基于面积的图像分析算法，用于巨噬细胞-成纤维细胞共生群的定量

摘要

我们提出了一种方法，该方法利用可推广的基于区域的图像分析方法来识别细胞计数。对不同细胞群的分析利用了自适应算法中不同细胞类型之间显着的细胞高度和结构差异。

摘要

细胞定量对于广泛的生物学和生化研究是必要的。传统的细胞图像分析通常采用荧光检测方法，例如免疫荧光染色或使用荧光蛋白或边缘检测技术转染，由于图像背景中的噪声和其他非理想性，这些方法通常容易出错。

我们设计了一种新算法，可以准确地计数和区分巨噬细胞和成纤维细胞，这些巨噬细胞和成纤维细胞是不同表型的细胞，通常在组织再生过程中共定位。MATLAB用于实现该算法，该算法根据背景的高度差异来区分不同的细胞类型。使用基于面积的方法开发了一种主要算法，以考虑细胞大小/结构和高密度接种条件的变化。

利用内部参数（例如使用给定细胞类型的实验数据计算的细胞覆盖率）的二次迭代算法来解释细胞结构中的非理想性。最后，采用分离算法对共生环境进行分析，该算法根据对图像内相对高度差异的评估，选择性地排除了各种细胞类型。发现这种方法可以准确计数单培养细胞的5%误差范围内的细胞，以及共培养细胞的10%误差范围内的细胞。

引言

在图像分析技术过程中定期实施软件，以确保结果是准确，高效和无偏的。对于基于细胞的检测，一个常见的问题是细胞的错误识别。具有不正确的焦距和对比度设置的图像可能导致细胞模糊，其中单个细胞的边界变得难以识别¹。存在无关的图像特征（如毛孔、气泡或其他不需要的物体）会减慢计数过程并导致错误识别，从而妨碍计数过程。此外，细胞计数可能很繁重，并且计数数百个重复可能非常耗时。此外，在手动计数过程中存在固有的主观偏见，因此有关细胞鉴定的决策通常不准确²。自动化软件提供了令人兴奋的潜力，通过快速准确地将细胞与无关的物体区分开来，包括远远超出人类精确检测能力的物体，基于明确定义的识别标准，减少研究者偏见的影响，从而绕过所有这些问题。使用自动化软件识别细胞的常用技术涉及两种主要方法:分割和阈值³。在本文中，我们展示了一种可推广的基于区域的方案，该协议可在广泛访问的软件框架内实现快速，准确和廉价的细胞计数。

分割技术，如边缘检测，试图通过利用图像中的强度差异来分离单个细胞。将细胞与图像其余部分区分开来的强度变化通常由亮度的急剧变化组成⁴.边缘检测涉及正则滤波步骤，然后是检测强度变化的微分步骤。分化过程识别高强度变化图像中的边缘和轮廓，这些边缘和轮廓与细胞存在相关。虽然有噪声的图像可以通过去噪算法⁴运行，但边缘检测技术非常适合用于分析低背景噪声的图像。当细胞边界清晰易辨，并且不受与细胞存在、细胞模糊、无关物体或定义的内部细胞结构^1，2无关的亮度轮廓的阻碍时，该过程将发挥最佳功能。如果图像特别嘈杂，则可以通过荧光染色或用荧光蛋白^转染2，5进一步区分细胞。虽然这显着提高了分割技术的准确性，但它需要额外的成本和额外的时间投资来制备用于成像的细胞培养物。

阈值技术涉及将图像分为两类:前景和背景，单元格分配给前景³。这些技术利用颜色/对比度变化来定义物体的表观高度;通常比背景"高"的对象可以很容易地识别为单元格。分水岭变换通过关联以浅色像素作为前景的表面和以深色像素作为背景的表面^6，7 来以这种方式发挥作用。通过基于高度的识别，阈值技术可以常规地将噪声与所需物体区分开来，前提是它们存在于同一焦平面内。当与基于面积的量化配对时，分水岭变换可以在典型分割技术（如边缘检测）不准确的环境中准确识别对象组。

流域变换通常与分割技术相结合，以准备图像以进行更清晰的分析，从而提高细胞计数的准确性。对于此过程，分水岭变换用于在分割之前突出显示潜在的感兴趣区域。分水岭变换通过识别图像前景中的细胞提供了独特的优势，这可以通过消除细胞的潜在误报（例如背景的不均匀斑块）来提高分割分析的准确性。然而，当试图使基于细胞的图像适应分水岭变换时，可能会出现困难。具有高细胞密度的图像可能会受到下分段的困扰，其中细胞的聚集体被识别为单一组而不是单个组分。噪声或剧烈强度变化的存在也可能导致过度分段，其中算法过度隔离细胞，导致细胞计数过多和不准确⁸。

在本文中，我们详细介绍了一种方法，通过将阈值分析的组件合并到基于面积的量化算法中来最小化分水岭变换的主要缺点，如图 1所示。值得注意的是，该算法是使用开源和/或广泛使用的软件实现的，并且无需昂贵的试剂或复杂的细胞制备技术即可应用该细胞计数框架。RAW264.7巨噬细胞用于证明该方法，因为它们在调节结缔组织维持和伤口愈合过程中起着关键作用⁹。此外，由于NIH / 3T3成纤维细胞在组织维护和修复中的关键作用，对其进行了分析。成纤维细胞通常与巨噬细胞共存并支持巨噬细胞，因此需要在共培养研究中区分这些表型不同的细胞类型。

通过计算细胞覆盖的面积和单一细胞占用的平均面积，可以可靠有效地量化具有高活细胞密度（VCD）的图像中的细胞计数。使用阈值而不是分割进行细胞鉴定也使更复杂的分析成为可能，例如同时分析共培养中不同细胞类型的实验。NIH / 3T3成纤维细胞，通常被发现与伤口愈合部位内的RAW264.7巨噬细胞共定位，被发现在与巨噬细胞¹⁰的焦平面不同的焦平面上生长。因此，根据所分析的细胞类型，运行多种阈值算法来定义背景和前景，从而能够准确计数同一图像中的两种不同细胞类型。

研究方案

1. 细胞培养和图像采集

1. 在37°C和5%CO₂ 下在Dulbecco的改良鹰培养基（DMEM）中培养RAW264.7巨噬细胞，并补充10%胎牛血清（FBS），1%青霉素 - 链霉素，1.5g / L碳酸氢钠和5μM β巯基乙醇。
   1. 对于单培养成像，在装有1 mL培养基的5 mL细胞培养瓶中以²⁵ ，000个细胞/ cm 2的密度培养RAW264.7细胞。
2. 在37°C下培养NIH / 3T3细胞，在DMEM中培养5%CO₂ ，补充10%胎牛血清和1%青霉素 - 链霉素¹¹。
3. 对于共培养成像，以不同的比例将RAW264.7巨噬细胞和NIH / 3T3成纤维细胞一起培养，总密度为25，000个细胞/ cm²。使用 1 份 RAW264.7 培养基（DMEM 补充 10% FBS、1% 青霉素-链霉素、1.5 g/L 碳酸氢钠和 5 μM β-巯基乙醇）和 1 份 NIH/3T3 培养基（DMEM 补充 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素）的共培养基。
4. 接种后，将细胞在37°C和5%CO₂ 下孵育，以达到80%细胞汇合的活细胞密度。
5. 使用配备40x物镜的倒置显微镜对细胞进行成像。获取灰度格式的所有图像，并将其导出到原始".czi"文件中。
   1. 确定算法准确评估具有一系列图像质量的图像的能力。获取具有不同病灶的图像，生成"非球状"图像（图2）和"球状"图像（图3）。
   2. 在 MATLAB 分析之前，使用 ImageJ 在原始".czi"文件上使用"批量转换"功能，将单元格图像导出并转换为 8 位 tiff （.tiff） 图像格式。将转换后的图像存储在本地文件夹中，并手动将这些图像文件传输到相关的 MATLAB 箱。

2. 图像分析-主要利用"单一栽培.m"文件的单一栽培

注意:以下步骤是使用 MATLAB 执行的。MATLAB协议使用了三个文件:"process.m"（补充编码文件1），包含算法的文件"monoculture.m"（补充编码文件2），用于分析单培养图像的文件，以及"coculture_modified.m"（补充编码文件3），用于分析共培养图像的文件。

1. 使用基于面积的方法获取显示相对高度变化的像元的图像。通过对每个子图像使用'imshow（）'函数，为每个子步骤输出图像。将要分析的图像文件复制并粘贴到 bin 中，然后在以下命令中输入文件名。按 run 启动程序。
   imread（'filename.tiff'）
   1. 使用源函数⁸ 通过"通过重建打开"，然后通过"重建关闭"来分析图像，以从背景放大前景。使用第一个命令通过重建打开，使用第二个和第三个序列通过重建关闭
      'imopen（）'
      'imerode（）'
      'imreconstruct（）'
2. 利用基于百分位数的识别系统，将重建的图像二值化为纯黑白像素。请注意，在此系统中，单元格将转换为纯白色像素值"255"，而背景和无关（非蜂窝）对象将转换为纯黑色像素值"0"。
   1. 通过使用与"最大相关像素"（包含给定图像的至少0.5%的最大像素值）的百分位数差来区分单元格与背景。
   2. 分析和评估RAW264.7巨噬细胞的像素值。如果这些值在最大相关像素的 4.5% 以内，则将像素标记为蜂窝移动网络。
      注意:可以使用简单的 if 语句发出此命令。
   3. 对于包含球状细胞轮廓的图像，例如 图2所示的图像，请实施迭代过程以纠正细胞中心的错误二值化（称为"岛";见下文），如下所示。
   4. 确定总小区覆盖范围的初始猜测;60%用于这项研究。请注意，图像中存在的细胞数量应取决于细胞覆盖率 - 因此可以通过实验确定细胞数量和细胞覆盖率之间的关系。使用此关系，确定变量"Alpha"和"kappa"。
      注意:"Alpha"表示包含以下相对高度百分位数的 3 x 1 矢量:识别像元的高度百分位数、识别背景的高度百分位数以及强度值明显低于像元值的岛屿区域的高度百分位数。"Kappa"表示图像中单元格覆盖的总面积。
   5. 运行该算法，该算法将（i）使用α和kappa的初始估计值来分析图像以填充一部分岛屿，以及（ii）使用分析后的细胞计数和覆盖率来重新计算kappa。如果 kappa 值在初始猜测的 10% 以内，请继续执行下一步。
      注意:对于包含RAW264.7和NIH / 3T3细胞的图像，发现α是[4.3，5.5，10]。换句话说，与最大相关像素相差4.3%决定了识别细胞的高度百分位数，与最大相关像素相差5.5%决定了识别背景的高度百分位数。与最大相关像素相差 10% 决定了岛屿通常居住的高度百分位数。
3. 在图像的二值化之后，使用开源圆查找算法自动确定平均细胞面积，该算法对二值化图像^12，13，14执行霍夫变换。使用以下命令获取图像内所有中心位置和圆半径的矢量。
   '[中心，半径] = imfindcircle（A， [minradius， maxradius]）"
   此命令中的"A"是选择的图像，[minradius，maxradius]是算法将尝试检测的半径范围。
   注意:该确定平均细胞面积的程序假设巨噬细胞的形态在细胞¹⁰之间是圆形和一致的。从实验数据中观察到巨噬细胞的半径在40倍放大倍率下最常见于30至50像素之间。此像素范围定义为圆查找算法的可接受范围。对于其他细胞类型，半径可能显着不同，需要使用实验分析来确定。
   1. 使用半径输出通过取平均值来计算平均像元面积。分析至少10个细胞以确保准确的区域识别。
4. 使用平均像元区域确定图像中像元的总数。
   1. 遍历图像矩阵并计算单元格像素的总数。通过将细胞像素数除以图像中的总像素数来确定总细胞覆盖率。通过将单元格像素数除以单元格的平均面积来确定图像中的单元格总数。

3. 图像分析-主要利用"coculture_modified.m"文件的共文化

注意:以下步骤是使用 MATLAB 执行的。

1. 使用基于面积的方法获取显示相对高度变化的像元的图像。通过对每个子图像使用'imshow（）'函数，为每个子步骤输出图像。将要分析的图像文件复制并粘贴到 bin 中，然后在以下命令中输入文件名。按 run 启动程序。
   'imread（'filename.tiff'）'
   1. 使用源函数¹⁰ 从背景放大前景，然后通过"重建打开"来分析图像。使用第一个命令通过重建打开，使用第二个和第三个序列通过重建关闭。
      '不开放 （）'
      'imerode（）'
      'imreconstruct（）'
2. 通过使用两种选择性二值分析，利用两种细胞类型之间的高度差异，对含有RAW264.7和NIH / 3T3细胞的共培养物进行分析。
   1. 使用RAW264.7和NIH / 3T3细胞的图像实验确定参数"phi"，其中phi表示两种细胞类型之间的成比例高度差。猜测初始 phi 值并进行迭代，直到细胞计数和覆盖率与手动计数紧密匹配，特定于 RAW264.7 和 NIH/3T3 共培养。
      注意:这些研究中使用的phi值为3.2。Phi用于选择性地过滤图像，使其看起来仅包含RAW264.7单元格，如图 4C所示。
   2. 确定 RAW264.7 细胞计数和总细胞覆盖率，方法与单培养图像类似。
3. 在没有phi参数的情况下再次分析流域变换的图像，同时检测巨噬细胞和成纤维细胞。通过使用步骤2中描述的标准阈值和基于面积的定量方法，通过选择性地减去RAW264.7细胞像素来获取NIH / 3T3成纤维细胞数据。
   1. 分析整个图像后，通过从 RAW264.7 像素数中减去单元格像素的总数来确定 NIH/3T3 像素的总数。通过将每个细胞系的细胞像素数除以图像像素总数来计算NIH / 3T3和RAW264.7细胞的覆盖范围。

结果

非球茎RAW264.7巨噬细胞的分析在25，000个细胞^{/ cm 2}的单培养环境中进行。在ImageJ中转换为8位tiff后，从细胞培养物中拍摄代表性图像并在MATLAB中处理。在整个过程中的算法输出被记录下来并记录在 图2 中，用于代表性图像。在该图像中，该算法对226个细胞进行了计数，并通过与识别241个细胞（6.2%误差）的手动计数进行比较来验证该图像计数。对于至少10张RAW264.7细胞计...

讨论

我们设计了一种基于区域的通用程序，可以根据细胞高度准确有效地计数细胞，即使在共培养系统中也能对细胞进行无染色定量。该程序的关键步骤包括实施相对强度系统，通过该系统可以区分细胞。使用相对高度分析有两个目的:不需要外部参数，因为给定的像元类型和参数的相对参数是恒定的，并且不需要为每个图像输入绝对亮度/对比度级别。此外，使用基于百分位数的系统可以分析同一图?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Axio Observer 7 Inverted Microscope	Zeiss	1028290770
β-mercaptoethanol	Life Technologies	21985023
Cell Scrapers	CellTreat	229310
Dublecco's Modified Eagle Medium	Fisher Scientific	12430047
Dublecco's PBS	Fisher Scientific	14190144
MATLAB Software	MathWorks	2021A
NIH/3T3 Cells	ATCC	ATCC CRL - 1658
Penicillin–Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333-20ML
RAW264.7 Cells	ATCC	ATCC TIB - 71
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S6014-25G
T75 Cell Culture Flask	Corning	CLS3814-24EA