从小鼠颈动脉管腔中分离内皮细胞以进行单细胞多组学实验

摘要

我们提出了一种从暴露于稳定或扰动流动条件下的小鼠颈动脉管腔中分离内皮细胞和细胞核的方法，以进行单细胞组学实验。

摘要

动脉粥样硬化是暴露于血流紊乱（d-flow）的动脉区域的炎症性疾病。 D-flow 在转录组学和表观基因组水平上调节内皮中基因的表达，导致促动脉粥样硬化生成反应。最近，进行了单细胞RNA测序（scRNAseq）和转座酶可接近染色质测序的单细胞测定（scATACseq）研究，以使用小鼠部分颈动脉连接（PCL）模型确定单细胞分辨率下的转录组和染色质可及性变化。由于内皮细胞（ECs）仅占动脉壁总细胞群的一小部分，因此使用管腔消化方法获得富含EC的单细胞制剂。在这项研究中，小鼠接受PCL手术以诱导左颈动脉（LCA）中的 d流 ，同时使用右颈动脉（RCA）作为对照。颈动脉在PCL手术后两天或两周被解剖出来。对各颈动脉管腔进行胶原酶消化，得到富含内皮的单细胞或单核。这些单细胞和单核制备随后使用10x基因组学微流体装置进行条形码编码。然后将条形码的单细胞和单细胞核用于高通量DNA测序仪上的RNA制备，文库生成和测序。生物信息学处理后，scRNAseq和scATACseq数据集从腔内消化中鉴定出各种细胞类型，主要由EC组成。平滑肌细胞、成纤维细胞和免疫细胞也存在。这种EC富集方法有助于了解血流对内皮的影响，这在全动脉消化方法中可能很困难。富含EC的单细胞制备方法可用于在尚未研究血流对这些基因的影响的EC敲除和转基因小鼠中进行单细胞组学研究。重要的是，该技术可以适应从人类动脉外植体中分离富含EC的单细胞，以进行类似的机制研究。

引言

该实验室先前证明，诱导d-flow会导致高脂^{血症小鼠快速}而崎岖的动脉粥样硬化发展1^，2。使用部分颈动脉结扎（PCL）手术可以实现d流诱导动脉粥样硬化的新型小鼠模型³。PCL手术在结扎的左颈动脉（LCA）中诱导低和振荡的血流状况或D流。相比之下，对侧右颈动脉（RCA）继续面临稳定的层流（s流）。以前，为了了解d-flow对内皮细胞的影响，在部分结扎手术后解剖颈动脉，并用苯酚和异硫氰酸胍基裂解剂冲洗（管腔RNA / DNA冲洗法）^2，4，该裂解剂提供富含内皮的"混合体"RNA或DNA。然后将这些混合的块RNA或DNA处理用于转录组学研究或表观基因组DNA甲基组研究，分别为⁴，^5，6。这些研究有助于发现多个对血流敏感的基因和microRNA，它们在内皮生物学和动脉粥样硬化中的作用得到了广泛的研究⁴，^6，7。

然而，尽管内皮富集，这些大量的RNA / DNA研究无法区分动脉壁中每种细胞类型在 d-flow诱导的动脉粥样硬化中的特定作用。进行了富含内皮的单细胞（sc）分离以及scRNA和scATAC测序研究以克服这一限制⁸。为此，C57Bl6小鼠接受PCL手术以诱导LCA中的 d 流，同时使用 s流暴露的RCA作为对照。PCL手术后两天或两周，处死小鼠，解剖和清理颈动脉。LCA和RCA的管腔均注入胶原酶，并收集含有ECs作为重要部分的管腔胶原酶消化物和其他动脉细胞。制备单细胞悬液（scRNAseq）或单核悬液（scATACseq），并使用10x基因组学设置为每个细胞或细胞核进行唯一标识符的条形码编码。对RNA进行cDNA文库制备和测序。

scRNAseq和scATACseq数据集使用Cell Ranger单细胞软件进行处理，并通过Seurat和Signac R包^9，10进一步分析。从这些分析中为每个细胞和细胞核分配一种细胞类型，并根据标记基因和独特的基因表达模式聚类到细胞类型中。scRNAseq和scATACseq的结果表明，这些单细胞制剂富含ECs，还含有平滑肌细胞（SMC），成纤维细胞和免疫细胞。

进一步的分析表明，管腔消化中的EC群体是高度发散和可塑的（8种不同的EC簇），并且对血流有反应。最重要的是，这些结果表明， d-flow 将EC从动脉粥样硬化保护的抗炎表型重新编程为促动脉粥样硬化表型，包括促炎，内皮到间充质转化，内皮干/祖细胞转化，以及最令人惊讶的内皮到免疫细胞样转变。此外，scATACseq数据以全基因组的方式揭示了新的血流依赖性染色质可及性变化和转录因子结合位点，这构成了几个新假设的基础。下面详细介绍了制备用于小鼠颈动脉单细胞多组学研究的单个内皮细胞的方法和方案。

研究方案

下面描述的所有动物程序均已获得埃默里大学机构动物护理和使用委员会的批准。非高胆固醇血症，年龄和性别匹配的C57BL / 6小鼠用于减轻性别依赖性变异并抵消高胆固醇血症的任何并发症。

1. 颈动脉部分结扎术（PCL）手术

注意:LCA的部分颈动脉结扎术如前所述进行^并证明3。

1. 在整个过程中使用麻醉蒸发器通过吸入异氟烷（5%异氟烷在氧气中用于诱导，1.5%用于维持）麻醉小鼠。将小鼠仰卧放在三角相等温垫上，以防止手术过程中身体热量损失。
2. 涂抹眼膏以防止暴露性角膜炎，并通过没有脚趾捏伤反应来确认麻醉深度。
3. 皮下注射丁丙诺啡 0.05 mg/kg，以预防疼痛。通过应用并用倍他定和异丙醇溶液清洁三次来消毒脱毛区域。确保βdine是手术区域消毒的最后一步，从中心开始，到两侧结束。
4. 使用无菌技术，在颈部区域做一个腹侧中线切口（~1 cm），并通过钝性解剖暴露LCA分支点。
5. 用6-0丝线结扎左颈内动脉、颈外动脉和枕动脉;保持甲状腺上动脉不变。
6. 近似皮肤并用组织胶和/或缝合线闭合切口。
7. 将小鼠转移到预热的恢复笼（保持在37°C）中，并将其放在干净的毛巾上长达1小时，以避免手术后体温过低。
   注意:根据我们的经验，先发制人的单剂量丁丙诺啡（0.05mg / kg）通常足以进行术后疼痛管理。如果动物在最初 24 小时后处于困境，可以给予重复剂量的丁丙诺啡。如果正确执行，则不会与该手术相关的死亡率，并且对小鼠的术后压力最小。将小鼠送回各自的笼子并在手术后每天监测。
8. 准备灌注设置。
   1. 在静脉输液袋中使用含有 10 U/mL 肝素的 0.9% NaCl（生理盐水）。将静脉输液袋钩在离地面 244-274 厘米（8-9 英尺）处，或比解剖板高约 122-152 厘米（4-5 英尺）。将蝶针连接到盐水管的末端，然后冲洗出静脉输液管中的任何气泡。

2.处死后颈动脉分离

1. 按照机构IACUC协议通过CO₂ 吸入处死小鼠。
2. 将70%乙醇喷洒在小鼠皮肤上，并将其仰卧放在含有吸附剂纸巾的解剖板上。使用胶带或21 G针将鼠标的爪子固定在解剖板上的吸附剂毛巾上。
3. 使用一把无菌剪刀，从腹部开始，一直到胸部顶部去除小鼠的皮肤。
4. 用一把剪刀通过钝性解剖打开胸腔下方的腹壁。
5. 使用剪刀，小心地沿着横膈膜的长度做一个切口，然后继续穿过胸部两侧的肋骨，直到胸骨可以抬开。用一对镊子轻轻抬起胸骨;之后，取出胸腔以露出心脏。
6. 小心地去除胸腺和心脏上的任何结缔组织，以观察主要血管。
7. 用剪刀切断腔静脉，让血液从封闭的循环中排出。
8. 将21G蝶针通过心脏顶点连接到IV线插入左心室，并在室温下用生理盐水逆行灌注2-3分钟。通过将盐水袋保持在离地面 8-9 英尺的高度，确保保持生理盐水的恒定流速。
   注意:肺和肝脏变得苍白，表明最佳灌注。每只小鼠使用约20mL灌注缓冲液。
9. 从颈部区域去除皮肤，去除所有脂肪，肌肉和结缔组织以暴露颈动脉（图1A）。
   注意:其余过程在解剖显微镜下进行。
10. 调整视野以定位连接位点。使用10毫米微解剖剪刀，在LCA的结扎部位下方做一个小切口，以便灌注。
11. 通过左心室再次灌注1分钟，并确保LCA充分灌注并且没有任何可见的血液痕迹。
12. 使用细尖镊子和小弹簧剪刀小心地去除颈动脉周围的外阴组织，同时颈动脉附着在身体上。
    注意:在此清洁步骤中，要非常小心不要挤压或拉伸颈动脉，因为这会增加非活细胞的数量。如果操作正确，最终细胞悬液中的细胞活力通常为>93%。

3. 小鼠颈动脉中富含内皮细胞的单细胞分离

注意:下述试剂可以提前制备并储存在4°C直至使用:1x和0.1x单核裂解缓冲液，试剂如 表1所示;使用 表1中列出的试剂进行单核洗涤缓冲液;单核核缓冲液配方，试剂如 表1所示。这些缓冲液的工作储备应按照制造商的方案制备。 消化缓冲液组成:II 型胶原酶 600 U/mL 和 DNase I 60 U/mL 在含 0.5% 胎牛血清 （FBS） 的磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中。

1. 当颈动脉仍然附着时，用生理盐水溶液清洗颈动脉的外部，以冲洗掉任何血液痕迹。
2. 使用装有29G针头的胰岛素注射器，将~50μL消化缓冲液注射到左颈动脉远端的管腔中。当消化缓冲液开始充满颈动脉时，用微夹夹住颈动脉的近端（图1B）。将额外的 15-20 μL 消化缓冲液引入管腔并夹住远端以避免消化缓冲液释放。
3. 小心地从小鼠中取出颈动脉（图1B，C），并将它们放入含有温热（37°C）Hepes缓冲盐水溶液的35mm培养皿中。
   注:确保两个夹具都放置牢固。如果夹子松动，消化液可能会从管腔中泄漏出来并影响获得的细胞计数。如果发生这种情况，请使用装有29G针头的胰岛素注射器从颈动脉开口端添加额外的酶溶液，并再次固定夹子（图1D）。如果酶缓冲液再次泄漏，则很可能在植出过程中颈动脉被切断。在这种情况下，丢弃颈动脉并从研究中排除样本。反复粗略处理颈动脉会降低细胞活力和单细胞制备的质量。 注意识别并正确标记左颈动脉和右颈动脉。
4. 将外植的颈动脉在37°C下间歇摇动孵育45分钟。

4. 冲洗颈动脉

1. 完成管腔酶消化后，从35毫米培养皿中取出颈动脉和夹子。小心地取下每个夹子，注意消化缓冲液不要泄漏。
2. 用细镊子轻轻握住颈动脉的一端，放在 1.5 mL 微量离心管的顶部。用另一只手将装有100μL温消化缓冲液（37°C）的胰岛素注射器的29 G针头插入腔中（图1D）。
3. 快速将颈动脉的管腔冲洗到微量离心管中。通过将 0.3 mL FBS 加入 1.5 mL 管中来阻断酶促反应。将试管放在冰上。
   注意:冲洗包含来自管腔酶消化的细胞。添加FBS并降低温度会停止酶消化过程。如果制剂中的细胞数量高并且含有碎片或脂肪组织，强烈建议使用50或70μm细胞过滤器来过滤掉不需要的组织碎片。为了增加单细胞计数，建议冲洗多个颈动脉。在这里，为了获得至少5，000个细胞，冲洗10-12个颈动脉并汇集为一个样品。
4. 使用配备固定角转子的离心机在4°C下以500× g 离心细胞5分钟（参见 材料表）。
5. 弃去上清液并将细胞沉淀重悬于含有细胞解离试剂（参见 材料表）的消化缓冲液中，在37°C下5分钟，将所有细胞分离成单个细胞。
   注意:如果制剂中的细胞数量较少，请将离心机速度提高到2，000-3，000 × g 以离心细胞。此外，使用 0.5 mL 离心管有助于更好地观察管底部的细胞沉淀。
6. 通过将 0.15 mL FBS 加入 0.5 mL 管中来阻断酶促反应。
7. 使用配备固定角度转子的离心机在4°C下以500× g 离心单细胞悬液5分钟，如步骤4.4所示。
8. 弃去上清液并将细胞重悬于0.2 mL微量离心管中PBS中的100μL冰冷的1%牛血清白蛋白（BSA）溶液中。
   注意:使用 0.2 mL 离心管可增强管底部单细胞沉淀的可视化效果。

5. 单细胞和单核分析

1. 重悬并提交用于scRNAseq的单细胞制备。
   1. 将单细胞沉淀与 100 μL 冰冷的 1% BSA 重悬于 PBS 中的 0.2 mL 管中。
   2. 重悬细胞进行单细胞封装后，立即使用基于微流体的单细胞分区和条形码系统进行单细胞封装和条形码（参见 材料表）。
   3. 在将样品提交到基因组学核心之前，对单细胞制剂进行计数和检查;确保没有细胞聚集体。
      注意:通过将BSA量增加到2%，可以进一步最小化单个细胞的聚集。
2. 重悬并提交用于scATACseq的单细胞制备。
   1. 将细胞沉淀重悬于冰冷的1x PBS中的100μL0.04%BSA中，并在4°C下以500 ×g 离心单细胞悬液。
   2. 用冰冷的0.1x裂解缓冲液（表1）裂解单细胞悬液，并在冰上孵育5分钟。
   3. 用P-20移液管混合裂解物10次，再孵育10分钟。
   4. 向裂解的细胞中加入 500 μL 冷洗缓冲液（表 1），并使用移液管混合 5 次。
      注意:使用70μm细胞过滤器过滤细胞悬液中的任何碎片，并将其转移到2 mL管中。
   5. 将裂解物在4°C下以500× g 离心5分钟。 弃去上清液并将细胞核沉淀重悬于稀释的细胞核缓冲液（150μL）中（参见 材料 表和 表1）。使用血细胞计数器¹¹计数并检查单核制剂。
   6. 将单核样本提交到基因组学核心进行单核转位、细胞核分配、文库制备和测序。
      注意:如果初始细胞数较低，则通常会沿着细胞核观察到碎片。因此，建议从高手机数量开始。

结果

对44只小鼠进行了部分颈动脉结扎手术，并通过在部分结扎手术后一天进行超声检查来验证LCA中 d-flow 的开始。成功的部分结扎手术会导致 LCA³ 中的血流速度降低并逆转血流（血流紊乱）。颈动脉在结扎后两天或两周时被解剖出来。对各颈动脉管腔进行胶原酶消化，制备富含内皮的单细胞或单核悬浮液。从10个RCA和LCA中汇集单细胞悬液以提高细胞产量。随后对制备的细胞/细...

讨论

本文提供了从小鼠颈动脉分离单细胞制剂的详细方案。如果正确进行PCL手术，可以准确研究 d流 对内皮细胞的影响。正确识别颈总动脉的分支至关重要，例如颈外动脉、颈内动脉、枕动脉和甲状腺上动脉。通过超声检查验证流型进一步验证 了d-flow 条件的成功发作。尽管无论年龄大小都可以对小鼠进行PCL手术，但优选的年龄为10±2周。老年小鼠和高胆固醇血症背景的小鼠通常倾向于具...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins
1x PBS (Cell Culture Grade)	Corning	21040CMX12
1.5 mL Protein LoBind Microcentrifuge Tubes	Eppendorf	022-43-108-1
15 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, Sterile	Fablab	FL4022
50 mL SuperClear Centrifuge Tubes	Labcon	3191-335-028
6-0 Silk Suture Sterile	Covidien	s-1172 c2
70 µm Cell Strainer, White, Sterile, Individually Packaged	Thermo Fisher Scientic	08-771-2
Accutase solution,sterile-filtered	Sigma-Aldrich	A6964-100ML	or equivalent
ATAC Buffer (Component I of Transposition Mix)	10x Genomics	2000122
ATAC Enzyme (Component II of Transposition Mix)	10x Genomics	2000123/ 2000138
Bovine Serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906-500G
Buprenorphine	Med-Vet International	RXBUPRENOR5-V
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit	10X Genomics	1000204
Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1	10X Genomics	1000121
Chromium Next GEM Single Cell ATAC Reagent Kits v1.1	10X Genomics	1000175
Collagenase II	MP Biomedicals	2100502.5
Digitonin	Sigma-Aldrich	D141-100MG
Dissecting Forceps	Roboz Surgical Instruments Co	RS-5005
Dnase1	New England Biolabs Inc	M0303S
Centrifuge (Benchtop-Model # 5425)	Eppendorf	22620444230VR
Fetal Bovine Serum - Premium Select	R&D systems	S11550
Fixed Angle Rotor	Eppendorf	FA-45-24-11-Kit Rotor
HEPES buffered saline	Millipore Sigma	51558
Insulin syringe (3/10 mL 29 G syringe)	BD	305932
Isoflurane	Patterson vet	789 313 89
MACs Smart Strainers (30 µm)	Miltenyi Biotec	130-098-458
MACS SmartStrainers (100 µm)	Miltenyi Biotec	130-098-463
Normal Saline (0.9% sodium chloride)	Baxter International Inc	2B1323
Nuclei Buffer (20x)	10x Genomics	PN 2000153/2000207
PBS (10x), pH 7.4	Thermo Fisher Scientic	70011-044
Small scissors	Roboz Surgical Instruments Co	RS-5675
Stainless Steel Micro Clip Applying Forceps With Lock	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5480	or similar
Tissue Mend II	Webster Veteinanry	07-856-7946
Type II Collagenase	MP biomedicals	2100502.1
Deposited Data
scATACseq FastQ files	NCBI	www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233
scRNAseq FastQ files	NCBI	www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233
Software and Algorithms
Cell Ranger 3.1.0	10X Genomics	https://support.10xgenomics.com/ single-cell-gene-exp
Cicero	Pliner et al., 2018	https://cole-trapnell-lab.github.io/cicero-release/
Ggplot2 v3.2.1	Hadley Wickham	https://cran.r-project.org
Harmony	Korsunsky et al., 2019	https://github.com/immunogenomics/harmony
ImageJ	Schneider et al., 2012	https://imagej.nih.gov
Monocle 2.8.0	Qiu et al., 2017	https://github.com/cole-trapnell-lab/ monocle-release
R version 3.6.2	R Foundation	https://www.r-project.org
Seurat 3.1.3	Stuart et al., 2019	https://github.com/satijalab/seurat
Signac 0.2.5	Stuart et al., 2019	https://github.com/timoast/signac