Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקולים מפורטים שלב אחר שלב מתוארים כאן לחקר אותות מכניים במבחנה באמצעות תאי פסגה עצביים O9-1 רב-תכליתיים והידרוגלים פוליאקרילמידים בעלי קשיחות משתנה.

Abstract

תאי ציצית עצבית (NCCs) הם תאים רב-תכליתיים עובריים בעלי חוליות שיכולים לנדוד ולהבדיל למגוון רחב של סוגי תאים המעוררים איברים ורקמות שונים. נוקשות רקמות מייצרת כוח מכני, סימן פיזי הממלא תפקיד קריטי בבידול NCC; עם זאת, המנגנון עדיין לא ברור. השיטה המתוארת כאן מספקת מידע מפורט עבור הדור הממוטב של הידרוג'לים polyacrylamide של נוקשות משתנה, מדידה מדויקת של נוקשות כזו, ואת ההערכה של ההשפעה של אותות מכניים בתאי O9-1, קו NCC המחקה ב NCCs vivo.

נוקשות הידרוג'ל נמדדה באמצעות מיקרוסקופיה של כוח אטומי (AFM) והצביעה על רמות נוקשות שונות בהתאם. O9-1 NCCs תרבית על הידרוג'לים של נוקשות משתנה הראה מורפולוגיה תאים שונים ביטוי גנים של סיבי מתח, אשר הצביעו על השפעות ביולוגיות שונות הנגרמות על ידי שינויים באותות מכניים. יתר על כן, זה קבע כי שינוי נוקשות הידרוג'ל הביא מערכת במבחנה יעילה כדי לתפעל איתות מכני על ידי שינוי נוקשות ג'ל וניתוח הרגולציה המולקולרית והגנטית ב NCCs. O9-1 NCCs יכול להבדיל למגוון רחב של סוגי תאים תחת השפעת מדיית הבידול המתאימה, וזה נוח לתפעל אותות כימיים במבחנה. לכן, מערכת במבחנה זו היא כלי רב עוצמה לחקור את התפקיד של איתות מכני ב- NCCs ואת האינטראקציה שלה עם אותות כימיים, אשר יסייע לחוקרים להבין טוב יותר את המנגנונים המולקולריים והגנטיים של התפתחות ציצית עצבית ומחלות.

Introduction

תאי ציצית עצבית (NCCs) הם קבוצה של תאי גזע במהלך עובר חוליות עם יכולת יוצאת דופן לנדוד ולתרום להתפתחות של איברים ורקמות שונים. NCCs יכול להבדיל לסוגי תאים שונים, כולל נוירונים חושיים, סחוס, עצם, מלנוציטים ותאי שריר חלקים, בהתאם למיקום המקור האקסיאלי וההדרכה הסביבתית המקומית של NCC1,2. עם היכולת להבדיל למגוון רחב של סוגי תאים, חריגות גנטיות הגורמות לדיסרגציה בכל שלב של התפתחות פסגת עצבים (NC) יכולות להוביל למחלות מולדות רבות2. לדוגמה, הפרעות במהלך היווצרות, הגירה, ופיתוח של NCCs להוביל להפרעות התפתחותיות המכונה באופן קולקטיבי נוירוקריסטופתיות1,3. מחלות אלה נעות בין פגמים craniofacial עקב כישלון בהיווצרות NCC, כגון תסמונת Treacher קולינס, להתפתחות של סוגי סרטן שונים עקב יכולת הנדידה גרורתית NCC, כפי שניתן לראות מלנומה3,4,5,6. במהלך העשורים האחרונים, חוקרים גילו תגליות מדהימות על התפקידים והמנגנונים של NCCs בפיתוח ומחלות, כאשר רוב הממצאים התמקדו באותות כימיים7,8. לאחרונה, אותות מכניים צוינו לשחק תפקיד קריטי אך לא מובן בפיתוח NCC9,10.

הרמזים הסביבתיים של NCCs לשחק תפקיד קריטי במהלך הפיתוח שלהם, כולל הרגולציה של בידול NCC לסוגי תאים שונים. רמזים סביבתיים, למשל רמזים פיזיים, משפיעים על התנהגויות מרכזיות ותגובות תאיות, כגון גיוון תפקודי. Mechanotransduction מאפשר לתאים לחוש ולהגיב לרמזים אלה כדי לשמור על תהליכים ביולוגיים שונים2. NCCs מוקפים בתאים שכנים ומצעים שונים, כגון מטריצה חוץ תאית (ECM), אשר יכול להוליד גירויים מכניים כדי לשמור על הומאוסטזיס ולהתאים את השינויים באמצעות קביעת גורל, התפשטות, אפופטוזיס11. Mechanotransduction מתחיל בקרום הפלזמה שבו המרכיב החושי של גירויים חוץ תאיים מכני מתרחש, וכתוצאה מכך את הוויסות התאי של התא12. אינטגרינים, הידבקויות מוקד וצמתים של ממסר קרום הפלזמה אותות מכניים, כגון כוחות גיסת, מתח, ואת נוקשות של המצעים שמסביב, לתוך אותות כימיים כדי לייצר תגובות תאיות12. העברת אותות כימיים מקרום הפלזמה לוויסות התאי הסופי מתבצעת באמצעות מסלולי איתות שונים כדי לסיים תהליכים חיוניים עבור האורגניזם, כגון בידול.

מספר מחקרים הראו כי איתות מכני מנוקשות מצע ממלא תפקיד בבידול התא13,14. לדוגמה, מחקרים קודמים הראו כי תאי גזע mesenchymal (MSCs) גדל על מצעים רכים עם נוקשות דומה לזו של רקמת המוח (בטווח של 0.1-1.0 kPa) הביא בידול תאים עצביים15,16. עם זאת, יותר MSCs להבדיל לתוך תאים דמויי myocyte כאשר גדל על מצעים 8-17 kPa מחקה את נוקשות השריר, בעוד בידול דמוי osteoblast נצפתה כאשר MSCs היו תרבית על מצעים נוקשים (25-40 kPa)15,16. המשמעות של mechanotransduction מודגשת על ידי אי סדרים וחריגות במסלול איתות מכני שעלול להוביל פגמים התפתחותיים חמורים ומחלות, כולל סרטן, מחלות לב וכלי דם, אוסטאופורוזיס17,18,19. בסרטן, רקמת שד רגילה רכה, והסיכון לסרטן השד עולה ברקמת שד נוקשה וצפופה, סביבה הדומה יותר לגידולי השד15. עם ידע זה, ההשפעות של איתות מכני על פיתוח NCC ניתן ללמוד באמצעות מניפולציה פשוטה של נוקשות מצע באמצעות מערכת במבחנה, מתן יתרונות נוספים ואפשרויות בהבנת היסודות של התקדמות המחלה הקשורים NC ואטיולוגיה.

כדי לחקור את ההשפעה של אותות מכניים ב- NCCs, הקמנו מערכת במבחנה יעילה עבור NCCs המבוססת על אופטימיזציה של שיטות שפורסמו בעבר והערכה של התגובות של NCCs לאותות מכניים שונים20,21. פרוטוקול מפורט סופק להכנת נוקשות הידרוג'ל משתנה והערכה של ההשפעה של איתות מכני ב- NCCs. כדי להשיג זאת, O9-1 NCCs מנוצלים כמודל NC כדי ללמוד את ההשפעות והשינויים בתגובה הידרוג'ל נוקשה לעומת רך. O9-1 NCCs הם קו תא NC יציב מבודד מעובר העכבר (E) ביום 8.5. O9-1 NCCs מחקים NCCs ב- vivo מכיוון שהם יכולים להבדיל לסוגי תאים שונים שמקורם ב- NC במדיה מוגדרת של בידול22. כדי לחקור את האיתות המכני של NCCs, מצע מטריצה היה מפוברק עם גמישות טונה מריכוזים שונים של אקרילאמיד ופתרונות ביס-אקרילאמיד כדי להשיג את הנוקשות הרצויה, בקורלציה נוקשות המצע הביולוגי20,21,23. כדי למטב את התנאים של מצע מטריצה עבור NCCs, במיוחד תאי O9-1, שינויים נעשו מפרוטוקול20שפורסם בעבר . שינוי אחד שנעשה בפרוטוקול זה היה לדגור על הידרוג'לים בקולגן I, מדולל ב 0.2% חומצה אצטית במקום 50 mM HEPES, ב 37 °C (57 °F) לילה. ה- pH הנמוך של חומצה אצטית מוביל להפצה הומוגנית ושילוב קולגן I גבוה יותר, ובכך מאפשר התקשרות אחידה יותר של חלבון ECM24. בנוסף, שילוב של סרום סוס סרום בקר עוברי (FBS) שימש בריכוזים של 10% ו 5% מלוחים חוצץ פוספט (PBS), בהתאמה, לפני אחסון הידרוג'ל באינקובטור. סרום סוס שימש כתוספת נוספת FBS בשל יכולתו לקדם התפשטות תאים ובידול בריכוז של 10%25.

בשיטה זו, סביבה ביולוגית חיקה על ידי ציפוי חלבון ECM (למשל, קולגן I) כדי ליצור סביבת במבחנה מדויקת עבור NCCs לגדול ולשרוד20,21. נוקשות ההידרוגלים המוכנים נותחה כמותית באמצעות מיקרוסקופיה של כוח אטומי (AFM), טכניקה ידועה לתיאור המודולוס האלסטי26. כדי לחקור את ההשפעה של רמות נוקשות שונות על NCCs, תאי O9-1 מסוג בר היו בתרבית והוכנו על הידרוג'לים עבור immunofluorescence (IF) מכתים נגד actin filamentous (F-actin) כדי להראות את ההבדלים הידבקות תאים ומורפולוגיות בתגובה לשינויים נוקשות מצע. תוך שימוש במערכת במבחנה זו, החוקרים יוכלו לחקור את התפקידים של איתות מכני ב- NCCs ואת האינטראקציה שלה עם אותות כימיים אחרים כדי לקבל הבנה עמוקה יותר של היחסים בין NCCs ואיתות מכני.

Protocol

1. הכנת הידרוג'ל

הערה: כל השלבים חייבים להתבצע במכסה המנוע של תרבית התא שחוטא באתנול וחיטוי אולטרה סגול (UV) לפני השימוש כדי לשמור על סטריליות. כלים, כגון פינצטה ופיפטות, חייבים להיות מרוססים באתנול. פתרונות מאגר חייבים להיות גם מסוננים סטריליים.

  1. הכנת כיסויי זכוכית מצופים אמינוסילן
    1. מניחים את המספר הרצוי של כיסויי זכוכית על פיסת מגבון מעבדה.
      הערה: הכן כיסוי נוסף של 3-4 כדי להבטיח אספקת גיבוי מספקת בזמן שהם נשברים בקלות. חומרים שונים של כיסויי זכוכית יניבו תאימות שונה של זריעת תאים וחיבור. עדיף לקבוע איזה סוג מתאים ביותר לניסוי לפני תחילת הניסויים (ראה טבלת החומרים).
    2. השתמש מבער אלכוהול או מבער Bunsen כדי לחטא כל כיסוי על ידי העברתו הלוך ושוב דרך הלהבה (30 s לניסויי חלבון. מניחים כל כיסוי זכוכית על מגבון מעבדה כדי להתקרר.
    3. לאחר כיסויי הזכוכית מקוררים, מעבירים אותם לצלחת פטרי מרופד בפרפילם כדי למנוע החלקה.
      הערה: אם כיסויים אינם קרירים מספיק, החום שיורית יהיה להמיס את parafilm על החלקים, מה שהופך אותם שמיש.
    4. לכסות את כיסויים עם כ 200 μL ו 800 μL של 0.1 M NaOH עבור כיסוי 12 מ"מ ו 25 מ"מ, בהתאמה, ולתת להם לשבת במשך 5 דקות. לאחר מכן, שאפו את 0.1 M NaOH ואפשרו לכיסויים להתייבש באוויר למשך 5 דקות נוספות כדי ליצור סרט זוגי.
    5. לאחר כיסויים מיובשים, pipette כ 80 μL ו 150 μL של 3 אמינופרופיל triethoxysilane (APTS) עבור כיסוי 12 מ"מ ו 25 מ"מ, בהתאמה. היזהרו כדי למנוע שפיכת הפתרון על parafilm. אפשר לפתרון לשבת במשך 5 דקות.
    6. לשאוף כמה שיותר APTS עודף ככל האפשר ולאפשר APTS שיורית להתייבש במשך 5 דקות. לשטוף את כיסויים היטב על ידי שקוע אותם סטרילי, deionized (DI) H2O שלוש פעמים במשך 5 דקות בכל פעם.
      הערה: אם כיסויי הזכוכית אינם שטופים היטב, שאריות APTS גורמות לתגובות לא רצויות עם גלוטרדהיד, מה שגורם למזרז לבן להיווצר וכתוצאה מכך כיסויים שאינם שמיש.
    7. מעבירים את כיסויי הכיסוי לצלחת פטרי חדשה כשהצד הריאקטיבי פונה כלפי מעלה. מוסיפים מספיק 0.5% גלוטרלדהיד לצלחת פטרי כדי לכסות את כיסויי הכיסוי לחלוטין ולאפשר כיסויים לשבת במשך 30 דקות.
    8. שאפו את הגלוטארלדהיד 0.5% ושטפו שוב את כיסויי המכסים ב-DI H2O פעם אחת למשך 3 דקות. יש להקפיד את כיסויי הגב בצד המגיב על מגבון מעבדה או צלחת פטרי נקייה לייבוש אוויר לחלוטין לפני השימוש.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן; כיסויים חייבים להיות ממוקמים ב- DI H2O סטרילי עד לשימוש.
  2. הכנת כיסויים מסיליקון
    1. מניחים את אותו מספר כיסויים כמו כיסויים מצופים אמינוסילן (שלב 1.1.1) בצלחת פטרי מרופדת בפרפילם.
    2. Pipette 40 μL או 150 μL עבור כיסויים 12 מ"מ ו 25 מ"מ, בהתאמה, של dichloromethylsilane (DCMS) לצד אחד של כיסוי ולאפשר את הפתרון לשבת במשך 5 דקות.
    3. שאפו כל פתרון שנותר מהכיסוי, שטפו ב-DI H2O סטרילי פעם אחת למשך דקה אחת, והניחו את הכיסויים תגובתיים עם הפנים כלפי מעלה על מגבון מעבדה לייבוש אוויר לחלוטין לפני המעבר לשלב הבא.
  3. הכנת הידרוג'לים
    1. מערבבים אקרילאמיד, ביס-אקרילאמיד ו- DI H2O בצינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל כדי להכין 500 μL של פתרונות עם נוקשות משתנה (ראה טבלה 1). מערבולת הפתרון עבור 30 s לערבב אותו ביסודיות.
    2. עבודה מהירה, להוסיף את פתרון 10% אמוניום אסולפט (APS) ו tetramethyl אתילנדיאמין (TEMED) לצינור מערבולת את הפתרונות שוב כדי לערבב את הפתרונות.
      הערה: הכן 10% APS טריים ולהשאיר אותו על קרח או להקפיא aliquots חד פעמי בשל מחזור ההקפאה / הפשרה הרגיש שלה.
    3. Pipette כ 33 μL או 100 μL של הפתרון על 12 מ"מ מיובשים או 25 מ"מ aminosilane מצופה כיסויים (סעיף 1.1), בהתאמה.
    4. בעזרת פינצטה מעוקלת, הניחו מיד את כיסוי הכיסוי שטופל ב-DCMS על גבי תמיסת הג'ל כשהצד המטופל נוגע בתמיסת הג'ל, ובכך דוחפים את תמיסת הג'ל בין כיסויי הציפוי של DCMS לבין כיסוי מצופה אמינוסילן.
    5. אפשר לתמיסת הג'ל לפולימר במשך 5-15 דקות, תוך ניטור פעיל של פילמור ג'ל של התמיסה השארית בצינור.
    6. לאחר הג'ל הוא פילמרי, להפריד את כיסויים שטופלו DCMS עם פינצטה מעוקלת או סכין גילוח, משאיר את הג'ל מחובר כיסוי המקורי מצופה aminosilane.
    7. מניחים מיד את כיסוי הכיסוי עם הידרוג'ל המצורף בצלחת קבועה מראש של 4-well/24-well ו-6-well מכוסה ב-500 μL ו-2 מ"ל של PBS סטרילי או DI H2O לכיסויים של 12 מ"מ ו-25 מ"מ, בהתאמה, כדי למנוע מהג'ל להתייבש.
    8. חזור על שלבים 1.3.4-1.3.7 עבור כל כיסויי.
    9. שקועים הידרוג'לים PBS סטרילי או DI H2O במשך 30 דקות כדי להסיר פתרון אקרילאמיד עודף. אחסנו את ההידרוג'לים ב-PBS סטרילי או ב-DI H2O ב-4 מעלות צלזיוס לעצירה פרוצדורלית כאן.
    10. בחדר חשוך, הכינו את תערובת הסולפוסוצינימידיל 6-(4'-אזידו-2'-ניטרופינילמינו) הקנואט (סולפו-SANPAH) על ידי ערבוב תערובת של 2.5 מ"ל של 50 מ"מ 2-[4-(2-הידרוקסיאתיל) פיפראזין-1-yl] חומצה אתאנסולפונית (HEPES) (pH= 8.5) עם 25 μL של 50 מיקרוגרם / mL סולפו-SANPAH בצינור חרוטי, עטוף בנייר אלומיניום כדי להגן מפני אור. השתמש פיפטה לערבב את הפתרון היטב לפני השימוש.
      הערה: נפח של 2.5 מ"ל של פתרון סולפו-SANPAH מספיק לכעשרים וחמישה הידרוג'ל 12 מ"מ או חמישה הידרוג'ל 25 מ"מ.
    11. שאפו PBS או DI H2O מהצלחת היטב. הוסף כ 100 μL או 500 μL עבור כיסוי 12 מ"מ ו 25 מ"מ, בהתאמה, של פתרון גופרו-SANPAH (שלב 1.3.10) כדי לכסות את הג'ל. ודא הפתרון מכסה את הג'ל לחלוטין.
      הערה: התאימו את עוצמת היניקה בוואקום כדי למנוע מהכוח החזק לקרוע או להפריע להידרוג'ל.
    12. מניחים את הג'לים עם הפתרון תחת אור UV 15 W, 365 ננומטר במשך 10 דקות, נחשף כדי למזער כל הפרעה של אור UV מגיב עם sulfo-SANPAH.
    13. שאפו את עודף גופרו-SANPAH על ידי הטיית הצלחת כדי לאסוף כמה שיותר מהפתרון ככל האפשר. לשטוף את הג'ל עם 50 mM HEPES פעמיים עד שלוש פעמים.
    14. הוסיפו 500 μL ו-2 מ"ל לג'לים 12 מ"מ ו-25 מ"מ, בהתאמה, של קולגן 50 מ"ג/מ"ל שדיללתי ב-0.2% חומצה אצטית לכל באר המכילה את ההידרוג'ל. אפשר ג'לים לדגור לילה בחממה 37 °C (5°F), 5% CO2 אינקובטור.
      הערה: לדלל קולגן I ב 0.2% חומצה אצטית במקום 50 mM HEPES כדי לקדם הפצה הומוגנית וחיבור של קולגן I.
    15. שאפו את הקולגן I ושטפו את הג'לים עם PBS סטרילי שלוש פעמים כדי להסיר קולגן עודף I במשך 5 דקות בכל שטיפה. לדגור את ההידרוג'ל ב- PBS עם סרום סוס 10%, 5% FBS עבור 2 שעות ב 37 °C (5°F), 5% CO2 אינקובטור.
      הערה: התוספת של סרום סוס 10% מקדמת התפשטות גבוהה יותר בהשוואה לשימוש ב- FBS בלבד כפי שנעשה בפרסום הקודם.
    16. שאף את המדיום. הוסיפו 500 מ"ל של מדיום הנשר (DMEM) של דולבק המסונן סטרילי עם 10% FBS ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין (P/S) לכל באר. לאחסן את הג'לים 37 °C ,5% CO2 אינקובטור עד מוכן לתרבות התא.
    17. לאחר מוכנים, צלחת כ 1.5 × 104 O9-1 תאים / ס"מ2 במדיום בזאלי במנות התרבות. לדגור את התאים במשך 2 ימים באינקובטור ב 37 °C (5 °F), 5% CO2. בדוק את התאים למפגש כדי לוודא שהתאים מחוברים מספיק לג'לים, וכי מספר התאים מספיק לפני איסוף לניתוח.
      הערה: עיין בפרוטוקול שפורסם בעבר עבור שלבי השחזור, המעבר והאיסוף של תאי O9-120.
    18. המשך לסעיפים 2, 3 או 4 לניתוח נוסף של ההידרוגלים.

2. ניתוח כמותי של נוקשות באמצעות AFM

  1. הפעל את מחשב המערכת של AFM ולאחריו את בקר AFM (ראה טבלת החומרים).
  2. הר את ה- AFM cantilever על מחזיק הגשושית AFM. השתמש cantilever כדורי עם 0.5 מיקרומטר חרוז סיליקה רכוב בסוף cantilever (cantilever עם חרוז כדורי).
    הערה: עבור הידרוג'ל נוקשה יותר, כגון 10 kPa, 20 kPa, ו 40 kPa, בדיקה נוקשה יותר שימש עם קבוע האביב של 0.24 N/ m. בדיקה רכה יותר שימשה הידרוג'לים רכים יותר, כגון 0.5 kPa ו- 1 kPa, עם קבוע קפיץ של 0.059 N/ m.
  3. הגדר את תוכנת AFM במצב איש קשר.
  4. הר את רקיק הסיליקון על שלב המדגם של AFM כדי לאסוף עקומות כוח על ידי לחיצה על Engage עבור הקנטילור לגעת במצע הסיליקון, ובכך ליצור את עקומות הכוח.
  5. השתמש בעקומות הכוח לעיל (2.4) לכיול, לחץ על כיול בתוכנת השליטה כדי להשיג קבוע קפיץ ממוצע של הקנטילוור בתנאי מנגינה תרמית, ולשמור את הערכים המכוילים בתוכנה השולטת.
  6. הר את הדגימות על ידי הצבת כיסוי עם הידרוג'ל מצורף בצלחת פטרי 60 מ"מ על שלב הסריקה AFM. הוסיפו 3 מ"ל PBS לצלחת לפני ביצוע מדידות כדי למנוע את התייבשות הג'ל.
  7. הגדר את ה- AFM כך שיפעל במצב מגע (נוזל) כדי להתחיל למדידה. הפעילו את החרוז הכדורי כדי לגעת ולהרים ללא הרף מדגם הג'ל.
  8. הגדר את הקנטילוור כך שסף ההסטה שלו יישאר על 10 ננומטר. שמור על גודל ההשתוללות של הגשוש ב-10 מיקרומטר. לאחר מכן, הקלט את עקומות הכוח כמו בשלב 2.4.
  9. לרכוש לפחות 20 עקומות כוח מ 3 עד 10 כתמים שונים על פני השטח של הידרוג'ל.
  10. חשב את המודולוס הממוצע של יאנג של ~ 20 עקומות כוח עבור כל נקודה עם תוכנת הדמיה וניתוח AFM. השתמש בעקומות כוח רמפה מורחבות ובמודל ליניארי (כדורי). חשב את הממוצע של כל הכתמים עבור כל מדגם כדי להניב את הנוקשות הסופית.
    הערה: מודולוס של יאנג ונתונים קשורים(כלומר, סטיות תקן) נשמרים באופן אוטומטי כגיליון אלקטרוני.
  11. חזור על שלבים 2.6-2.10 עבור כל הדגימות.

3. ניתוח מולקולרי של נוקשות באמצעות כתמי אימונופלואורסצנטיות

  1. השתמש פינצטה כדי להעביר את כיסוי לצלחת חדשה כדי למזער אותות שווא מתאים גדל ישירות על הצלחת. לשטוף את התאים עם 500 μL של PBS סטרילי שלוש פעמים כדי להסיר תאים מתים וכל מדיום תרבית שנותר.
  2. תקן את התאים באמצעות 500 μL של 4% paraformaldehyde (PFA) במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ללא הפרעה. לאחר מכן, לשטוף מחדש את התאים שלוש פעמים באמצעות 500 μL של PBS / well במשך 2 דקות כל אחד.
    הערה: יש לאחסן ב-4 מעלות צלזיוס לעצירה פרוצדורלית.
  3. לטפל בתאים עם 500 μL של 0.1% טריטון X-100 במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 500 μL של PBS / well.
  4. לחסום את התאים עם 250 μL של סרום חמור 10% (מדולל PBS ו 0.1% Tween 20) לבאר במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. לדגור על התאים עם 250 μL של נוגדנים ראשוניים עבור 2 שעות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 °C (50 °F). לאחר מכן, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 500 μL של PBS / well במשך 5 דקות כל אחד.
    הערה: אנטי וינקולין (Vcl) (1:250) ונגד AP2 אלפא (1:250) שימשו בניסוי זה ודוללו בסרום חמור 10%.
  6. לדגור על התאים עם נוגדנים משניים מתאימים ו /או פאלואידין המשמש להכתמת F-actin בדילול של 1:400 ב 250 μL של סרום חמור 10% במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS במשך 5 דקות כל אחד.
    הערה: 568 ננומטר פאלואידין ניתן לדגירה משותפת עם 488 ננומטר או 647 ננומטר נוגדנים משניים או בכוחות עצמו.
  7. לדגור על התאים עם 4′,6-diamidino-2-פנילינדול (DAPI, 1:1000 דילול) ב 250 μL של PBS במשך 10 דקות ואחריו לשטוף האחרון של PBS במשך 2 דקות.
  8. מוסיפים 3-4 טיפות של הרכבה בינונית לכל באר. אחסן את הדגימות ב 4 °C (70 °F) כדי להגדיר לפחות 2 שעות לפני הדמיה כדי להבטיח המדיום הרכבה מוגדר כראוי.
  9. ללכוד תמונות של לפחות 3 מסגרות אקראיות לכל דגימת הידרוג'ל עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי, לייצר ערוצים בודדים וממוזגים.

4. כמותית בזמן אמת PCR (RT-qPCR)

  1. העבר את ההידרוג'לים עם התאים החסידים לאיסוף RNA ללוח חדש כדי למזער RNA לא רצוי מתאים המחוברים ללוח התא. לשטוף את התאים עם PBS שלוש פעמים כדי להסיר תאים מתים ומדיום תרבית.
  2. חלץ את ה- mRNA הכולל באמצעות ערכת חילוץ RNA. בצע תמלול הפוך של RNA ל- cDNA באמצעות supermix שעתוק הפוך בהתאם להוראות היצרן.
  3. בצע RT-qPCR עם פריימרים עבור Vcl כסמן נוקשות של בחירה ולנתח באמצעות שיטת 2-ΔΔCT.
    הערה: רצף פריימר של Vcl: קדימה 5' GCTTCAGTCAGACCACTACTCG 3'; הפוך 5' AggTAAGCAGTAGGTCAGATGT 3'.

תוצאות

הכנת הידרוג'ל והערכת נוקשות באמצעות AFM ומודל הרץ
כאן, פרוטוקול מפורט מסופק כדי ליצור הידרוג'לים polyacrylamide של נוקשות משתנה על ידי ויסות היחס של אקרילאמיד וביס-אקרילאמיד. עם זאת, הידרוג'לים polyacrylamide אינם מוכנים להידבקות של תאים בשל היעדר חלבוני ECM. לכן, סולפו-SANPAH, הפועל כמקשר, נקשר באופ...

Discussion

מטרת המחקר הנוכחי היא לספק מערכת במבחנה יעילה ויעילה כדי להבין טוב יותר את ההשפעה של אותות מכניים ב- NCCs. בנוסף בעקבות הפרוטוקול צעד אחר צעד שהוזכר לעיל, החוקרים צריכים לזכור כי התרבות התאית של O9-1 NCCs מושפעת מסוג כיסויי זכוכית המשמשים להכנת הידרוג'ל. לדוגמה, צוין כי תאים שנזרעו על סוג מסו...

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgements

אנו מודים לד"ר אנה-מריה זסקה, מפעילת מתקן הליבה של הכוח האטומי מיקרוסקופ-UT במרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת טקסס, על המומחיות שנתרמה ב- AFM בפרויקט זה. אנו מודים גם למקורות המימון של המכונים הלאומיים לבריאות (K01DE026561, R03DE025873, R01DE029014, R56HL142704 ו- R01HL142704 לג'יי וואנג).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
12 mm #1 Corning 0211 Glass CoverslipChemglass Life SciencesCLS-1763-012
2% Bis-AcrylamideSigma AldrichM1533
24-well plateGreiner Bio-one662165
25 mm #1 Corning 0211 Glass CoverslipChemglass Life SciencesCLS-1763-025
3-aminopropyl triethoxysilane (APTS)Sigma AldrichA3648
4-well cell culture plateThermo Scientific179830
4% ParaformaldehydeSigma AldrichJ61899-AP
40% AcrylamideSigma AldrichA4058
50% glutaraldehydeSigma AldrichG7651
6-well cell culture plateGreiner Bio-one657160
AFM cantilever (spherical bead)Novascan
AFM softwareCatalyst NanoScopeModel: 8.15 SR3R1
Alexa Fluor 488 PhalloidinThermo FisherA12379
Ammonium Persulfate (APS)Sigma Aldrich248614Powder
anti-AP-2α AntibodySanta Cruzsc-12726
anti-Vinculin antibodyAbcamab129002
Atomic Force Microscopy (AFM) Bioscope CatalystBruker Corporation
Collagen type I (100mg)Corning354236
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)Thermo FisherD1306
Dichloromethylsilane (DCMS)Sigma Aldrich440272
Donkey serumSigma AldrichD9663
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Corning10-017-CV
Fetal bovine serum (FBS)Corning35-010-CV
Fluorescence microscopeLeicaModel DMi8
Fluoromount-G mounting mediumSouthernBiotech0100-35
HEPESSigma AldrichH3375Powder
Horse serumCorning35-030-CI
iScript Reverse Transcription SupermixBio-Rad1708841
Penicillin-Streptomycin antibioticThermo Fisher15140148
RNeasy micro kitQiagen74004
Sterile 1x PBSHycloneSH30256.02
Sterile deionized waterHardy DiagnosticsU284
sulfo-SANPAHThermo Fisher22589
SYBR greenApplied Biosystems4472908
TEMEDSigma AldrichT9281
Triton X-100Sigma AldrichX100
Tween 20Sigma AldrichP9416

References

  1. Mehrotra, P., Tseropoulos, G., Bronner, M. E., Andreadis, S. T. Adult tissue-derived neural crest-like stem cells: Sources, regulatory networks, and translational potential. Stem Cells Translational Medicine. 9 (3), 328-341 (2020).
  2. Liu, J. A., Cheung, M. Neural crest stem cells and their potential therapeutic applications. Developmental Biology. 419 (2), 199-216 (2016).
  3. Watt, K. E. N., Trainor, P. A., Trainor, P. A. Neurocristopathies: the etiology and pathogenesis of disorders arising from defects in neural crest cell development. Neural Crest Cells-Evolution, Development and Disease. , 361-394 (2014).
  4. Lavelle, C. L. B. . Applied oral physiology. , (1988).
  5. Chin, L. The genetics of malignant melanoma: lessons from mouse and man. Nature Reviews Cancer. 3 (8), 559-570 (2003).
  6. Hindley, C. J., et al. The Hippo pathway member YAP enhances human neural crest cell fate and migration. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
  7. Wang, Q., et al. Perturbed development of cranial neural crest cells in association with reduced sonic hedgehog signaling underlies the pathogenesis of retinoic-acid-induced cleft palate. Disease Models & Mechanisms. 12 (10), (2019).
  8. Rocha, M., Singh, N., Ahsan, K., Beiriger, A., Prince, V. E. Neural crest development: insights from the zebrafish. Developmental Dynamics. 249 (1), 88-111 (2020).
  9. Barriga, E. H., Franze, K., Charras, G., Mayor, R. Tissue stiffening coordinates morphogenesis by triggering collective cell migration in vivo. Nature. 554 (7693), 523-527 (2018).
  10. Weber, G. F., Bjerke, M. A., DeSimone, D. W. A mechanoresponsive cadherin-keratin complex directs polarized protrusive behavior and collective cell migration. Developmental Cell. 22 (1), 104-115 (2012).
  11. Mason, D. E., et al. YAP and TAZ limit cytoskeletal and focal adhesion maturation to enable persistent cell motility. Journal of Cell Biology. 218 (4), 1369-1389 (2019).
  12. Dupont, S., et al. Role of YAP/TAZ in mechanotransduction. Nature. 474 (7350), 179-183 (2011).
  13. Lu, Y. -. B., et al. Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (47), 17759-17764 (2006).
  14. Georges, P. C., Miller, W. J., Meaney, D. F., Sawyer, E. S., Janmey, P. A. Matrices with compliance comparable to that of brain tissue select neuronal over glial growth in mixed cortical cultures. Biophysical Journal. 90 (8), 3012-3018 (2006).
  15. Janmey, P. A., Miller, R. T. Mechanisms of mechanical signaling in development and disease. Journal of Cell Science. 124 (1), 9-18 (2011).
  16. Engler, A., Sweeney, H., Discher, D., Schwarzbauer, J. E. Extracellular matrix elasticity directs stem cell differentiation. Journal of Musculoskeletal and Neuronal Interactions. 7 (4), 335 (2007).
  17. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
  18. Engler, A. J., et al. Embryonic cardiomyocytes beat best on a matrix with heart-like elasticity: scar-like rigidity inhibits beating. Journal of Cell Science. 121 (22), 3794-3802 (2008).
  19. Robling, A. G., Turner, C. H. Mechanical signaling for bone modeling and remodeling. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 19 (4), 319-338 (2009).
  20. Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current Protocols in Cell Biology. , (2010).
  21. Cretu, A., Castagnino, P., Assoian, R. Studying the effects of matrix stiffness on cellular function using acrylamide-based hydrogels. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2089 (2010).
  22. Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
  23. Engler, A., et al. Substrate compliance versus ligand density in cell on gel responses. Biophysical Journal. 86 (1), 617-628 (2004).
  24. Stanton, A. E., Tong, X., Yang, F. Varying solvent type modulates collagen coating and stem cell mechanotransduction on hydrogel substrates. APL Bioengineering. 3 (3), 036108 (2019).
  25. Fedoroff, S., Hall, C. Effect of horse serum on neural cell differentiation in tissue culture. In vitro. 15 (8), 641-648 (1979).
  26. Huth, S., Sindt, S., Selhuber-Unkel, C. Automated analysis of soft hydrogel microindentation: Impact of various indentation parameters on the measurement of Young's modulus. PLoS One. 14 (8), 0220281 (2019).
  27. Mitchell, P. J., Timmons, P. M., Hébert, J. M., Rigby, P., Tjian, R. Transcription factor AP-2 is expressed in neural crest cell lineages during mouse embryogenesis. Genes & Development. 5 (1), 105-119 (1991).
  28. Wegner, M. Neural crest diversification and specification: transcriptional control of Schwann Cell differentiation. Encyclopedia of Neuroscience. , 153-158 (2010).
  29. Park, J. S., et al. The effect of matrix stiffness on the differentiation of mesenchymal stem cells in response to TGF-β. Biomaterials. 32 (16), 3921-3930 (2011).
  30. Sun, M., et al. Effects of matrix stiffness on the morphology, adhesion, proliferation and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. International Journal of Medical Sciences. 15 (3), 257 (2018).
  31. Burridge, K., Guilluy, C. Focal adhesions, stress fibers and mechanical tension. Experimental Cell Research. 343 (1), 14-20 (2016).
  32. Burridge, K. Focal adhesions: a personal perspective on a half century of progress. The FEBS Journal. 284 (20), 3355-3361 (2017).
  33. Zhou, C., et al. Compliant substratum modulates vinculin expression in focal adhesion plaques in skeletal cells. International Journal of Oral Science. 11 (2), 1-9 (2019).
  34. Fernández, J. L. R., Geiger, B., Salomon, D., Ben-Ze'ev, A. Overexpression of vinculin suppresses cell motility in BALB/c 3T3 cells. Cell Motility and the Cytoskeleton. 22 (2), 127-134 (1992).
  35. Coll, J., et al. Targeted disruption of vinculin genes in F9 and embryonic stem cells changes cell morphology, adhesion, and locomotion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9161-9165 (1995).
  36. Saunders, R. M., et al. Role of vinculin in regulating focal adhesion turnover. European Journal of Cell Biology. 85 (6), 487-500 (2006).
  37. Kuo, J. -. C. Focal adhesions function as a mechanosensor. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 126, 55-73 (2014).
  38. Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58346 (2018).
  39. Kolewe, K. W., Zhu, J., Mako, N. R., Nonnenmann, S. S., Schiffman, J. D. Bacterial adhesion is affected by the thickness and stiffness of poly (ethylene glycol) hydrogels. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (3), 2275-2281 (2018).
  40. Lin, Y. -. C., et al. Mechanosensing of substrate thickness. Physical Review E. 82 (4), 041918 (2010).
  41. Mullen, C. A., Vaughan, T. J., Billiar, K. L., McNamara, L. M. The effect of substrate stiffness, thickness, and cross-linking density on osteogenic cell behavior. Biophysical Journal. 108 (7), 1604-1612 (2015).
  42. Tusan, C. G., et al. Collective cell behavior in mechanosensing of substrate thickness. Biophysical Journal. 114 (11), 2743-2755 (2018).
  43. McBurney, M. W., Jones-Villeneuve, E. M., Edwards, M. K., Anderson, P. J. Control of muscle and neuronal differentiation in a cultured embryonal carcinoma cell line. Nature. 299 (5879), 165-167 (1982).
  44. Hasegawa, A., Shirayoshi, Y. P19 cells overexpressing Lhx1 differentiate into the definitive endoderm by recapitulating an embryonic developmental pathway. Yonago Acta Medica. 58 (1), 15 (2015).
  45. Wells, R. G. Tissue mechanics and fibrosis. Biochimica et Biophysica Acta. 1832 (7), 884-890 (2013).
  46. Gavara, N. A beginner's guide to atomic force microscopy probing for cell mechanics. Microscopy Research and Technique. 80 (1), 75-84 (2017).
  47. Butler, J. P., Tolic-Nørrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
  48. Leong, W. S., et al. Thickness sensing of hMSCs on collagen gel directs stem cell fate. Biochemical and Biophysical Research Communications. 401 (2), 287-292 (2010).
  49. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
  50. Funaki, M., Janmey, P. A. Technologies to engineer cell substrate mechanics in hydrogels. Biology and Engineering of Stem Cell Niches. , 363-373 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

174O9 1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved