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Resumen

Aquí se describen protocolos detallados paso a paso para estudiar señales mecánicas in vitro utilizando células de cresta neural O9-1 multipotentes e hidrogeles de poliacrilamida de rigidez variable.

Resumen

Las células de la cresta neural (NCC) son células multipotentes embrionarias de vertebrados que pueden migrar y diferenciarse en una amplia gama de tipos de células que dan lugar a diversos órganos y tejidos. La rigidez tisular produce fuerza mecánica, una señal física que juega un papel crítico en la diferenciación de NCC; sin embargo, el mecanismo sigue sin estar claro. El método descrito aquí proporciona información detallada para la generación optimizada de hidrogeles de poliacrilamida de rigidez variable, la medición precisa de dicha rigidez y la evaluación del impacto de las señales mecánicas en las células de O9-1, una línea NCC que imita a los NCC in vivo.

La rigidez del hidrogel se midió mediante microscopía de fuerza atómica (AFM) e indicó diferentes niveles de rigidez en consecuencia. Los NCC de O9-1 cultivados en hidrogeles de rigidez variable mostraron una morfología celular y una expresión génica diferentes de las fibras de estrés, lo que indicó efectos biológicos variables causados por cambios en las señales mecánicas. Además, esto estableció que la variación de la rigidez del hidrogel dio como resultado un sistema in vitro eficiente para manipular la señalización mecánica alterando la rigidez del gel y analizando la regulación molecular y genética en nccs. O9-1 NCCs pueden diferenciarse en una amplia gama de tipos de células bajo la influencia de los medios de diferenciación correspondientes, y es conveniente manipular señales químicas in vitro. Por lo tanto, este sistema in vitro es una herramienta poderosa para estudiar el papel de la señalización mecánica en los NCC y su interacción con las señales químicas, lo que ayudará a los investigadores a comprender mejor los mecanismos moleculares y genéticos del desarrollo de la cresta neural y las enfermedades.

Introducción

Las células de la cresta neural (NCC) son un grupo de células madre durante la embriogénesis de vertebrados con una notable capacidad para migrar y contribuir al desarrollo de diversos órganos y tejidos. Los NCC pueden diferenciarse en diferentes tipos de células, incluidas las neuronas sensoriales, el cartílago, el hueso, los melanocitos y las células del músculo liso, dependiendo de la ubicación del origen axial y la orientación ambiental local del NCC1,2. Con la capacidad de diferenciarse en una amplia gama de tipos de células, las anomalías genéticas que causan desregulación en cualquier etapa del desarrollo de la cresta neural (NC) pueden conducir a numerosas enfermedades congénitas2. Por ejemplo, las perturbaciones durante la formación, migración y desarrollo de las NCC conducen a trastornos del desarrollo conocidos colectivamente como neurocristopatías1,3. Estas enfermedades van desde defectos craneofaciales debido a fallas en la formación de NCC, como el síndrome de Treacher Collins, hasta el desarrollo de varios cánceres debido a la capacidad migratoria metastásica de NCC, como se ve en el melanoma3,4,5,6. En las últimas décadas, los investigadores han hecho descubrimientos notables sobre los roles y mecanismos de los NCC en el desarrollo y las enfermedades, y la mayoría de los hallazgos se centran en las señales químicas7,8. Más recientemente, se ha indicado que las señales mecánicas desempeñan un papel crítico pero poco comprendido en el desarrollo de NCC9,10.

Las señales ambientales de los NCC juegan un papel crítico durante su desarrollo, incluida la regulación de la diferenciación de NCC en varios tipos de células. Las señales ambientales, por ejemplo, las señales físicas, influyen en los comportamientos fundamentales y las respuestas celulares, como la diversificación funcional. La mecanotransducción permite a las células detectar y responder a esas señales para mantener diversos procesos biológicos2. Los NCC están rodeados de células vecinas y diferentes sustratos, como la matriz extracelular (ECM), que puede dar lugar a estímulos mecánicos para mantener la homeostasis y adaptarse a los cambios a través de la determinación del destino, la proliferación y la apoptosis11. La mecanotransducción comienza en la membrana plasmática donde se produce el componente sensorial de los estímulos mecánicos extracelulares, dando lugar a la regulación intracelular de la célula12. Las integrinas, las adherencias focales y las uniones de la membrana plasmática transmiten señales mecánicas, como las fuerzas de cizallamiento, la tensión y la rigidez de los sustratos circundantes, en señales químicas para producir respuestas celulares12. La retransmisión de señales químicas desde la membrana plasmática hasta la regulación celular final se lleva a cabo a través de diferentes vías de señalización para finalizar procesos vitales para el organismo, como la diferenciación.

Varios estudios han sugerido que la señalización mecánica de la rigidez del sustrato juega un papel en la diferenciación celular13,14. Por ejemplo, estudios previos han demostrado que las células madre mesenquimales (MSC) cultivadas en sustratos blandos con una rigidez similar a la del tejido cerebral (en el rango de 0.1-1.0 kPa) resultaron en la diferenciación de células neuronales15,16. Sin embargo, más MSC se diferencian en células similares a los miocitos cuando se cultivan en sustratos de 8-17 kPa que imitan la rigidez del músculo, mientras que la diferenciación similar a los osteoblastos se observó cuando las MSC se cultivaron en sustratos rígidos (25-40 kPa)15,16. La importancia de la mecanotransducción se destaca por las irregularidades y anomalías en la vía de señalización mecánica que potencialmente conducen a defectos y enfermedades graves del desarrollo, incluidos el cáncer, las enfermedades cardiovasculares y la osteoporosis17,18,19. En los cánceres, el tejido mamario normal es blando, y el riesgo de cáncer de mama aumenta en el tejido mamario rígido y denso, un ambiente que es más parecido a los tumores de mama15. Con este conocimiento, los efectos de la señalización mecánica en el desarrollo de NCC se pueden estudiar a través de la manipulación simple de la rigidez del sustrato a través de un sistema in vitro, proporcionando más ventajas y posibilidades para comprender los fundamentos de la progresión y etiología de la enfermedad relacionada con NC.

Para estudiar el impacto de las señales mecánicas en los NCC, establecimos un sistema in vitro eficiente para ncCs basado en la optimización de métodos previamente publicados y la evaluación de las respuestas de los NCCs a diferentes señales mecánicas20,21. Se proporcionó un protocolo detallado para la preparación de la rigidez variable del hidrogel y la evaluación del impacto de la señalización mecánica en los NCC. Para lograr esto, los NCC O9-1 se utilizan como modelo NC para estudiar los efectos y cambios en la respuesta a los hidrogeles rígidos frente a los blandos. Los NCC O9-1 son una línea celular NC estable aislada del embrión de ratón (E) en el día 8.5. Los NCC de O9-1 imitan a los NCC in vivo porque pueden diferenciarse en varios tipos de células derivadas de NC en medios de diferenciación definidos22. Para estudiar la señalización mecánica de los NCC, se fabricó un sustrato de matriz con elasticidad sintonizable a partir de concentraciones variables de soluciones de acrilamida y bisacrilamida para lograr la rigidez deseada, correlacionándose con la rigidez biológica del sustrato20,21,23. Para optimizar las condiciones de sustrato matricial para NCCs, específicamente células O9-1, se realizaron modificaciones a partir del protocolo20previamente publicado. Un cambio realizado en este protocolo fue incubar hidrogeles en colágeno I, diluidos en ácido acético al 0,2% en lugar de 50 mM HEPES, a 37 °C durante la noche. El bajo pH del ácido acético conduce a una distribución homogénea y una mayor incorporación de colágeno I, lo que permite una unión más uniforme de la proteína ECM24. Además, se utilizó una combinación de suero de caballo y suero fetal bovino (FBS) en las concentraciones de 10% y 5% en solución salina tampón de fosfato (PBS), respectivamente, antes de almacenar los hidrogeles en la incubadora. El suero de caballo se utilizó como un suplemento adicional a FBS debido a su capacidad para promover la proliferación y diferenciación celular a la concentración de 10%25.

Con este método, un entorno biológico fue imitado por el recubrimiento de proteína ECM (por ejemplo, colágeno I) para crear un entorno in vitro preciso para que los NCC crezcan y sobrevivan20,21. La rigidez de los hidrogeles preparados se analizó cuantitativamente mediante microscopía de fuerza atómica (AFM), una técnica bien conocida para representar el módulo elástico26. Para estudiar el efecto de diferentes niveles de rigidez en los NCC, se cultivaron células O9-1 de tipo salvaje y se prepararon en hidrogeles para la tinción de inmunofluorescencia (IF) contra la actina filamentosa (F-actina) para mostrar las diferencias en la adhesión celular y las morfologías en respuesta a los cambios en la rigidez del sustrato. Utilizando este sistema in vitro, los investigadores podrán estudiar las funciones de la señalización mecánica en los NCC y su interacción con otras señales químicas para obtener una comprensión más profunda de la relación entre los NCC y la señalización mecánica.

Protocolo

1. Preparación de hidrogel

NOTA: Todos los pasos deben realizarse en una campana de cultivo celular que haya sido desinfectada con etanol y ultravioleta (UV) esterilizado antes de su uso para mantener la esterilidad. Las herramientas, como pinzas y pipetas, deben rociarse con etanol. Las soluciones tampón también deben ser filtradas estérilmente.

  1. Preparación de fundas de vidrio recubiertas de aminosilano
    1. Coloque el número deseado de hojas de cubierta de vidrio en un trozo de toallita de laboratorio.
      NOTA: Prepare 3-4 cubiertas adicionales para garantizar suficientes suministros de respaldo a medida que se rompen fácilmente. Los diferentes materiales de las cubiertas de vidrio producirán una compatibilidad diferente de siembra y fijación celular. Es mejor determinar qué tipo se adapta mejor al experimento antes de comenzar los experimentos (consulte la Tabla de materiales).
    2. Use un quemador de alcohol o un quemador Bunsen para esterilizar cada hoja de cubierta pasándola de un lado a otro a través de la llama (30 s para experimentos de ensayo de proteínas). Coloque cada funda de vidrio en una toallita de laboratorio para enfriar.
    3. Una vez que las cubiertas de vidrio se hayan enfriado, transfiéralas a una placa de Petri forrada con parafilm para evitar el deslizamiento.
      NOTA: Si las cubiertas no están lo suficientemente frías, el calor residual derretirá la parapelícula en los resbalones, dejándolos inutilizables.
    4. Cubra los cubrecolchas con aproximadamente 200 μL y 800 μL de 0,1 M NaOH para un funda de 12 mm y 25 mm, respectivamente, y déjelos reposar durante 5 min. Luego, aspire el NaOH de 0.1 M y deje que las cubiertas se sequen al aire durante otros 5 minutos para formar una película uniforme.
    5. Una vez que se secan los cubrebocas, pipetee aproximadamente 80 μL y 150 μL de 3-aminopropil trietoxisilano (APTS) para los cobertores de 12 mm y 25 mm, respectivamente. Tenga cuidado de evitar derramar la solución sobre la parapelícula. Deje que la solución repose durante 5 minutos.
    6. Aspire la mayor cantidad de exceso de APTS como sea posible y deje que el APTS residual se seque durante 5 minutos. Enjuague bien los cubrehojas sumergiéndolos en estériles desionizados (DI) H2O tres veces durante 5 minutos cada vez.
      NOTA: Si las cubiertas de vidrio no se enjuagan bien, el APTS residual causa reacciones no deseadas con glutaraldehído, lo que hace que se forme un precipitado blanco y da como resultado un deslizamiento inutilizable.
    7. Mueva los cubrehojas a una nueva placa de Petri con el lado reactivo hacia arriba. Agregue suficiente glutaraldehído al 0.5% a la placa de Petri para cubrir los cubrecolchas por completo y permita que los cubrecolchas se asienten durante 30 minutos.
    8. Aspire el glutaraldehído al 0,5% y enjuague las hojas de cubierta nuevamente en DI H2O una vez durante 3 min. Coloque el lado reactivo de los cubrehojas hacia arriba en una toallita de laboratorio o una placa de Petri limpia para que se seque completamente al aire antes de usarlo.
      NOTA: El protocolo se puede pausar aquí; Las fundas deben colocarse en DI H2O estéril hasta su uso.
  2. Preparación de fundas siliconadas
    1. Coloque el mismo número de fundas que las fundas recubiertas de aminosilano (paso 1.1.1) en una placa de Petri forrada con parafilm.
    2. Pipetear 40 μL o 150 μL para fundas de 12 mm y 25 mm, respectivamente, de diclorometilsilano (DCMS) a un lado de la cubierta y dejar reposar la solución durante 5 min.
    3. Aspire cualquier solución restante de la cubierta, lave en DI H2O estéril una vez durante 1 minuto y coloque las hojas de cubierta reactivas boca arriba en una toallita de laboratorio para que se sequen completamente al aire antes de pasar al siguiente paso.
  3. Preparación de hidrogeles
    1. Mezcle acrilamida, bisacrilamida y DI H2O en un tubo de centrífuga de 1,5 ml para preparar 500 μL de soluciones con rigidezs variables (ver Tabla 1). Vórtice la solución durante 30 s para mezclarla a fondo.
    2. Trabajando rápidamente, agregue la solución de persulfato de amonio al 10% (APS) y la tetrametilendiamina (TEMED) al tubo y vórtice las soluciones nuevamente para mezclar las soluciones.
      NOTA: Prepare un 10% de APS fresco y déjelo en hielo o congele en alícuotas de un solo uso debido a su ciclo de congelación / descongelación sensible.
    3. Pipetear aproximadamente 33 μL o 100 μL de la solución sobre las fundas recubiertas de aminosilano secas de 12 mm o 25 mm (sección 1.1), respectivamente.
    4. Usando pinzas curvas, coloque inmediatamente el coverslip tratado con DCMS sobre la solución de gel con el lado tratado tocando la solución de gel, intercalando así la solución de gel entre el coverslip tratado con DCMS y el coverlip recubierto de aminosilano.
    5. Deje que la solución de gel polimerice durante 5-15 minutos, mientras monitorea activamente la polimerización en gel de la solución sobrante en el tubo.
    6. Una vez polimerizado el gel, separe el estuche tratado con DCMS con pinzas curvas o una cuchilla de afeitar, dejando el gel unido a la funda original recubierta de aminosilano.
    7. Coloque inmediatamente la cubierta con el hidrogel conectado en una placa predeterminada de 4 pocillos/24 pocillos y 6 pocillos cubierta con 500 μL y 2 ml de PBS estéril o DI H2O para fundas de 12 mm y 25 mm, respectivamente, para evitar que el gel se seque.
    8. Repita los pasos 1.3.4-1.3.7 para todas las fundas.
    9. Sumergir los hidrogeles en PBS estéril o DI H2O durante 30 min para eliminar el exceso de solución de acrilamida. Guarde los hidrogeles en PBS estéril o DI H2O a 4 °C para una parada de procedimiento aquí.
    10. En una habitación oscura, prepare la mezcla de sulfosuccinimidyl 6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino) hexanoate (sulfo-SANPAH) mezclando 2.5 mL de 50 mM 2-[4-(2-hidroxietil) piperazina-1-il] ácido etanosulfónico (HEPES) (pH=8.5) con 25 μL del sulfo-SANPAH de 50 μg/mL en un tubo cónico, envuelto en papel de aluminio para protegerlo de la luz. Use una pipeta para mezclar bien la solución antes de usarla.
      NOTA: Un volumen de 2,5 ml de solución de sulfo-SANPAH es suficiente para aproximadamente veinticinco hidrogeles de 12 mm o cinco hidrogeles de 25 mm.
    11. Aspire PBS o DI H2O de la placa del pozo. Añadir aproximadamente 100 μL o 500 μL para las fundas de 12 mm y 25 mm, respectivamente, de solución de sulfo-SANPAH (paso 1.3.10) para cubrir el gel. Asegúrese de que la solución cubra el gel por completo.
      NOTA: Ajuste la fuerza de succión al vacío para evitar que la fuerza fuerte rasgue o perturbe los hidrogeles.
    12. Coloque los geles con la solución bajo una luz UV de 15 W, 365 nm durante 10 min, descubierta para minimizar cualquier interferencia de la luz UV que reacciona con el sulfo-SANPAH.
    13. Aspire el exceso de sulfo-SANPAH inclinando la placa para recoger la mayor cantidad posible de la solución. Lave el gel con HEPES de 50 mM dos o tres veces.
    14. Añadir 500 μL y 2 mL para geles de 12 mm y 25 mm, respectivamente, de 50 mg/ml de colágeno I diluido en ácido acético al 0,2% a cada pocillo que contenga el hidrogel. Deje que los geles se incuben durante la noche en una incubadora de 37 ° C, 5% de CO2.
      NOTA: Diluya el colágeno I en ácido acético al 0,2% en lugar de 50 mM HEPES para promover la distribución homogénea y la unión del colágeno I.
    15. Aspire el colágeno I y lave los geles con PBS estéril tres veces para eliminar el exceso de colágeno I durante 5 minutos cada lavado. Incubar los hidrogeles en PBS con 10% de suero de caballo, 5% de FBS durante 2 h en la incubadora de 37 °C, 5% de CO2.
      NOTA: La adición de 10% de suero de caballo promueve una mayor proliferación en comparación con solo el uso de FBS como se hizo en la publicación anterior.
    16. Aspirar el medio. Agregue 500 ml de Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) filtrado estérilmente con 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina (P / S) a cada pozo. Guarde los geles en la incubadora de 37 °C, 5% de CO2 hasta que estén listos para el cultivo celular.
    17. Una vez listo, envasar aproximadamente 1,5 × 104 células de O9-1/cm2 en medio basal en las placas de cultivo. Incubar las células durante 2 días en una incubadora a 37 °C, 5% CO2. Verifique la confluencia de las células para asegurarse de que las células estén suficientemente unidas a los geles y que el número de células sea suficiente antes de recolectarlas para su análisis.
      NOTA: Consulte el protocolo publicado anteriormente para conocer los pasos de recuperación, paso y recolección de células O9-120.
    18. Continúe con las secciones 2, 3 o 4 para un análisis más detallado de los hidrogeles.

2. Análisis cuantitativo de la rigidez a través de AFM

  1. Inicie la computadora del sistema AFM, seguido del controlador AFM (consulte la Tabla de materiales).
  2. Monte el voladizo AFM en el soporte de la sonda AFM. Utilice un voladizo esférico con una cuenta de sílice de 0,5 μm montada en el extremo del voladizo (voladizo con perla esférica).
    NOTA: Para hidrogeles más rígidos, como 10 kPa, 20 kPa y 40 kPa, se utilizó una sonda más rígida con la constante de resorte de 0,24 N/m. Se utilizó una sonda más suave para hidrogeles más blandos, como 0,5 kPa y 1 kPa, con una constante de resorte de 0,059 N/m.
  3. Establezca el software AFM en modo de contacto.
  4. Monte la oblea de silicio en la etapa de muestra AFM para recolectar curvas de fuerza haciendo clic en Activar para que el voladizo toque el sustrato de silicio, generando así las curvas de fuerza.
  5. Utilice las curvas de fuerza anteriores (2.4) para la calibración, haga clic en Calibrar en el software de control para obtener una constante de resorte promedio del voladizo en condiciones de ajuste térmico y guarde los valores calibrados en el software de control.
  6. Monte las muestras colocando el trozo de cubierta con el hidrogel conectado en una placa de Petri de 60 mm en la etapa de escaneo AFM. Agregue 3 ml de PBS en el plato antes de realizar mediciones para evitar que el gel se seque.
  7. Configure el AFM para que funcione en modo de contacto (fluido) para iniciar la medición. Enganche la cuenta esférica para tocar y levantar continuamente de la muestra de gel.
  8. Establezca el voladizo para que su umbral de deflexión permanezca en 10 nm. Mantenga el tamaño de rampa de la sonda en 10 μm. A continuación, registre las curvas de fuerza como en el paso 2.4.
  9. Adquirir al menos 20 curvas de fuerza de al menos 3 a 10 puntos diferentes a través de la superficie del hidrogel.
  10. Calcule el módulo promedio de Young de ~ 20 curvas de fuerza para cada punto con el software de imágenes y análisis AFM. Utilice curvas de fuerza de rampa extendidas y un modelo linealizado (esférico). Calcule el promedio de todos los puntos para cada muestra para obtener la rigidez final.
    NOTA: El módulo de Young y los datos relacionados(es decir, las desviaciones estándar) se guardan automáticamente como una hoja de cálculo.
  11. Repita los pasos 2.6 a 2.10 para todas las muestras.

3. Análisis molecular de la rigidez a través de la tinción por inmunofluorescencia

  1. Use pinzas para transportar la cubierta a una nueva placa para minimizar las señales falsas de las células que crecen directamente en la placa. Lave las células con 500 μL de PBS estéril tres veces para eliminar las células muertas y cualquier medio de cultivo restante.
  2. Fije las células usando 500 μL de paraformaldehído al 4% (PFA) durante 10 minutos a temperatura ambiente, sin ser molestado. Luego, vuelva a lavar las células tres veces usando 500 μL de PBS / pozo durante 2 minutos cada una.
    NOTA: Conservar a 4 °C para una parada de procedimiento.
  3. Tratar las células con 500 μL de Tritón X-100 al 0,1% durante 15 min a temperatura ambiente. Luego, lave las células tres veces con 500 μL de PBS/pozo.
  4. Bloquee las células con 250 μL de suero de burro al 10% (diluido en PBS y 0.1% Tween 20) por pocillo durante 30 min a temperatura ambiente.
  5. Incubar las células con 250 μL de anticuerpos primarios durante 2 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C. Luego, lave las células tres veces con 500 μL de PBS/pozo durante 5 min cada una.
    NOTA: En este experimento se utilizaron anti-vinculina (Vcl) (1:250) y anti-AP2 alfa (1:250) y se diluyeron en suero de burro al 10%.
  6. Incubar las células con los anticuerpos secundarios correspondientes y/o faloidina utilizados para la tinción de F-actina a una dilución de 1:400 en 250 μL de suero de burro al 10% durante 30 min a temperatura ambiente. Luego, lave las células tres veces con PBS durante 5 minutos cada una.
    NOTA: La faloidina de 568 nm se puede coincubar con anticuerpos secundarios de 488 nm o 647 nm o por sí sola.
  7. Incubar las células con 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, dilución 1:1000) en 250 μL de PBS durante 10 min seguido de un último lavado de PBS durante 2 min.
  8. Agregue 3-4 gotas de medio de montaje a cada pozo. Almacene las muestras a 4 °C para ajustarlas durante al menos 2 h antes de la toma de imágenes para asegurarse de que el medio de montaje se ha ajustado correctamente.
  9. Capture imágenes de al menos 3 fotogramas aleatorios por muestra de hidrogel con un microscopio de fluorescencia, produciendo canales individuales y combinados.

4. PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR)

  1. Transfiera los hidrogeles con las células adherentes para la recolección de ARN a una nueva placa para minimizar el ARN no deseado de las células unidas a la placa celular. Lave las células con PBS tres veces para eliminar las células muertas y el medio de cultivo.
  2. Extraiga el ARNm total utilizando un kit de extracción de ARN. Realice la transcripción inversa de ARN a ADNc utilizando una supermezcla de transcripción inversa siguiendo las instrucciones del fabricante.
  3. Realizar RT-qPCR con cebadores para Vcl como marcador de rigidez de elección y analizar utilizando el método 2-ΔΔCT.
    NOTA: Secuencia de imprimación de Vcl: Adelante 5' GCTTCAGTCAGACCCATACTCG 3'; reverso 5' AGGTAAGCAGTAGGTCAGATGT 3'.

Resultados

Preparación de hidrogel y evaluación de rigidez a través de AFM y el modelo Hertz
Aquí, se proporciona un protocolo detallado para generar hidrogeles de poliacrilamida de rigidez variable mediante la regulación de la proporción de acrilamida y bisacrilamida. Sin embargo, los hidrogeles de poliacrilamida no están listos para la adhesión de las células debido a la falta de proteínas ECM. Por lo tanto, sulfo-SANPAH, actuando como un enlazador, se une covalentemente a los hidrogeles y reacciona ...

Discusión

El objetivo del estudio actual es proporcionar un sistema in vitro eficaz y eficiente para comprender mejor el impacto de las señales mecánicas en los NCC. Además de seguir el protocolo paso a paso mencionado anteriormente, los investigadores deben tener en cuenta que el cultivo celular de NCC O9-1 se ve afectado por el tipo de cubiertas de vidrio utilizadas para preparar hidrogeles. Por ejemplo, se observó que las células sembradas en un tipo específico de cubierta de vidrio (ver la Tabla de Mater...

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a la Dra. Ana-Maria Zaske, operadora de las instalaciones de Atomic Force Microscope-UT Core en el Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Texas, por la experiencia aportada en AFM en este proyecto. También agradecemos a las fuentes de financiamiento de los Institutos Nacionales de Salud (K01DE026561, R03DE025873, R01DE029014, R56HL142704 y R01HL142704 a J. Wang).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
12 mm #1 Corning 0211 Glass CoverslipChemglass Life SciencesCLS-1763-012
2% Bis-AcrylamideSigma AldrichM1533
24-well plateGreiner Bio-one662165
25 mm #1 Corning 0211 Glass CoverslipChemglass Life SciencesCLS-1763-025
3-aminopropyl triethoxysilane (APTS)Sigma AldrichA3648
4-well cell culture plateThermo Scientific179830
4% ParaformaldehydeSigma AldrichJ61899-AP
40% AcrylamideSigma AldrichA4058
50% glutaraldehydeSigma AldrichG7651
6-well cell culture plateGreiner Bio-one657160
AFM cantilever (spherical bead)Novascan
AFM softwareCatalyst NanoScopeModel: 8.15 SR3R1
Alexa Fluor 488 PhalloidinThermo FisherA12379
Ammonium Persulfate (APS)Sigma Aldrich248614Powder
anti-AP-2α AntibodySanta Cruzsc-12726
anti-Vinculin antibodyAbcamab129002
Atomic Force Microscopy (AFM) Bioscope CatalystBruker Corporation
Collagen type I (100mg)Corning354236
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)Thermo FisherD1306
Dichloromethylsilane (DCMS)Sigma Aldrich440272
Donkey serumSigma AldrichD9663
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Corning10-017-CV
Fetal bovine serum (FBS)Corning35-010-CV
Fluorescence microscopeLeicaModel DMi8
Fluoromount-G mounting mediumSouthernBiotech0100-35
HEPESSigma AldrichH3375Powder
Horse serumCorning35-030-CI
iScript Reverse Transcription SupermixBio-Rad1708841
Penicillin-Streptomycin antibioticThermo Fisher15140148
RNeasy micro kitQiagen74004
Sterile 1x PBSHycloneSH30256.02
Sterile deionized waterHardy DiagnosticsU284
sulfo-SANPAHThermo Fisher22589
SYBR greenApplied Biosystems4472908
TEMEDSigma AldrichT9281
Triton X-100Sigma AldrichX100
Tween 20Sigma AldrichP9416

Referencias

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