Algoritmo de análise de imagem baseado em área para quantificação de coculturas de macênfago-fibroblasto

Resumo

Apresentamos um método, que utiliza uma abordagem de análise de imagem generalizada baseada em área para identificar a contagem de células. A análise de diferentes populações celulares explorou as diferenças significativas de altura celular e estrutura entre tipos de células distintas dentro de um algoritmo adaptativo.

Resumo

A quantificação das células é necessária para uma ampla gama de estudos biológicos e bioquímicos. A análise convencional de imagens das células normalmente emprega abordagens de detecção de fluorescência, como coloração imunofluorescente ou transfecção com proteínas fluorescentes ou técnicas de detecção de borda, que muitas vezes são propensas a erros devido ao ruído e outras não-idealidades no fundo da imagem.

Projetamos um novo algoritmo que poderia contar com precisão e distinguir macrófagos e fibroblastos, células de diferentes fenótipos que muitas vezes se colocam durante a regeneração tecidual. O MATLAB foi usado para implementar o algoritmo, que diferenciava tipos de células distintas com base em diferenças de altura a partir do fundo. Um algoritmo primário foi desenvolvido usando um método baseado em área para explicar as variações no tamanho/estrutura da célula e condições de semeadura de alta densidade.

As não idealidades nas estruturas celulares foram contabilizadas com um algoritmo iterativo secundário utilizando parâmetros internos, como cobertura celular computada usando dados experimentais para um determinado tipo de célula. Finalmente, foi realizada uma análise dos ambientes de cocultura utilizando-se um algoritmo de isolamento no qual vários tipos de células foram seletivamente excluídos com base na avaliação de diferenças de altura relativas dentro da imagem. Essa abordagem foi encontrada para contar com precisão as células dentro de uma margem de erro de 5% para células monoculturadas e dentro de uma margem de erro de 10% para células coculturadas.

Introdução

O software é implementado rotineiramente durante técnicas de análise de imagens para garantir que os resultados sejam precisos, eficientes e imparcial. Para ensaios baseados em células, um problema comum é a identificação errada das células. Imagens com configurações focais e de contraste inadequadas podem levar à desfoque celular, no qual o limite de células individuais torna-se difícil de identificar¹. A presença de características de imagem ímpares, como poros, bolhas ou outros objetos indesejados, pode dificultar a contagem de procedimentos, retardando o processo de contagem e levando à identificação errada. Além disso, a contagem de célula....

Protocolo

1. Cultura celular e aquisição de imagens

1. Cultura RAW264.7 macrófagos a 37 °C e 5% DE CO₂ no Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) complementado com 10% de soro bovino fetal (FBS), 1% penicilina-estreptomicina, 1,5 g/L de sódio biato e 5 μM β-mercaptoethanol.
   1. Para imagens de monocultura, cultura RAW264.7 células a uma densidade de 25.000 células/cm² em um frasco de cultura celular de 5 mL com 1 mL de médio.
2. Cultura NIH/3T3 células a 37 °C e 5% CO₂ em DMEM suplementadas com soro bovino fetal de 10% e 1% penicilina-estreptomicina¹¹.
3. Para a cocul....

Resultados

A análise dos macrófagos RAW264.7 não bulbosos foi realizada em um cenário de monocultura a 25.000 células/cm². Imagens representativas foram tiradas da cultura celular e processadas no MATLAB após a conversão para uma tiff de 8 bits no ImageJ. As saídas de algoritmos ao longo do processo foram registradas e documentadas na Figura 2 para a imagem representativa. Nesta imagem, o algoritmo contava 226 células, e essa contagem de imagens foi verificada em comparação com um.......

Discussão

Projetamos um procedimento geral baseado em área que contava com precisão e eficiência as células com base na altura celular, permitindo a quantitação livre de manchas de células mesmo em sistemas de cocultura. As etapas críticas para este procedimento incluíram a implementação de um sistema de intensidade relativa pelo qual as células poderiam ser diferenciadas. O uso de uma análise relativa da altura serviu a dois propósitos: a necessidade de parâmetros externos tornou-se desnecessária, uma vez que par?.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Axio Observer 7 Inverted Microscope	Zeiss	1028290770
β-mercaptoethanol	Life Technologies	21985023
Cell Scrapers	CellTreat	229310
Dublecco's Modified Eagle Medium	Fisher Scientific	12430047
Dublecco's PBS	Fisher Scientific	14190144
MATLAB Software	MathWorks	2021A
NIH/3T3 Cells	ATCC	ATCC CRL - 1658
Penicillin–Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333-20ML
RAW264.7 Cells	ATCC	ATCC TIB - 71
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S6014-25G
T75 Cell Culture Flask	Corning	CLS3814-24EA