尽可能多地吸出多余的APTS，并让残留的APTS干燥5分钟。通过将盖玻片浸没在无菌的去离子（DI）H₂O中，每次冲洗3次，每次5分钟。
      注意:如果玻璃盖玻片冲洗不当，残留的APTS会导致戊二醛发生不必要的反应，导致形成白色沉淀物并导致盖玻片无法使用。
   7. 将盖玻片移动到新的培养皿中，反应性面朝上。在培养皿中加入足够的0.5%戊二醛，以完全覆盖盖玻片，并让盖玻片静置30分钟。
   8. 抽吸0.5%戊二醛，并在DI H₂O中再次冲洗盖玻片一次3分钟。使用前，将盖玻片反应面朝上放在实验室湿巾或干净的培养皿上，使其完全风干。
      注意:协议可以在此处暂停;盖玻片必须置于无菌DI H₂O中，直到使用。
2. 硅化盖玻片的制备
   1. 将与氨基硅烷涂层盖玻片相同数量的盖玻片（步骤1.1.1）放入衬有副膜的培养皿中。
   2. 将40μL或150μL分别取12mm和25mm盖玻片二氯甲基硅烷（DCMS）移液到盖玻片的一侧，并让溶液静置5分钟。
   3. 从盖玻片中吸取任何剩余的溶液，在无菌的DI H₂O中洗涤一次1分钟，然后将反应性盖玻片正面朝上放在实验室擦拭布上，以风干，然后再进行下一步。
3. 制备水凝胶
   1. 将丙烯酰胺，双丙烯酰胺和DI H₂O混合在1.5 mL离心管中，以制备具有不同刚度的500μL溶液（见 表1）。涡旋溶液30秒以使其彻底混合。
   2. 迅速工作，将10%过硫酸铵溶液（APS）和四甲基乙二胺（TEMED）加入管中，并再次涡旋溶液以混合溶液。
      注意:由于其敏感的冷冻/解冻循环，准备新鲜的10%APS并将其放在冰上或冷冻成一次性等分试样。
   3. 将约33μL或100μL溶液分别移液到干燥的12mm或25mm氨基硅烷包被的盖玻片上（第1.1节）。
   4. 使用弯曲的镊子，立即将DCMS处理的盖玻片放在凝胶溶液的顶部，处理后的一面接触凝胶溶液，从而将凝胶溶液夹在DCMS处理的盖玻片和氨基硅烷包被的盖玻片之间。
   5. 让凝胶溶液聚合5-15分钟，同时主动监测管中剩余溶液的凝胶聚合。
   6. 凝胶聚合后，用弯曲的镊子或剃须刀片分离DCMS处理的盖玻片，使凝胶附着在原始氨基硅烷包覆的盖玻片上。
   7. 立即将盖玻片与附着的水凝胶一起置于预定的4孔/ 24孔和6孔板中，分别覆盖有500μL和2 mL无菌PBS或DI H₂O，分别用于12 mm和25 mm盖玻片，以防止凝胶变干。
   8. 对所有封面重复步骤 1.3.4-1.3.7。
   9. 将水凝胶浸没在无菌PBS或DI H₂O中30分钟，以除去多余的丙烯酰胺溶液。将水凝胶储存在4°C的无菌PBS或DI H₂O中，以便在此处进行程序停止。
   10. 在黑暗的房间里，通过将2.5 mL的50 mM 2-[4-（2-羟乙基）哌嗪-1-基]乙烷磺酸（HEPES）（pH = 8.5）与25μL的50μg/ mL磺酸混合，制备磺基琥珀酰亚胺基6-（4'-叠氮基-2'-硝基苯基氨基）己酸酯（磺基-SANPAH）混合物，用锥形管包裹在铝箔中以防光。使用前使用移液器将溶液混合均匀。
       注意:2.5 mL磺基SANPAH溶液的体积足以容纳约25个12 mm水凝胶或5个25 mm水凝胶。
   11. 从孔板中抽吸PBS或DI H₂O。分别加入约100 μL或500 μL磺基-SANPAH溶液（步骤1.3.10）以覆盖凝胶的12 mm和25 mm盖玻片。确保溶液完全覆盖凝胶。
       注意:调整真空吸力，以防止强力撕裂或干扰水凝胶。
   12. 将含有溶液的凝胶置于15 W，365nm紫外光下10分钟，不加盖以尽量减少紫外光与磺基-SANPAH反应的任何干扰。
   13. 通过倾斜板来吸出多余的磺酸-SANPAH，以收集尽可能多的溶液。用50 mM HEPES洗涤凝胶两到三次。
   14. 将500μL和2mL分别用于12mm和25mm凝胶的50mg / mL胶原蛋白I稀释在0.2%乙酸中到每个含有水凝胶的孔中。让凝胶在37°C，5%CO₂ 培养箱中孵育过夜。
       注意:将胶原蛋白I稀释在0.2%乙酸中，而不是50 mM HEPES中，以促进胶原蛋白I的均匀分布和附着。
   15. 吸出胶原蛋白I并用无菌PBS洗涤凝胶三次，以去除多余的胶原蛋白I，每次洗涤5分钟。将水凝胶在PBS中孵育10%马血清，5%FBS在37°C，5%CO₂ 培养箱中2小时。
       注意:与仅使用FBS（如先前出版物中所做的那样）相比，添加10%的马血清可促进更高的增殖。
   16. 吸出培养基。向每个孔中加入500毫升无菌过滤的Dulbecco改良鹰培养基（DMEM），其中含有10%FBS和1%青霉素 - 链霉素（P / S）。将凝胶储存在37°C，5%CO₂ 培养箱中，直到准备好进行细胞培养。
   17. 准备就绪后，在培养皿中的基底培养基中×约10⁴ 个O9-1细胞/ cm^2。 将细胞在37°C，5%CO₂的培养箱中孵育2天。检查细胞的汇合度，以确保细胞充分附着在凝胶上，并且在收集进行分析之前细胞数量足够。
       注意:参见先前发布的方案，了解O9-1细胞的恢复，传代和收集的步骤^20。
   18. 进入第2，3或4部分以进一步分析水凝胶。

2. 通过AFM进行刚度定量分析

1. 启动AFM系统计算机，然后启动AFM控制器（请参见 材料表）。
2. 将AFM悬臂安装在AFM探头支架上。使用球形悬臂，在悬臂末端安装有0.5μm硅微珠（带有球形珠的悬臂）。
   注意:对于更硬的水凝胶，例如10 kPa，20 kPa和40 kPa，使用更坚硬的探头，弹簧常数为0.24 N / m。较软的探针用于较软的水凝胶，例如0.5 kPa和1 kPa，弹簧常数为0.059 N / m。
3. 将AFM软件设置为 接触模式。
4. 将硅晶圆安装到AFM样品台上，通过单击 悬 臂接触硅衬底来收集力曲线，从而产生力曲线。
5. 使用上面的力曲线（2.4）进行校准，单击控制软件中的 校准 ，获得热调谐条件下悬臂的平均弹簧常数，并将校准值保存在控制软件中。
6. 通过将盖玻片与附着的水凝胶一起放入60 mm培养皿中到AFM扫描台上来安装样品。在进行测量之前，将3 mL PBS加入培养皿中，以防止凝胶变干。
7. 将AFM设置为在 接触模式 （流体）下工作以开始测量。啮合球形珠以连续触摸和提起凝胶样品。
8. 设置悬臂，使其偏转阈值保持在 10 nm。将探头的斜坡尺寸保持在10μm。然后，记录力曲线，如步骤2.4所示。
9. 从水凝胶表面的至少3到10个不同点获得至少20个力曲线。
10. 使用AFM成像和分析软件计算每个点的平均杨氏模量约20条力曲线。使用延伸斜坡力曲线和线性化模型（球面）。计算每个样品的所有斑点的平均值，以产生最终的刚度。
    注:杨氏模量和相关数据（即 标准偏差）会自动保存为电子表格。
11. 对所有样本重复步骤 2.6-2.10。

3. 通过免疫荧光染色进行刚度的分子分析

1. 使用镊子将盖玻片输送到新板上，以最大限度地减少直接生长到板上的细胞的错误信号。用500μL无菌PBS洗涤细胞三次，以除去死细胞和任何剩余的培养基。
2. 使用500μL4%多聚甲醛（PFA）在室温下固定细胞10分钟，不受干扰。然后，使用500μLPBS /孔重新洗涤细胞三次，每次2分钟。
   注意:储存在4°C下，以便程序停止。
3. 在室温下用500μL0.1%Triton X-100处理细胞15分钟。然后，用500μLPBS /孔洗涤细胞三次。
4. 在室温下用250μL10%驴血清（在PBS中稀释和0.1%吐温20）每孔阻断细胞30分钟。
5. 用250μL一抗孵育细胞在室温下孵育2小时或在4°C下过夜。 然后，用500μLPBS /孔洗涤细胞三次，每次5分钟。
   注意:本实验中使用了抗长春花素（Vcl）（1:250）和抗AP2α（1:250），并稀释在10%驴血清中。
6. 用相应的二抗和/或用于F-肌动蛋白染色的细胞在室温下以1:400的稀释液在250μL10%驴血清中孵育30分钟。然后，用PBS洗涤细胞三次，每次5分钟。
   注意:568 nm 的 Phalloidin 可与 488 nm 或 647 nm 的二抗共育或单独孵育。
7. 用4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI，1:1000稀释）在250μLPBS中孵育细胞10分钟，然后最后一次洗涤PBS2分钟。
8. 向每个孔中加入3-4滴安装介质。在成像之前，将样品在4°C下放置至少2小时，以确保安装介质已正确设置。
9. 使用荧光显微镜捕获每个水凝胶样品至少3个随机帧的图像，产生单个和合并的通道。

4. 实时荧光定量 PCR （RT-qPCR）

1. 将带有贴壁细胞的水凝胶转移到新板中以进行RNA收集，以最大限度地减少附着在细胞板上的细胞中不需要的RNA。用PBS洗涤细胞三次以除去死细胞和培养基。
2. 使用RNA提取试剂盒提取总mRNA。按照制造商的说明，使用逆转录超混合体将RNA逆转录到cDNA。
3. 使用 Vcl 引物作为首选刚度标志物进行RT-qPCR，并使用2^-ΔΔCT 方法进行分析。
   注:Vcl的引物序列:向前5'GCTTCAGTCAGACCCATACTCG 3';反向 5' AGGTAAGCAGTAGGTCAGATGT 3'.

结果

通过AFM和赫兹模型进行水凝胶制备和刚度评估
在这里，提供了详细的方案，通过调节丙烯酰胺和双丙烯酰胺的比例来生成不同刚度的聚丙烯酰胺水凝胶。然而，由于缺乏ECM蛋白，聚丙烯酰胺水凝胶尚未准备好粘附细胞。因此，作为连接剂的磺胺-SANPAH与水凝胶共价结合并与ECM蛋白的伯胺反应，以允许ECM蛋白在UV活化后通过磺基-SANPAH中的 N-羟基琥珀酰亚胺酯粘附到水凝胶表面。...

讨论

本研究的目标是提供一种有效和高效的 体外 系统，以更好地了解机械信号对NCC的影响。除了遵循上述分步方案外，研究人员还需要记住，O9-1 NCC的细胞培养受到用于制备水凝胶的玻璃盖玻片类型的影响。例如，有人指出，接种在特定类型的玻璃盖玻片上的细胞（见 材料表）存活并增殖良好，而接种在其他类型的玻璃盖玻片上的培养细胞显示出更多的细胞死亡。此外，严格遵循...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip	Chemglass Life Sciences	CLS-1763-012
2% Bis-Acrylamide	Sigma Aldrich	M1533
24-well plate	Greiner Bio-one	662165
25 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip	Chemglass Life Sciences	CLS-1763-025
3-aminopropyl triethoxysilane (APTS)	Sigma Aldrich	A3648
4-well cell culture plate	Thermo Scientific	179830
4% Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	J61899-AP
40% Acrylamide	Sigma Aldrich	A4058
50% glutaraldehyde	Sigma Aldrich	G7651
6-well cell culture plate	Greiner Bio-one	657160
AFM cantilever (spherical bead)	Novascan
AFM software	Catalyst NanoScope		Model: 8.15 SR3R1
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher	A12379
Ammonium Persulfate (APS)	Sigma Aldrich	248614	Powder
anti-AP-2α Antibody	Santa Cruz	sc-12726
anti-Vinculin antibody	Abcam	ab129002
Atomic Force Microscopy (AFM) Bioscope Catalyst	Bruker Corporation
Collagen type I (100mg)	Corning	354236
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Thermo Fisher	D1306
Dichloromethylsilane (DCMS)	Sigma Aldrich	440272
Donkey serum	Sigma Aldrich	D9663
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Corning	10-017-CV
Fetal bovine serum (FBS)	Corning	35-010-CV
Fluorescence microscope	Leica		Model DMi8
Fluoromount-G mounting medium	SouthernBiotech	0100-35
HEPES	Sigma Aldrich	H3375	Powder
Horse serum	Corning	35-030-CI
iScript Reverse Transcription Supermix	Bio-Rad	1708841
Penicillin-Streptomycin antibiotic	Thermo Fisher	15140148
RNeasy micro kit	Qiagen	74004
Sterile 1x PBS	Hyclone	SH30256.02
Sterile deionized water	Hardy Diagnostics	U284
sulfo-SANPAH	Thermo Fisher	22589
SYBR green	Applied Biosystems	4472908
TEMED	Sigma Aldrich	T9281
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416