JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Çok güçlü O9-1 nöral kret hücreleri ve değişen sertlikteki poliakrilamid hidrojeller kullanılarak in vitro mekanik sinyallerin incelenmesi için ayrıntılı adım adım protokoller burada açıklanmıştır.

Özet

Nöral kret hücreleri (NCC'ler), çeşitli organ ve dokulara yol açan çok çeşitli hücre tiplerine göç ürebilen ve farklılaşabilen omurgalı embriyonik multipotent hücrelerdir. Doku sertliği, NCC farklılaşmasında kritik bir rol oynayan fiziksel bir işaret olan mekanik kuvvet üretir; ancak mekanizma belirsizliğini koruyor. Burada açıklanan yöntem, değişen sertlikteki poliakrilamid hidrojellerin optimize edilmiş üretimi, bu sertliğin doğru ölçümü ve vivo NCC'leri taklit eden bir NCC hattı olan O9-1 hücrelerindeki mekanik sinyallerin etkisinin değerlendirilmesi için ayrıntılı bilgi sağlar.

Hidrojel sertliği atomik kuvvet mikroskopisi (AFM) kullanılarak ölçüldü ve buna bağlı olarak farklı sertlik seviyeleri belirtildi. Değişen sertlikte hidrojeller üzerinde kültürlenen O9-1 NCC'ler, mekanik sinyal değişikliklerinin neden olduğu çeşitli biyolojik etkilere işaret eden farklı hücre morfolojisi ve stres liflerinin gen ekspresyonunun farklı olduğunu göstermiştir. Dahası, bu, hidrojel sertliğinin değiştirilmesinin, jel sertliğini değiştirerek ve NCC'lerdeki moleküler ve genetik regülasyonu analiz ederek mekanik sinyali manipüle etmek için etkili bir in vitro sistemle sonuçlendiğini ortaya çıkarmıştır. Bu nedenle, bu in vitro sistem, NCC'lerde mekanik sinyalin rolünü ve kimyasal sinyallerle etkileşimini incelemek için güçlü bir araçtır, bu da araştırmacıların sinirsel tepe gelişimi ve hastalıklarının moleküler ve genetik mekanizmalarını daha iyi anlamalarına yardımcı olacaktır.

Giriş

Nöral kret hücreleri (NCC'ler), omurgalı embriyogenez sırasında çeşitli organ ve dokuların gelişimine katkıda bulunma ve göç etme yeteneğine sahip bir grup kök hücredir. NCC'ler, eksenel kökenlinin konumuna ve NCC1,2'ninyerel çevresel rehberliğine bağlı olarak duyusal nöronlar, kıkırdak, kemik, melanositler ve düz kas hücreleri de dahil olmak üzere farklı hücre tiplerine farklılık gösterilebilir. Çok çeşitli hücre tiplerine farklılaşma yeteneği ile, nöral kret (NC) gelişiminin herhangi bir aşamasında düzensizliğe neden olan genetik anormallikler çok sayıda doğumsal hastalığa yol açabilir2. Örneğin, NCC'lerin oluşumu, göçü ve gelişimi sırasındaki pertürbasyonlar, toplu olarak nörokristopatiler olarak bilinen gelişimsel bozukluklara yol açar1,3. Bu hastalıklar, Treacher Collins sendromu gibi NCC oluşumundaki başarısızlığa bağlı kraniyofasiyal defektlerden, melanom3,4,5,6'dagörüldüğü gibi NCC metastatik göçmen yeteneğine bağlı çeşitli kanserleringelişmesinekadar uzanır. Son birkaç on yılda, araştırmacılar NCC'lerin gelişim ve hastalıklardaki rolleri ve mekanizmaları hakkında dikkat çekici keşifler yaptılar, bulguların çoğu kimyasal sinyallere odaklandı7,8. Daha yakın zamanda, mekanik sinyallerin NCC gelişiminde kritik ama iyi anlaşılmamış bir rol oynadığı belirtilmiştir9,10.

NCC'lerin çevresel ipuçları, NCC farklılaşmanın çeşitli hücre türlerine düzenlenmesi de dahil olmak üzere gelişimleri sırasında kritik bir rol oynar. Çevresel ipuçları, örneğin, fiziksel ipuçları, işlevsel çeşitlendirme gibi önemli davranışları ve hücresel yanıtları etkiler. Mechanotransduction, hücrelerin çeşitli biyolojik süreçleri sürdürmek için bu ipuçlarını hissetmelerini ve yanıt vermelerini sağlar2. NCC'ler komşu hücreler ve hücre dışı matris (ECM) gibi farklı substratlarla çevrilidir, bu da homeostazı korumak ve kader belirleme, çoğalma ve kesmez yoluyla değişikliklere uyum sağlamak için mekanik uyaranlara yol açabilir11. Mechanotransduction, mekanik hücre dışı uyaranların duyusal bileşeninin meydana geldiği plazma zarında başlar ve hücre içi düzenleme ile sonuçlanır12. Plazma zarının bütünleşimleri, odak yapışmaları ve kavşakları, kesme kuvvetleri, stres ve çevredeki substratların sertliği gibi mekanik sinyalleri hücresel yanıtlar üretmek için kimyasal sinyallere röle eder12. Plazma membranından gelen kimyasal sinyallerin son hücresel düzenlemeye aktarılması, organizma için farklılaşma gibi hayati süreçleri sonuçlandırmak için farklı sinyal yolları aracılığıyla gerçekleştirilir.

Çeşitli çalışmalar, substrat sertliğinden mekanik sinyal vermenin hücre farklılaşmasında rol oynadığını ileri sürtünmektedir13,14. Örneğin, önceki çalışmalar, beyin dokusununkine benzer bir sertliğe sahip yumuşak substratlarda yetişen mezenkimal kök hücrelerin (MSC'ler) nöronal hücre farklılaşmasına neden olduğunu göstermiştir15,16. Bununla birlikte, daha fazla MSC, kas sertliğini taklit eden 8-17 kPa substratlarında büyüdüğünde miyosit benzeri hücrelere farklılık sağlarken, MSC'ler sert substratlar üzerinde kültürlendiğinde osteoblast benzeri farklılaşma gözlenmiştir (25-40 kPa)15,16. Mekanotransdüksiyonun önemi, kanser, kardiyovasküler hastalıklar ve osteoporoz17 , 18,19dahil olmak üzere ciddi gelişimsel kusurlara ve hastalıklara yol açabilecek mekanik sinyal yollarındaki düzensizlikler ve anormallikler ile vurgulanır. Kanserlerde normal meme dokusu yumuşaktır ve meme kanseri riski artar Sert ve yoğun meme dokusunda, meme tümörlerine daha çok benzeyen bir ortam15. Bu bilgi birikimi ile, mekanik sinyalizasyonun NCC gelişimi üzerindeki etkileri, bir in vitro sistem aracılığıyla substrat sertliğinin basit manipülasyonu ile incelenebilir ve NC ile ilgili hastalığın ilerlemesinin ve etiyolojisinin temellerini anlamada daha fazla avantaj ve olasılık sağlar.

NCC'lerdeki mekanik sinyallerin etkisini incelemek için, daha önce yayınlanan yöntemlerin optimizasyonuna ve NCC'lerin farklı mekanik sinyallere verdiği yanıtların değerlendirilmesine dayanan NCC'ler için verimli bir in vitro sistem kurduk20,21. NCC'lerde mekanik sinyalizasyonun etkisinin farklı hidrojel sertliği hazırlanması ve değerlendirilmesi için ayrıntılı bir protokol sağlanmıştır. Bunu başarmak için, O9-1 NCC'ler sert ve yumuşak hidrojellere yanıt olarak etkileri ve değişiklikleri incelemek için NC modeli olarak kullanılır. O9-1 NCC'ler, 8.5. günde fare embriyosundan (E) izole edilmiş kararlı bir NC hücre hattıdır. O9-1 NCC'ler, tanımlanmış farklılaşma ortamı22'deçeşitli NC türevli hücre türlerine farklılaşabildiğinden, NCC'leri in vivo olarak taklit eder. NCC'lerin mekanik sinyallerini incelemek için, istenen sertliği elde etmek için çeşitli akrilamid ve bis-akrilamid çözelti konsantrasyonlarından ayarlanabilir elastikiyetli bir matris substratı imal edildi, biyolojik substrat sertliği20 , 21,23ile ilişkili. NCC'ler, özellikle O9-1 hücreleri için matris substrat koşullarını optimize etmek için, daha önce yayınlanan protokol20'dendeğişiklikler yapıldı. Bu protokolde yapılan bir değişiklik, kollajen I'deki hidrojelleri kuluçkaya yatırmaktı, bir gecede 50 mM HEPES yerine% 0.2 asetik asitle seyreltildi. Asetik asidin düşük pH'ı homojen bir dağılıma ve daha yüksek kollajen I bünyesine yol açar, böylece ECM proteininin daha düzgün bir şekilde bağlanmasına izin verir24. Ek olarak, hidrojelleri inkübatörde depolamadan önce, fosfat tampon salininde (PBS) sırasıyla% 10 ve% 5 konsantrasyonlarında at serumu ve fetal sığır serumu (FBS) kombinasyonu kullanılmıştır. At serumu, % 1025konsantrasyonda hücre çoğalmasını ve farklılaşmayı teşvik etme yeteneği nedeniyle FBS'ye ek bir takviye olarak kullanılmıştır.

Bu yöntemle, NCC'lerin büyümesi ve hayatta kalması için doğru bir in vitro ortam oluşturmak için ECM protein kaplaması (örneğin, Kollajen I) tarafından biyolojik bir ortam taklit edildi20,21. Hazırlanan hidrojellerin sertliği, elastik modül26'yıtasvir etmek için iyi bilinen bir teknik olan atomik kuvvet mikroskopisi (AFM) ile nicel olarak analiz edildi. Farklı sertlik seviyelerinin NCC'ler üzerindeki etkisini incelemek için, vahşi tip O9-1 hücreleri, substrat sertliğindeki değişikliklere yanıt olarak hücre yapışması ve morfolojilerindeki farklılıkları göstermek için filamentli aktilona (F-actin) karşı immünofluoresans (IF) lekelenmesi için hidrojeller üzerinde kültürlendi ve hazırlandı. Bu in vitro sistemi kullanan araştırmacılar, NCC'lerdeki mekanik sinyallemenin rollerini ve diğer kimyasal sinyallerle etkileşimini inceleyerek NCC'ler ve mekanik sinyaller arasındaki ilişkiyi daha derinlemesine anlayabilecekler.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Hidrojel hazırlama

NOT: Tüm adımlar, steriliteyi korumak için kullanılmadan önce etanol ve ultraviyole (UV) ile dezenfekte edilmiş bir hücre kültürü davlumbazında yapılmalıdır. Cımbız ve pipet gibi aletler etanol ile püskürtülmelidir. Tampon çözeltileri de steril filtrelenmelidir.

  1. Aminosilane kaplı cam kapakların hazırlanması
    1. İstediğiniz sayıda cam örtü parçasını bir laboratuvar mendilinin üzerine yerleştirin.
      NOT: Kolayca kırılırken yeterli yedekleme kaynağı sağlamak için ek bir 3-4 kapak kılıfı hazırlayın. Cam kapakların farklı malzemeleri, hücre tohumlama ve ataşmanının farklı uyumluluğunu sağlayacaktır. Denemelere başlamadan önce hangi türün denemeye en uygun olduğunu belirlemek daha iyidir (bkz. Malzeme Tablosu).
    2. Her kapak sıvısını alevden ileri geri geçirerek sterilize etmek için bir alkol yakıcı veya Bunsen brülörü kullanın (protein test deneyleri için 30 s). Her bir cam örtü kapağını soğuması için bir laboratuvar mendiline yerleştirin.
    3. Cam kapaklar soğutulduktan sonra, kaymayı önlemek için parafilm ile kaplı bir Petri kabına aktarın.
      NOT: Kapaklar yeterince serin değilse, artık ısı parafilm'i kaymaların üzerine eriterek kullanılamaz hale getirir.
    4. Kapakları sırasıyla 12 mm ve 25 mm coverlip için yaklaşık 200 μL ve 800 μL 0,1 M NaOH ile örtün ve 5 dakika bekletin. Ardından, 0,1 M NaOH'u aspire edin ve kapakların eşit bir film oluşturmak için 5 dakika daha havayla kurumasını bekleyin.
    5. Kapaklar kuruduktan sonra, pipet sırasıyla 12 mm ve 25 mm coverlips için yaklaşık 80 μL ve 150 μL 3-aminopropil triethoxysilane (APTS). Çözeltinin parafilme dökülmesini önlemeye dikkat edin. Çözeltinin 5 dakika oturmasına izin verin.
    6. Mümkün olduğunca fazla APTS'yi epire edin ve artık APTS'nin 5 dakika kurumasını bekleyin. Kapakları steril, deiyonize (DI) H 2 O'ya her seferinde5dakika boyunca üç kez batırarak iyice durulayın.
      NOT: Cam kapaklar iyi durulanmazsa, artık APTS glutaraldehit ile istenmeyen reaksiyonlara neden olur, beyaz bir çökelti oluşmasına neden olur ve kullanılamaz kapakçıklara neden olur.
    7. Kapakları, reaktif tarafı yukarı bakacak şekilde yeni bir Petri kabına taşıyın. Petri kabına kapakları tamamen kaplayacak ve kapakların 30 dakika oturmasını sağlayacak kadar% 0.5 glutaraldehit ekleyin.
    8. % 0.5 glutaraldehiti aspire edin ve kapakları bir kez DI H 2 O'da3dakika boyunca tekrar durulayın. Kapak reaktif tarafını kullanmadan önce tamamen havayla kuruması için bir laboratuvar mendiline veya temiz bir Petri kabına yerleştirin.
      NOT: Protokol burada duraklatılabilir; kapaklar kullanıma kadar steril DI H2O'ya yerleştirilmelidir.
  2. Silikon kapak örtülerinin hazırlanması
    1. Aminosilane kaplı kapaklarla aynı sayıda kapak kılıfını (adım 1.1.1) parafilm ile kaplı bir Petri kabına yerleştirin.
    2. Pipet 40 μL veya 150 μL için sırasıyla 12 mm ve 25 mm coverlips, diklorometilsilane (DCMS) kapak kapağının bir tarafına ve çözeltinin 5 dakika oturmasını sağlar.
    3. Kapak sapından kalan herhangi bir çözeltiyi epire edin, steril DI H2O'da bir kez 1 dakika yıkayın ve reaktif kapakları bir sonraki adıma geçmeden önce tamamen havayla kuruması için bir laboratuvar mendiline yerleştirin.
  3. Hidrojellerin hazırlanması
    1. Farklı sertliklerde 500 μL çözelti hazırlamak için akrilamid, bis-akrilamid ve DI H2O'yu 1,5 mL santrifüj tüpünde karıştırın (bkz. Tablo 1). Vortex çözeltisini iyice karıştırmak için 30 sn.
    2. Hızlı bir şekilde çalışarak, %10 amonyum persülfat çözeltisini (APS) ve tetrametrinediamin (TEMED) tüpe ekleyin ve çözeltileri karıştırmak için çözümleri tekrar girdaplayın.
      NOT: Taze %10 APS hazırlayın ve hassas donma/çözülme döngüsü nedeniyle buzda bırakın veya tek kullanımlık aliquots içinde dondurun.
    3. Pipet, çözeltinin yaklaşık 33 μL veya 100 μL'si, sırasıyla kurutulmuş 12 mm veya 25 mm aminosilane kaplı kapak örtülerine (bölüm 1.1) üzerine.
    4. Kavisli cımbız kullanarak, dcms ile işlenmiş kapak anahtarını hemen jel çözeltisinin üzerine yerleştirin ve işlenmiş taraf jel çözeltisine dokunur, böylece jel çözeltisini DCMS ile işlenmiş kapak ve aminosilane kaplı kapak arasında sandviç.
    5. Jel çözeltisinin 5-15 dakika polimerize olmasını sağlarken, tüpte kalan çözeltinin jel polimerizasyonunu aktif olarak takip edin.
    6. Jel polimerize edildikten sonra, DCMS ile işlenmiş kapak sapını kavisli cımbız veya jiletle ayırın ve jeli orijinal aminosilane kaplı kapak kapağına bağlı bırakın.
    7. Jelin kurumasını önlemek için, kapak sapını önceden belirlenmiş 4 kuyu/24 kuyu ve 6 kuyulu bir plakaya yerleştirin ve jelin kurumasını önlemek için sırasıyla 12 mm ve25mm kapaklar için 500 μL ve 2 mL steril PBS veya DI H 2 O ile kaplanmış.
    8. Tüm kapaklar için 1.3.4-1.3.7 adımlarını yineleyin.
    9. Fazla akrilamid çözeltisini çıkarmak için hidrojelleri steril PBS veya DI H2O'ya 30 dakika batırın. Hidrojelleri steril PBS veya DI H 2 O'da4°C'de depolayın.
    10. Karanlık bir odada, 50 mM 2-[4) 2,5 mL karıştırarak sülfosuçinidyl 6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino) heksanat (sulfo-SANPAH) karışımını hazırlayın -(2-hidroksyetil) piperazin-1-yl] etanesülfonic asit (HEPES) (pH=8.5) ile 50 μg/mL sülfo-SANPAH'ın 25 μL'si konik tüpte, ışıktan korumak için alüminyum folyoya sarılır. Kullanmadan önce çözeltiyi iyice karıştırmak için bir pipet kullanın.
      NOT: Yaklaşık yirmi beş adet 12 mm hidrojel veya beş adet 25 mm hidrojel için 2,5 mL sülfo-SANPAH çözeltisi hacmi yeterlidir.
    11. Kuyu plakasından PBS veya DI H2O'ya aspire edin. Jeli örtmek için sırasıyla 12 mm ve 25 mm kapaklar için yaklaşık 100 μL veya 500 μL sülfo-SANPAH çözeltisi (adım 1.3.10) ekleyin. Çözeltinin jeli tamamen kapladığından emin olun.
      NOT: Güçlü kuvvetin hidrojelleri parçalamasını veya rahatsız etmesini önlemek için vakum emme mukavemetini ayarlayın.
    12. Çözeltili jelleri, sülfo-SANPAH ile reaksiyona sokan UV ışığının herhangi bir parazitini en aza indirmek için 10 dakika boyunca 15 W, 365 nm UV ışığın altına yerleştirin.
    13. Çözeltinin mümkün olduğunca çoğunu toplamak için plakayı yatırarak fazla sülfo-SANPAH'ı aspire edin. Jeli 50 mM HEPES ile iki ila üç kez yıkayın.
    14. Hidrojel içeren her kuyuya% 0.2 asetik asitle seyrelttiğim 50 mg / mL kollajen sırasıyla 12 mm ve 25 mm jeller için 500 μL ve 2 mL ekleyin. Jellerin 37 °C, %5 CO2 inkübatörde gece boyunca kuluçkaya yatmasına izin verin.
      NOT: Kollajen I'in homojen dağılımını ve bağlanmasını teşvik etmek için kollajen I'i 50 mM HEPES yerine% 0.2 asetik asitte seyreltin.
    15. Kollajen I'i epire edin ve her yıkamada 5 dakika boyunca fazla kollajen I'i çıkarmak için jelleri steril PBS ile üç kez yıkayın. PBS'deki hidrojelleri % 10 at serumu, 37 ° C'de 2 h için% 5 FBS, % 5 CO2 inkübatörü ile kuluçkaya yatırın.
      NOT: %10 at serumunun eklenmesi, önceki yayında olduğu gibi sadece FBS kullanmaya kıyasla daha yüksek çoğalma sağlar.
    16. Ortamı aspire edin. Her kuyuya %10 FBS ve %1 penisilin-streptomisin (P/S) ile 500 mL steril filtreli Dulbecco Modifiye Kartal Orta (DMEM) ekleyin. Jelleri hücre kültürüne hazır olana kadar 37 °C,%5 CO 2 inkübatörde saklayın.
    17. Hazır olduktan sonra kültür yemeklerinde bazal ortamda yaklaşık 1,5 ×10 4 O9-1 hücre/cm2 tabaklayın. Hücreleri 37 °C'de bir inkübatörde 2 gün kuluçkaya yatır, %5 CO2. Hücrelerin jellere yeterince bağlı olduğundan ve analiz için toplanmadan önce hücre sayısının yeterli olduğundan emin olmak için hücrelerin izleniyor.
      NOT: O9-1 hücrelerinin20'ninkurtarılması, geçirilmesi ve toplanması adımları için daha önce yayımlanmİş protokole bakın.
    18. Hidrojellerin daha fazla analizi için bölüm 2, 3 veya 4'e geçin.

2. AFM ile sertliğin nicel analizi

  1. AFM sistem bilgisayarını ve ardından AFM denetleyicisini başlatın (Bkz. Malzeme Tablosu).
  2. AFM cantilever'i AFM prob tutucusuna monte edin. Yamyamın sonuna monte edilmiş 0,5 μm silika boncuklu küresel bir dokunsal kapitilat kullanın (küresel boncuklu dokunsal).
    NOT: 10 kPa, 20 kPa ve 40 kPa gibi daha sert hidrojeller için, 0,24 N/m yay sabiti ile daha sert bir prob kullanılmıştır. 0,5 kPa ve 1 kPa gibi daha yumuşak hidrojeller için 0,059 N/m yay sabiti ile daha yumuşak bir prob kullanılmıştır.
  3. AFM yazılımını kişi modu altında ayarlayın.
  4. Silikon gofreti AFM örnek aşamasına monte ederek kuvvet eğrilerini toplayın, ancak silikon substrata dokunmak için düğmeye tıklayarak kuvvet eğrilerini üretin.
  5. Kalibrasyon için yukarıdaki kuvvet eğrilerini (2,4) kullanın, termal ayar koşulu altında kantileverin ortalama yay sabitini elde etmek için kontrol yazılımındaki Kalibrasyon'a tıklayın ve kalibre edilmiş değerleri kontrol yazılımına kaydedin.
  6. Kapak kapağını ekli hidrojel ile 60 mm Petri kabına AFM tarama aşamasına yerleştirerek numuneleri monte edin. Jelin kurumasını önlemek için ölçümler yapmadan önce yemeğe 3 mL PBS ekleyin.
  7. Ölçümü başlatmak için AFM'yi temas modunda (akışkan) çalışacak şekilde ayarlayın. Jel örneğine sürekli dokunmak ve kaldırmak için küresel belayı devreye alın.
  8. Ayar setini, sapma eşiği 10 nm'de olacak şekilde ayarlayın. Sondanın rampa boyutunu 10 μm'de tutun. Ardından, kuvvet eğrilerini adım 2.4'te olduğu gibi kaydedin.
  9. Hidrojel yüzeyinde en az 3 ila 10 farklı noktadan en az 20 kuvvet eğrisi elde edin.
  10. AFM görüntüleme ve analiz yazılımıyla her nokta için ortalama Young'ın ~20 kuvvet eğrisi modüllerini hesaplayın. Uzatma rampa kuvveti eğrileri ve doğrusal bir model (küresel) kullanın. Son sertliği elde etmek için her numune için tüm noktaların ortalamasını hesaplayın.
    NOT: Young'ın modülü ve ilgili verileri(yani standart sapmalar) otomatik olarak elektronik tablo olarak kaydedilir.
  11. Tüm örnekler için 2.6-2.10 adımlarını yineleyin.

3. İmmünoresans lekeleme yoluyla sertliğin moleküler analizi

  1. Doğrudan plakaya yetiştirilen hücrelerden gelen yanlış sinyalleri en aza indirmek için kapak kapağını yeni bir tabağa taşımak için cımbız kullanın. Ölü hücreleri ve kalan kültür ortamlarını çıkarmak için hücreleri 500 μL steril PBS ile üç kez yıkayın.
  2. Hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca bozulmadan 500 μL% 4 paraformaldehit (PFA) kullanarak sabitlayın. Ardından, her biri 2 dakika boyunca 500 μL PBS / kuyu kullanarak hücreleri üç kez yeniden yıkayın.
    NOT: Prosedürel bir durak için 4 °C'de saklayın.
  3. Hücreleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca % 0,1 Triton X-100'ün 500 μL'si ile tedavi edin. Ardından, hücreleri 500 μL PBS / kuyu ile üç kez yıkayın.
  4. Hücreleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca kuyu başına %10 eşek serumu (PBS'de seyreltilmiş ve%0,1 Ara 20) ile 250 μL ile tıkayın.
  5. Hücreleri oda sıcaklığında 2 saat boyunca veya 4 °C'de gece boyunca 250 μL birincil antikorla kuluçkaya yatırın. Ardından, hücreleri her biri 5 dakika boyunca 500 μL PBS / kuyu ile üç kez yıkayın.
    NOT: Bu deneyde Anti-Vinculin (Vcl) (1:250) ve anti-AP2 alfa (1:250) kullanılmış ve %10 eşek serumunda seyreltilmiştir.
  6. Hücreleri, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 10 eşek serumunun 250 μL'sinde 1:400 seyreltmede F-akrin lekeleme için kullanılan ikincil antikorlar ve / veya phalloidin ile kuluçkaya yatırın. Ardından, hücreleri PBS ile her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
    NOT: 568 nm Phalloidin, 488 nm veya 647 nm sekonder antikorlarla veya kendi başına ortaklaşa kuluçkalanabilir.
  7. Hücreleri 4′, 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI, 1:1000 seyreltme) ile 250 μL PBS'de 10 dakika kuluçkaya yatırın ve ardından 2 dakika boyunca pbs'nin son bir yıkaması.
  8. Her kuyuya 3-4 damla montaj ortamı ekleyin. Montaj ortamının düzgün ayarlandığından emin olmak için görüntülemeden önce en az 2 saat ayarlamak için numuneleri 4 °C'de saklayın.
  9. Floresan mikroskopla hidrojel numune başına en az 3 rastgele karenin görüntülerini yakalayın, bireysel ve birleştirilmiş kanallar üretin.

4. Nicel gerçek zamanlı PCR (RT-qPCR)

  1. Hücre plakasına bağlı hücrelerden istenmeyen RNA'yı en aza indirmek için RNA toplama için yapışık hücrelere sahip hidrojelleri yeni bir tabağa aktarın. Ölü hücreleri ve kültür ortamını çıkarmak için hücreleri PBS ile üç kez yıkayın.
  2. Bir RNA çıkarma kiti kullanarak toplam mRNA'yı çıkarın. Üreticinin talimatlarını izleyerek ters transkripsiyon süpermiksi kullanarak RNA'dan cDNA'ya ters transkripsiyon gerçekleştirin.
  3. Rt-qPCR'yi Vcl için astarlarla tercih ettiği sertlik göstergesi olarak gerçekleştirin ve 2-ΔΔCT yöntemini kullanarak analiz edin.
    NOT: Vcl'nin astar dizisi: İleri 5' GCTTCAGTCAGACCCCACTCG 3'; ters 5' AGGTAAGCAGTAGGTCAGATGT 3'.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

AFM ve Hertz modeli ile hidrojel hazırlama ve sertlik değerlendirmesi
Burada akrilamid ve bis-akrilamid oranını düzenleyerek değişen sertlikte poliakrilamid hidrojeller üretmek için ayrıntılı bir protokol sağlanmaktadır. Bununla birlikte, poliakrilamid hidrojeller ECM proteinlerinin eksikliği nedeniyle hücrelerin yapıştırılmasına hazır değildir. Böylece, bir bağlayıcı olarak hareket eden sulfo-SANPAH, UV aktivasyonundan sonra sülfo-SANPAH'taki N-hidroksisuçinid es...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Mevcut çalışmanın amacı, NCC'lerdeki mekanik sinyallerin etkisini daha iyi anlamak için etkili ve verimli bir in vitro sistem sağlamaktır. Yukarıda belirtilen adım adım protokolü takip ederek, araştırmacıların O9-1 NCC'lerin hücre kültürünün hidrojel hazırlamak için kullanılan cam kapakların türünden etkilendiğini akılda tutmaları gerekir. Örneğin, belirli bir cam kapak kapağı türüne tohumlanmış hücrelerin (Bkz. Malzeme Tablosu)hayatta kaldığı ve iyi ço...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.

Teşekkürler

Teksas Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Atomik Kuvvet Mikroskop-UT Çekirdek tesisinin işletmecisi Dr. Ana-Maria Zaske'ye bu projede AFM'ye katkı sağlayan uzmanlığı için teşekkür ederiz. Ayrıca Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin (K01DE026561, R03DE025873, R01DE029014, R56HL142704 ve R01HL142704'ten J. Wang'a) finansman kaynaklarına teşekkür ederiz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
12 mm #1 Corning 0211 Glass CoverslipChemglass Life SciencesCLS-1763-012
2% Bis-AcrylamideSigma AldrichM1533
24-well plateGreiner Bio-one662165
25 mm #1 Corning 0211 Glass CoverslipChemglass Life SciencesCLS-1763-025
3-aminopropyl triethoxysilane (APTS)Sigma AldrichA3648
4-well cell culture plateThermo Scientific179830
4% ParaformaldehydeSigma AldrichJ61899-AP
40% AcrylamideSigma AldrichA4058
50% glutaraldehydeSigma AldrichG7651
6-well cell culture plateGreiner Bio-one657160
AFM cantilever (spherical bead)Novascan
AFM softwareCatalyst NanoScopeModel: 8.15 SR3R1
Alexa Fluor 488 PhalloidinThermo FisherA12379
Ammonium Persulfate (APS)Sigma Aldrich248614Powder
anti-AP-2α AntibodySanta Cruzsc-12726
anti-Vinculin antibodyAbcamab129002
Atomic Force Microscopy (AFM) Bioscope CatalystBruker Corporation
Collagen type I (100mg)Corning354236
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)Thermo FisherD1306
Dichloromethylsilane (DCMS)Sigma Aldrich440272
Donkey serumSigma AldrichD9663
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Corning10-017-CV
Fetal bovine serum (FBS)Corning35-010-CV
Fluorescence microscopeLeicaModel DMi8
Fluoromount-G mounting mediumSouthernBiotech0100-35
HEPESSigma AldrichH3375Powder
Horse serumCorning35-030-CI
iScript Reverse Transcription SupermixBio-Rad1708841
Penicillin-Streptomycin antibioticThermo Fisher15140148
RNeasy micro kitQiagen74004
Sterile 1x PBSHycloneSH30256.02
Sterile deionized waterHardy DiagnosticsU284
sulfo-SANPAHThermo Fisher22589
SYBR greenApplied Biosystems4472908
TEMEDSigma AldrichT9281
Triton X-100Sigma AldrichX100
Tween 20Sigma AldrichP9416

Referanslar

  1. Mehrotra, P., Tseropoulos, G., Bronner, M. E., Andreadis, S. T. Adult tissue-derived neural crest-like stem cells: Sources, regulatory networks, and translational potential. Stem Cells Translational Medicine. 9 (3), 328-341 (2020).
  2. Liu, J. A., Cheung, M. Neural crest stem cells and their potential therapeutic applications. Developmental Biology. 419 (2), 199-216 (2016).
  3. Watt, K. E. N., Trainor, P. A. Neurocristopathies: the etiology and pathogenesis of disorders arising from defects in neural crest cell development. Neural Crest Cells-Evolution, Development and Disease. Trainor, P. A. , Academic Press. 361-394 (2014).
  4. Lavelle, C. L. B. Applied oral physiology. , Butterworth-Heinemann. (1988).
  5. Chin, L. The genetics of malignant melanoma: lessons from mouse and man. Nature Reviews Cancer. 3 (8), 559-570 (2003).
  6. Hindley, C. J., et al. The Hippo pathway member YAP enhances human neural crest cell fate and migration. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
  7. Wang, Q., et al. Perturbed development of cranial neural crest cells in association with reduced sonic hedgehog signaling underlies the pathogenesis of retinoic-acid-induced cleft palate. Disease Models & Mechanisms. 12 (10), (2019).
  8. Rocha, M., Singh, N., Ahsan, K., Beiriger, A., Prince, V. E. Neural crest development: insights from the zebrafish. Developmental Dynamics. 249 (1), 88-111 (2020).
  9. Barriga, E. H., Franze, K., Charras, G., Mayor, R. Tissue stiffening coordinates morphogenesis by triggering collective cell migration in vivo. Nature. 554 (7693), 523-527 (2018).
  10. Weber, G. F., Bjerke, M. A., DeSimone, D. W. A mechanoresponsive cadherin-keratin complex directs polarized protrusive behavior and collective cell migration. Developmental Cell. 22 (1), 104-115 (2012).
  11. Mason, D. E., et al. YAP and TAZ limit cytoskeletal and focal adhesion maturation to enable persistent cell motility. Journal of Cell Biology. 218 (4), 1369-1389 (2019).
  12. Dupont, S., et al. Role of YAP/TAZ in mechanotransduction. Nature. 474 (7350), 179-183 (2011).
  13. Lu, Y. -B., et al. Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (47), 17759-17764 (2006).
  14. Georges, P. C., Miller, W. J., Meaney, D. F., Sawyer, E. S., Janmey, P. A. Matrices with compliance comparable to that of brain tissue select neuronal over glial growth in mixed cortical cultures. Biophysical Journal. 90 (8), 3012-3018 (2006).
  15. Janmey, P. A., Miller, R. T. Mechanisms of mechanical signaling in development and disease. Journal of Cell Science. 124 (1), 9-18 (2011).
  16. Engler, A., Sweeney, H., Discher, D., Schwarzbauer, J. E. Extracellular matrix elasticity directs stem cell differentiation. Journal of Musculoskeletal and Neuronal Interactions. 7 (4), 335(2007).
  17. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
  18. Engler, A. J., et al. Embryonic cardiomyocytes beat best on a matrix with heart-like elasticity: scar-like rigidity inhibits beating. Journal of Cell Science. 121 (22), 3794-3802 (2008).
  19. Robling, A. G., Turner, C. H. Mechanical signaling for bone modeling and remodeling. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 19 (4), 319-338 (2009).
  20. Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 10, Unit 10.16 (2010).
  21. Cretu, A., Castagnino, P., Assoian, R. Studying the effects of matrix stiffness on cellular function using acrylamide-based hydrogels. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2089(2010).
  22. Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
  23. Engler, A., et al. Substrate compliance versus ligand density in cell on gel responses. Biophysical Journal. 86 (1), 617-628 (2004).
  24. Stanton, A. E., Tong, X., Yang, F. Varying solvent type modulates collagen coating and stem cell mechanotransduction on hydrogel substrates. APL Bioengineering. 3 (3), 036108(2019).
  25. Fedoroff, S., Hall, C. Effect of horse serum on neural cell differentiation in tissue culture. In vitro. 15 (8), 641-648 (1979).
  26. Huth, S., Sindt, S., Selhuber-Unkel, C. Automated analysis of soft hydrogel microindentation: Impact of various indentation parameters on the measurement of Young's modulus. PLoS One. 14 (8), 0220281(2019).
  27. Mitchell, P. J., Timmons, P. M., Hébert, J. M., Rigby, P., Tjian, R. Transcription factor AP-2 is expressed in neural crest cell lineages during mouse embryogenesis. Genes & Development. 5 (1), 105-119 (1991).
  28. Wegner, M. Neural crest diversification and specification: transcriptional control of Schwann Cell differentiation. Encyclopedia of Neuroscience. , 153-158 (2010).
  29. Park, J. S., et al. The effect of matrix stiffness on the differentiation of mesenchymal stem cells in response to TGF-β. Biomaterials. 32 (16), 3921-3930 (2011).
  30. Sun, M., et al. Effects of matrix stiffness on the morphology, adhesion, proliferation and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. International Journal of Medical Sciences. 15 (3), 257(2018).
  31. Burridge, K., Guilluy, C. Focal adhesions, stress fibers and mechanical tension. Experimental Cell Research. 343 (1), 14-20 (2016).
  32. Burridge, K. Focal adhesions: a personal perspective on a half century of progress. The FEBS Journal. 284 (20), 3355-3361 (2017).
  33. Zhou, C., et al. Compliant substratum modulates vinculin expression in focal adhesion plaques in skeletal cells. International Journal of Oral Science. 11 (2), 1-9 (2019).
  34. Fernández, J. L. R., Geiger, B., Salomon, D., Ben-Ze'ev, A. Overexpression of vinculin suppresses cell motility in BALB/c 3T3 cells. Cell Motility and the Cytoskeleton. 22 (2), 127-134 (1992).
  35. Coll, J., et al. Targeted disruption of vinculin genes in F9 and embryonic stem cells changes cell morphology, adhesion, and locomotion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9161-9165 (1995).
  36. Saunders, R. M., et al. Role of vinculin in regulating focal adhesion turnover. European Journal of Cell Biology. 85 (6), 487-500 (2006).
  37. Kuo, J. -C. Focal adhesions function as a mechanosensor. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 126, 55-73 (2014).
  38. Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58346(2018).
  39. Kolewe, K. W., Zhu, J., Mako, N. R., Nonnenmann, S. S., Schiffman, J. D. Bacterial adhesion is affected by the thickness and stiffness of poly (ethylene glycol) hydrogels. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (3), 2275-2281 (2018).
  40. Lin, Y. -C., et al. Mechanosensing of substrate thickness. Physical Review E. 82 (4), 041918(2010).
  41. Mullen, C. A., Vaughan, T. J., Billiar, K. L., McNamara, L. M. The effect of substrate stiffness, thickness, and cross-linking density on osteogenic cell behavior. Biophysical Journal. 108 (7), 1604-1612 (2015).
  42. Tusan, C. G., et al. Collective cell behavior in mechanosensing of substrate thickness. Biophysical Journal. 114 (11), 2743-2755 (2018).
  43. McBurney, M. W., Jones-Villeneuve, E. M., Edwards, M. K., Anderson, P. J. Control of muscle and neuronal differentiation in a cultured embryonal carcinoma cell line. Nature. 299 (5879), 165-167 (1982).
  44. Hasegawa, A., Shirayoshi, Y. P19 cells overexpressing Lhx1 differentiate into the definitive endoderm by recapitulating an embryonic developmental pathway. Yonago Acta Medica. 58 (1), 15(2015).
  45. Wells, R. G. Tissue mechanics and fibrosis. Biochimica et Biophysica Acta. 1832 (7), 884-890 (2013).
  46. Gavara, N. A beginner's guide to atomic force microscopy probing for cell mechanics. Microscopy Research and Technique. 80 (1), 75-84 (2017).
  47. Butler, J. P., Tolic-Nørrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
  48. Leong, W. S., et al. Thickness sensing of hMSCs on collagen gel directs stem cell fate. Biochemical and Biophysical Research Communications. 401 (2), 287-292 (2010).
  49. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
  50. Funaki, M., Janmey, P. A. Technologies to engineer cell substrate mechanics in hydrogels. Biology and Engineering of Stem Cell Niches. , Academic Press. 363-373 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geli imsel BiyolojiSay 174n ral kret h crelerimekanik sinyallerO9 1 h creleriatomik kuvvet mikroskopisi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır