Algoritmo de análise de imagem baseado em área para quantificação de coculturas de macênfago-fibroblasto

Resumo

Apresentamos um método, que utiliza uma abordagem de análise de imagem generalizada baseada em área para identificar a contagem de células. A análise de diferentes populações celulares explorou as diferenças significativas de altura celular e estrutura entre tipos de células distintas dentro de um algoritmo adaptativo.

Resumo

A quantificação das células é necessária para uma ampla gama de estudos biológicos e bioquímicos. A análise convencional de imagens das células normalmente emprega abordagens de detecção de fluorescência, como coloração imunofluorescente ou transfecção com proteínas fluorescentes ou técnicas de detecção de borda, que muitas vezes são propensas a erros devido ao ruído e outras não-idealidades no fundo da imagem.

Projetamos um novo algoritmo que poderia contar com precisão e distinguir macrófagos e fibroblastos, células de diferentes fenótipos que muitas vezes se colocam durante a regeneração tecidual. O MATLAB foi usado para implementar o algoritmo, que diferenciava tipos de células distintas com base em diferenças de altura a partir do fundo. Um algoritmo primário foi desenvolvido usando um método baseado em área para explicar as variações no tamanho/estrutura da célula e condições de semeadura de alta densidade.

As não idealidades nas estruturas celulares foram contabilizadas com um algoritmo iterativo secundário utilizando parâmetros internos, como cobertura celular computada usando dados experimentais para um determinado tipo de célula. Finalmente, foi realizada uma análise dos ambientes de cocultura utilizando-se um algoritmo de isolamento no qual vários tipos de células foram seletivamente excluídos com base na avaliação de diferenças de altura relativas dentro da imagem. Essa abordagem foi encontrada para contar com precisão as células dentro de uma margem de erro de 5% para células monoculturadas e dentro de uma margem de erro de 10% para células coculturadas.

Introdução

O software é implementado rotineiramente durante técnicas de análise de imagens para garantir que os resultados sejam precisos, eficientes e imparcial. Para ensaios baseados em células, um problema comum é a identificação errada das células. Imagens com configurações focais e de contraste inadequadas podem levar à desfoque celular, no qual o limite de células individuais torna-se difícil de identificar¹. A presença de características de imagem ímpares, como poros, bolhas ou outros objetos indesejados, pode dificultar a contagem de procedimentos, retardando o processo de contagem e levando à identificação errada. Além disso, a contagem de células pode ser onerosa, e contar centenas de réplicas pode ser extremamente demorado. Além disso, existe um viés subjetivo inerente durante a contagem manual e, portanto, a tomada de decisão sobre a identificação celular é muitas vezes imprecisa². O software automatizado oferece um potencial empolgante para contornar todos esses problemas, diferenciando rapidamente e precisamente as células de objetos estranhos, incluindo objetos muito além da capacidade humana para detecção precisa, com base em critérios de identificação bem definidos que reduzem a influência do viés do investigador. Técnicas comuns para identificar células usando software automatizado envolvem dois métodos principais: segmentação e limiar³. Aqui, demonstramos um protocolo generalizado baseado em área que permite a contagem rápida, precisa e barata de células dentro de uma estrutura de software amplamente acessível.

Técnicas de segmentação, como a detecção de bordas, buscam isolar células individuais utilizando diferenças de intensidade dentro de uma imagem. As mudanças de intensidade que distinguem uma célula do resto da imagem mais frequentemente consistem em mudanças acentuadas no brilho⁴. A detecção de bordas envolve uma etapa de filtragem regularizadora, seguida de uma etapa de diferenciação na qual são detectadas alterações de intensidade. O processo de diferenciação identifica bordas e contornos dentro da imagem de mudanças de alta intensidade, e essas bordas e contornos estão correlacionados com a presença celular. Embora imagens com ruído possam ser executadas através de algoritmos de denoizantes⁴, técnicas de detecção de bordas são idealmente usadas para analisar imagens com baixo ruído de fundo. O processo funciona de forma ideal quando os limites celulares são claramente e facilmente distinguíveis e não são impedidos por contornos de brilho não relacionados à presença celular, desfoque celular, objetos estranhos ou estruturas celulares internas definidas ^1,2. Se uma imagem é particularmente ruidosa, as células podem ser ainda mais distinguidas através de coloração fluorescente ou transfecção com proteínas fluorescentes ^2,5. Embora isso melhore significativamente a precisão das técnicas de segmentação, requer custos adicionais e investimentos adicionais para preparar culturas celulares para imagens.

As técnicas de limiar envolvem a divisão de uma imagem em duas categorias: o primeiro plano e o fundo, com células atribuídas ao primeiro plano³. Essas técnicas utilizam alterações de cor/contraste para definir a altura aparente de um objeto; objetos que são rotineiramente 'mais altos' do que o fundo podem ser facilmente identificados como células. A transformação da bacia hidrográfica funciona desta forma associando superfícies com pixels de luz como o primeiro plano e aqueles com pixels escuros como o fundo ^6,7. Através da identificação baseada em altura, as técnicas de limiar podem distinguir rotineiramente o ruído dos objetos desejados, desde que existam dentro do mesmo plano focal. Quando emparelhado com uma quantificação baseada em área, uma transformação de bacia hidrográfica pode identificar com precisão grupos de objetos em ambientes onde técnicas típicas de segmentação, como detecção de bordas, seriam imprecisas.

As transformações de bacias hidrográficas são comumente acoplada a técnicas de segmentação para preparar imagens para uma análise mais limpa, resultando em maior precisão da contagem celular. Para esse processo, a transformação de bacias hidrográficas é utilizada para destacar potenciais regiões de interesse antes da segmentação. Uma transformação de bacia hidrográfica proporciona benefícios únicos ao identificar células em primeiro plano de imagens, o que pode melhorar a precisão da análise de segmentação, removendo potenciais falsos positivos para células, como patches irregulares de fundo. No entanto, podem surgir dificuldades ao tentar adaptar imagens baseadas em células a uma transformação divisora de águas. Imagens com alta densidade celular podem ser atormentadas com subsegmentação, na qual agregados de células são identificados como um grupo singular e não como componentes individuais. A presença de ruídos ou alterações acentuadas de intensidade também pode resultar em superegmentação, na qual o algoritmo sobreisola as células, resultando em contagem de células excessivas e imprecisas⁸.

Aqui, detalhamos um método para minimizar as desvantagens primárias da transformação da bacia hidrográfica, incorporando componentes de uma análise de limiar dentro de um algoritmo de quantificação baseado em área, como retratado na Figura 1. Notavelmente, este algoritmo foi implementado com software de código aberto e/ou amplamente disponível, e a aplicação desta estrutura de contagem de células foi possível sem reagentes caros ou técnicas complexas de preparação celular. Os macrófagos RAW264.7 foram utilizados para demonstrar o método devido ao seu papel crítico na regulação dos processos de manutenção de tecidos conjuntivos e cicatrização de feridas⁹. Além disso, os fibroblastos NIH/3T3 foram analisados devido ao seu papel fundamental na manutenção e reparação de tecidos. As células fibroblastos frequentemente coexistem e apoiam macrófagos, gerando a necessidade de distinguir esses tipos de células fenotipicamente distintas em estudos de cocultura.

As contagens celulares a partir de imagens com alta densidade celular viável (VCD) poderiam ser quantificadas de forma confiável e eficiente calculando a área coberta pelas células, e a área média ocupada por uma célula singular. O uso de limiares em oposição à segmentação para identificação celular também possibilitou análises mais complexas, como experimentos em que diferentes tipos de células em coculturas foram analisados simultaneamente. Os fibroblastos NIH/3T3, que muitas vezes são encontrados para se colocar com macrófagos RAW264.7 dentro de um local de cicatrização de feridas, foram encontrados para crescer em um plano focal que era distinto do plano focal dos macrófagos¹⁰. Assim, vários algoritmos de limiar foram executados para definir o fundo e o primeiro plano, dependendo do tipo de célula que está sendo analisado, permitindo uma contagem precisa de dois tipos de células diferentes dentro da mesma imagem.

Protocolo

1. Cultura celular e aquisição de imagens

1. Cultura RAW264.7 macrófagos a 37 °C e 5% DE CO₂ no Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) complementado com 10% de soro bovino fetal (FBS), 1% penicilina-estreptomicina, 1,5 g/L de sódio biato e 5 μM β-mercaptoethanol.
   1. Para imagens de monocultura, cultura RAW264.7 células a uma densidade de 25.000 células/cm² em um frasco de cultura celular de 5 mL com 1 mL de médio.
2. Cultura NIH/3T3 células a 37 °C e 5% CO₂ em DMEM suplementadas com soro bovino fetal de 10% e 1% penicilina-estreptomicina¹¹.
3. Para a cocultura, cultura RAW264.7 macrófagos e fibroblastos NIH/3T3 juntos em proporções variadas, a uma densidade total de 25.000 células/cm². Use meio de cocultura que seja 1 parte RAW264.7 médio (DMEM suplementado com 10% de FBS, 1% penicilina-estreptomicina, 1,5 g/L bicarbonato de sódio e 5 μM β-mercaptoetanol) e 1 parte NIH/3T3 médio (DMEM suplementado com soro bovino fetal de 10% e 1% penicilina-estreptomicina).
4. Após a semeadura, incubar células a 37 °C e 5% de CO₂ para atingir uma densidade celular viável de 80% de confluência celular.
5. Células de imagem com um microscópio invertido equipado com um objetivo de 40x. Adquira todas as imagens em escala de cinza e exporte-as no arquivo '.czi' bruto.
   1. Determine a capacidade do algoritmo de avaliar com precisão imagens com uma gama de qualidades de imagem. Adquira imagens com diferentes focos, produzindo imagens "não bulbosas" (Figura 2) e imagens 'bulbosas' (Figura 3).
   2. Exporte e converta imagens de células para o formato de imagem tiff (.tiff) de 8 bits usando imageJ usando a função 'Batch Convert' nos arquivos '.czi' brutos antes da análise MATLAB. Armazene imagens convertidas em uma pasta local e transfira manualmente esses arquivos de imagem para a caixa MATLAB relevante.

2. Análise de imagem-monocultura utilizando o arquivo "monocultura.m" principalmente

NOTA: As seguintes etapas foram realizadas utilizando-se o MATLAB. Três arquivos foram usados para o protocolo MATLAB: "process.m" (arquivo de codificação suplementar 1), o arquivo contendo o algoritmo, "monocultura.m" (arquivo de codificação suplementar 2), o arquivo para executar para análise de imagens de monocultura, e "coculture_modified.m" (arquivo de codificação suplementar 3), o arquivo a ser executado para analisar imagens de cocultura.

1. Use o método baseado na área para obter imagens de células que mostrássem variações relativas de altura. Saídas de imagem para cada subpresto utilizando a função 'imshow()' para cada subimagem. Copie e cole o arquivo de imagem para análise no bin e digite o nome do arquivo no comando a seguir. Pressione para iniciar o programa.
   imread ('nome de arquivo.tiff')
   1. Analise imagens por 'abertura por reconstrução' seguida de 'fechamento por reconstrução' usando funções de origem⁸ para ampliar o primeiro plano a partir do fundo. Use o primeiro comando para abertura por reconstrução e a segunda e terceira sequências para fechar por reconstrução
      'imopen()'
      'imerode()'
      'imreconstruct()'
2. Binarize as imagens reconstruídas para pixels brancos puros e pretos utilizando um sistema de identificação baseado em percentil. Observe que as células são convertidas em um valor de pixel branco puro de '255' neste sistema, enquanto objetos de fundo e estranhos (não celulares) são convertidos em um valor de pixel preto puro de '0'.
   1. Diferencie as células do fundo usando uma diferença percentil do "pixel máximo relevante", o maior valor de pixels que compreende pelo menos 0,5% de uma determinada imagem.
   2. Analise e avalie os valores dos pixels para macrófagos RAW264.7. Se esses valores estiverem dentro de 4,5% do pixel máximo relevante, marque o pixel como celular.
      NOTA: Este comando pode ser emitido usando uma instrução simples se.
   3. Para imagens contendo perfis de células bulbosas, como as vistas na Figura 2, implemente um procedimento iterativo para corrigir a binarização errônea nos centros das células (denominadas 'ilhas', veja abaixo), da seguinte forma.
   4. Determine um palpite inicial para a cobertura total da célula; Para este estudo, 60% foram utilizados 60%. Observe que o número de células presentes na imagem deve depender da cobertura celular - a relação entre o número celular e a cobertura celular pode, portanto, ser determinada experimentalmente. Usando essa relação, determine as variáveis 'Alfa' e 'kappa'.
      NOTA: 'Alfa' representa um vetor 3 x 1 contendo os seguintes percentis de altura relativa: o percentil de altura em que as células foram identificadas, o percentil de altura no qual o fundo foi identificado e o percentil de altura em que as ilhas-regiões em que os valores de intensidade eram significativamente inferiores aos valores das células tipicamente residiam. 'Kappa' representa a área total coberta por células na imagem.
   5. Execute o algoritmo, que irá (i) analisar imagens usando estimativas iniciais de alfa e kappa para preencher uma parte das ilhas, e (ii) usar a contagem de células pós-análise e cobertura para recalcular kappa. Se o valor kappa estiver dentro de 10% do palpite inicial, siga para o próximo passo.
      NOTA: Para imagens contendo células RAW264.7 e NIH/3T3, o alfa foi encontrado [4.3, 5.5, 10]. Em outras palavras, uma diferença de 4,3% do pixel máximo relevante determinou o percentil de altura em que as células foram identificadas, uma diferença de 5,5% do pixel máximo relevante determinou o percentil de altura no qual o fundo foi identificado. Uma diferença de 10% do pixel máximo relevante determinou o percentil de altura em que as ilhas normalmente residiam.
3. Após a binarização da imagem, determine a área média do celular usando automaticamente o algoritmo de localização de círculo de código aberto, que executa uma transformação de Hough na imagem binarizada 12,13,14. Use o seguinte comando para obter um vetor de todos os locais centrais e raios de círculos encontrados dentro da imagem.
   '[centros, raios] = imindcircle(A, [minradius, maxradius])
   'A' neste comando é a imagem escolhida, e [minradius, maxradius] é o alcance de raios que o algoritmo tentará detectar.
   NOTA: Este procedimento para determinar a área celular média pressupõe que a morfologia das células macrófagos era circular e consistente entre as células¹⁰. A partir de dados experimentais, observa-se que os raios de macrófagos são mais comumente entre 30 e 50 pixels a 40x de ampliação. Esta gama de pixels é definida como o alcance aceitável para o algoritmo de localização de círculos. Os raios podem ser significativamente diferentes para outros tipos de células e exigiria determinação usando análise experimental.
   1. Use as saídas de raios para calcular a área média da célula, em média. Analise pelo menos 10 células para garantir a identificação precisa da área.
4. Determine o número total de células dentro da imagem usando a área celular média.
   1. Entre na matriz de imagens e conte o número total de pixels celulares. Determine a cobertura total do celular dividindo o número de pixels celulares pelo número total de pixels dentro da imagem. Determine o número total de células dentro da imagem dividindo o número de pixels celulares pela área média de uma célula.

3. Análise de imagem-cocultura utilizando o arquivo "coculture_modified.m" principalmente

NOTA: As seguintes etapas foram realizadas utilizando-se o MATLAB.

1. Use o método baseado na área para obter imagens de células que mostrássem variações relativas de altura. Saídas de imagem para cada subpresto utilizando a função 'imshow()' para cada subimagem. Copie e cole o arquivo de imagem para análise no bin e digite o nome do arquivo no comando a seguir. Pressione para iniciar o programa.
   'imread('nome de arquivo.tiff')'
   1. Analise imagens por 'abertura por reconstrução' seguidas de 'fechamento por reconstrução' usando funções de origem¹⁰ para ampliar o primeiro plano a partir do fundo. Use o primeiro comando para abertura por reconstrução e a segunda e terceira sequências para fechar por reconstrução.
      'imopen ()'
      'imerode()'
      'imreconstruct()'
2. Realizar uma análise das coculturas contendo células RAW264.7 e NIH/3T3 utilizando duas binarizações seletivas, obtidas pela exploração das diferenças de altura entre os dois tipos de células.
   1. Determine experimentalmente um parâmetro 'phi' utilizando imagens de células RAW264.7 e NIH/3T3, com phi representando a diferença de altura proporcional entre os dois tipos de células. Acho que um valor inicial de phi e iterado até que as contagens de células e a cobertura coincidam intimamente com as contagens manuais, específicas da cocultura RAW264.7 e NIH/3T3.
      NOTA: O valor do phi utilizado nestes estudos foi de 3,2. Phi é usado para filtrar seletivamente uma imagem para parecer conter apenas células RAW264.7, como visto na Figura 4C.
   2. Determine a contagem de células RAW264.7 e a cobertura celular total de forma semelhante às imagens de monocultura.
3. Analise novamente a imagem transformada em bacias hidrográficas sem o parâmetro phi, detectando macrófagos e fibroblastos. Adquira dados de fibroblasto NIH/3T3 subtraindo seletivamente pixels de células RAW264.7, obtidos usando os métodos padrão de limiarização e quantificação baseados em área descritos na etapa 2.
   1. Uma vez analisada toda a imagem, determine o número total de pixels NIH/3T3 subtraindo o número total de pixels de células do número de pixels RAW264.7. Calcule a cobertura das células NIH/3T3 e RAW264.7 dividindo-se pelo número de pixels celulares para cada linha celular pelo número total de pixels de imagem.

Resultados

A análise dos macrófagos RAW264.7 não bulbosos foi realizada em um cenário de monocultura a 25.000 células/cm². Imagens representativas foram tiradas da cultura celular e processadas no MATLAB após a conversão para uma tiff de 8 bits no ImageJ. As saídas de algoritmos ao longo do processo foram registradas e documentadas na Figura 2 para a imagem representativa. Nesta imagem, o algoritmo contava 226 células, e essa contagem de imagens foi verificada em comparação com um...

Discussão

Projetamos um procedimento geral baseado em área que contava com precisão e eficiência as células com base na altura celular, permitindo a quantitação livre de manchas de células mesmo em sistemas de cocultura. As etapas críticas para este procedimento incluíram a implementação de um sistema de intensidade relativa pelo qual as células poderiam ser diferenciadas. O uso de uma análise relativa da altura serviu a dois propósitos: a necessidade de parâmetros externos tornou-se desnecessária, uma vez que par?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Axio Observer 7 Inverted Microscope	Zeiss	1028290770
β-mercaptoethanol	Life Technologies	21985023
Cell Scrapers	CellTreat	229310
Dublecco's Modified Eagle Medium	Fisher Scientific	12430047
Dublecco's PBS	Fisher Scientific	14190144
MATLAB Software	MathWorks	2021A
NIH/3T3 Cells	ATCC	ATCC CRL - 1658
Penicillin–Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333-20ML
RAW264.7 Cells	ATCC	ATCC TIB - 71
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S6014-25G
T75 Cell Culture Flask	Corning	CLS3814-24EA